菠菜中色素的提取.doc

1、菠菜中色素的提取菠菜中色素的提取及分離趙濤 食品科學(xué)一 實驗?zāi)康? 通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質(zhì)分離提純方法2 了解薄層色譜的基本原理，掌握薄層色譜的基本操作3 了解柱層析的基本原理，掌握柱層析的基本操作二 實驗原理菠菜的葉片中含有葉綠素（包括葉綠素 a 和葉綠素 b ）、葉黃素及胡蘿卜素等天然色素。葉綠素是綠色植物的主要色素，分子由脫鎂葉綠素母環(huán)、葉綠酸、葉綠醇、甲醇、二價鎂離子等部分構(gòu)成。高等植物中有兩種葉綠素即葉綠素a 和葉綠素 b 共存，它們的含量約 3： 1，葉綠素 a 為一藍(lán)黑色固體粉末，在乙醇溶液中為藍(lán)綠色，并有深紅色熒光，而葉綠素 b 為暗綠色固體粉末，其乙醇溶液

2、為黃綠色，并有紅色熒光。葉綠素不溶于水，易溶于有機溶劑，?？捎脴O性有機溶劑（例如丙酮、乙醇、乙酸乙酯等）從植物勻漿中提取它。葉綠素存在于植物細(xì)胞的葉綠體中，與類胡蘿卜素、類脂物質(zhì)及脂蛋白復(fù)合在一起，分布在葉綠體內(nèi)的蝶形體的片層膜上。葉綠素a 和葉綠素 b 及衍生物在600700mm（紅光）和 400500mm（藍(lán)光）有尖銳的吸收峰，可借助這一特性來鑒定它們。游離葉綠素很不穩(wěn)定，對光和熱都較敏感。胡蘿卜素是一種橙色的天然色素，屬于四萜，為一長鏈共軛多烯，有 、 、 三種異構(gòu)體，其中 異構(gòu)體最多。在植物組織中，它們可能以固態(tài)微?；蛘咭耘c蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、或者糖類復(fù)合的形式存在，特別是在有色體中存在。其

3、為典型的脂溶性色素，易溶于石油醚，、乙醚而難溶于乙醇。如遇氧化條件，易受氧化和光化學(xué)氧化形成加氧產(chǎn)物或者進(jìn)一步分解為更小的分子，在受強熱時可分解為多種揮發(fā)性小分子化合物。葉黃素是一種黃色色素，與葉綠素同存在與植物體內(nèi)，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在石油醚中溶解度較小。色素所呈現(xiàn)的顏色和在葉綠體中的含量見下表：色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能的不同，或和其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)，進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組份分開。薄層層析是一種微量、快速和簡便的色譜方法。由于各種化合物的極性不同，吸附能力不相同，在展開劑上移動，進(jìn)行不

4、同程度的解析，根據(jù)原點至斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值（f）：化合物的吸附能力與它們的極性成正比，具有較大極性的化合物吸附較強，因此值較小。在給定的條件下（吸附劑、展開劑、板層厚度等），化合物移動的距離和展開劑移動的距離之比是一定的，即R f值是化合物的物理常數(shù)，其大小只與化合物本身的結(jié)構(gòu)R f有關(guān)，因此可以根據(jù)R f值鑒別化合物。吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機物的重要方法。它是根據(jù)混合物中各組分的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（極性）來選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達(dá)到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經(jīng)過活

5、化的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑 有氧化鋁、硅膠等）。當(dāng)混合物溶液流過吸附柱時，各組分同時被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各組分按吸附劑對它們所吸附的強弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶。在洗脫過程中，柱中連續(xù)不斷地發(fā)生吸附和溶解的交替現(xiàn)象。被吸附的組分被溶解吸出來，隨著溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附出來，而繼續(xù)流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動，這樣經(jīng)過適當(dāng)時間移動后，各種組分就可以完全分開，繼續(xù)用溶劑洗脫，吸附能力最弱的組分隨溶劑首先流出，再繼續(xù)加溶劑直至各組分依次全

6、部由柱中洗出為止，分別收集各組分。三 主要試劑與儀器儀器 : 研缽 1 個、電熱套1 臺、 100mL 圓底燒瓶 1 個、 125mL 分液漏斗 1 個、直形冷凝管 1 個、層析柱1 個、 50mL 燒杯 2 個、鐵架臺1 個、 7.5cm2.5cm 載玻片4 個、滴管、錐形瓶 4 個、 500mL 大燒杯 1 個、烘箱、毛細(xì)管、直尺、層析缸、鐵架臺、玻璃棒、漏斗、紫外分光光度計試劑：中性氧化鋁、硅膠 H 、 95%乙醇、石油醚、丙酮、 0.5%CMC、無水硫鈉、石英砂、飽和的 NaCl 溶液、乙醚、脫脂棉、濾紙、丁醇四 實驗步驟1葉綠素色素的提取在研缽中放入少量新鮮的菠菜葉片,加入約 1.0

7、g石英砂適當(dāng)研磨 ,用棉花過濾，濾渣用 5mL 乙醇再提取一次，濾液置于125mL 分液漏斗中 .向分液漏斗中加入10mL 石油醚萃取，同時加入10mL 飽和 NaCl 溶液 ( 防止乳化 ) ，適當(dāng)振搖后靜置分層，棄去水層,再用蒸餾水洗滌兩次.將有機層轉(zhuǎn)入干燥的小錐形瓶中,加 2 g 無水硫酸鈉干燥 ,干燥后的液體過濾至另一錐形瓶中。2 薄層層析分離取四塊載玻片（ 7.5cm2.5cm ），洗凈后用蒸餾水淋洗，再用少量的乙醇淋洗，晾干備用。（ 1）鋪板 在小燒杯中，放置適量硅膠 H ，逐漸加入 0.5%羧甲基纖維素鈉（ CMC）水溶液 67mL，調(diào)成均勻的糊狀，其稀稠為在振動下可流動，倒在潔

8、凈的載玻片上，用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振搖、擺動，并不時轉(zhuǎn)動方向，制成薄厚均勻、表面光潔平整、無氣泡的薄層板，厚度為 0.251.0mm。鋪層后的薄板在室溫下自然晾干 0.5h 后，置于 105110的烘箱中活化 3060min。（2）點樣取活化過的硅膠薄板，分別在一端1cm 處用鉛筆輕輕畫一橫線作為起始線，另一端距約1cm 處也畫一橫線作為終止線。用內(nèi)徑約1mm的毛細(xì)管插溶劑前沿至原點中心的距離 R f溶質(zhì)的最高濃度中心至原點中心的距離入樣品溶液中，在一塊板上的起點線上點兩個點。樣點間距11.5cm。樣點直徑不超過 2mm。點樣完畢使斑點干燥即可展層。（3）展層薄層色譜可在層析缸中進(jìn)

9、行，在12 個層析缸中加入以下12 種展開劑：10mL 石油醚； 10mL 二氯甲烷； 10mL 丙酮； 10mL 四氯化碳； 10mL 石油醚丙酮乙醚（3： 1： 1）； 10mL 丙酮乙醚（ 3： 2）； 10mL 二氯甲烷四氯化碳（ 1：1）； 10mL 乙醚四氯化碳（ 1： 1）； 10mL 石油醚四氯化碳（1：1 ）； 10mL 丙酮四氯化碳（ 1： 1）； 10mL 乙醚； 10mL 乙醚丙酮四氯化碳（3：2：2）。將薄板點樣端向下放入缸內(nèi)，使薄層板的底邊平行接觸展開劑，蓋好缸蓋，進(jìn)行展開，當(dāng)展開劑到達(dá)前沿線時，取出薄板層，置通風(fēng)處晾干。通過對其薄層色譜圖的觀察，用石油醚醚和石油醚

10、- 丙酮（ 1:1 ）作展開劑各點的分離比較徹底，而無拖尾現(xiàn)象。根據(jù)公式：溶劑前沿至原點中心的距離計算得：（1） 乙醚做層析劑各個點的R f值分別為：R f1=0.672 R f2=0.828 R f3=0.892R f4=0.953（2） 乙醚丙酮四氯化碳（3：2：2）做層析劑各個點的Rf 值分別為：R f1=0.684 R f2=0.793R f3=0.891 R f4=0.9383 柱色譜法分離植物色素（ 1）裝柱 取一洗凈的、干燥的層析柱，垂直固定在鐵架臺上，關(guān)閉柱下面的活塞，在柱內(nèi)加入約 3/4 高的石油醚。另取少量脫脂棉，經(jīng)石油醚洗滌后放入柱底（要趕凈氣泡） , 用長玻璃棒壓平，再

11、蓋上一片比柱內(nèi)徑略小的圓形濾紙。稱取一定量的氧化鋁，通過一干燥的漏斗，連續(xù)而緩慢的加入柱中。同時將柱下端的活塞打開，使石油醚以每秒1滴的速度流出，并用木棒輕輕敲打柱身各部，使氧化鋁裝填的均勻而緊密，最后在氧化鋁上面再加 1cm 高的無水硫酸鈉。繼續(xù)放出石油醚，直到距柱表面僅1-2mm 高，無論如何不能使液面低于柱表面。（ 2）上樣 取處理好的提取液 2cm 3, 用長滴管沿柱壁小心的柱頂部。加完后，稍稍打開活塞，使液面下降至柱表面約 1mm處，關(guān)閉活塞，用少量石油醚沖洗柱壁，使液面下降至原高度。重復(fù)兩次該操作，使色素全部進(jìn)入柱內(nèi)。（ 3）洗脫 在柱頂裝一滴液漏斗（或分液漏斗），待色素全部進(jìn)入柱

12、體后, 在柱頂小心加 1.5 cm高度的洗脫劑石油醚 , 然后在層析柱上面裝一滴液漏斗, 內(nèi)裝 15 mL 洗脫劑 ,打開上下兩個活塞 , 讓洗脫劑逐滴放出 , 層析即開始進(jìn)行 , 用錐型瓶收集 .當(dāng)?shù)谝粋€有色圈( 橙黃色 )將滴出時 , 取另一錐形瓶收集 , 它就是胡蘿卜素 , 約用洗脫劑10 mL.用1:1( 體積比 )石油醚丙酮作洗脫劑 , 綠色圈下端呈黃色 , 再加 10mL 洗脫劑洗脫 ,顏色分層更明顯 ,但速度很慢 , 總共用去洗脫劑約 10mL. 分出第二個黃色帶 , 它是葉黃素 . 再用乙醇作洗脫劑 , 洗脫葉綠素 ,速度很快 , 用洗脫劑約 10mL. 將各組分分別收集到試管

13、中，用黑紙包好，低溫保存。 R f溶質(zhì)的最高濃度中心至原點中心的距離4 紫外光譜測定（ 1）胡蘿卜素的紫外光譜測定 .用石油醚稀釋所得的橙黃色試樣 , 加到 1 cm 的比色皿中 , 以石油醚作空白試劑 , 測得 max 為 476 nm,448nm, 其吸光度分別為 0.495,0.579.（2） 葉綠素的紫外光譜測定用石油醚稀釋所得的綠色試樣,加到1 cm的比色皿中,以石油醚作空白試劑,測得max 為 660 nm,426nm, 其吸光度分別為0.238,0.344.五 思考題1. 薄層的展開為什么要在密閉容器中？答：展層劑易揮發(fā)，所以在密閉容器中防止展層劑揮發(fā)。2. 點樣時如樣品斑點過大有什么壞處？若將樣品斑點浸入展開劑中會有什么后果？答：因溶液太稀或樣點太小 , 可重復(fù)點樣 . 但應(yīng)在每次點樣的溶劑揮發(fā)后 , 方可重點 , 以防樣點被溶解掉 . 點樣過大易造成拖尾 , 擴散等現(xiàn)