10細(xì)菌和病毒的遺傳-轉(zhuǎn)化接合

1、第十章第十章 細(xì)菌和病毒的遺傳分析細(xì)菌和病毒的遺傳分析 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)菌和病毒的細(xì)菌和病毒的特特點(diǎn)點(diǎn) 第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體的遺傳分析噬菌體的遺傳分析 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)菌的遺傳分析細(xì)菌的遺傳分析 本章要求本章要求 思考題思考題 細(xì)菌的遺傳重組 一、一、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 二、二、接合接合 三、性導(dǎo)三、性導(dǎo) 四、轉(zhuǎn)導(dǎo)四、轉(zhuǎn)導(dǎo) 一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞 的DNA與另一 個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的 DNADNA的交換重的交換重 組組可以通過4 種方式進(jìn)行 P213 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)菌的遺傳分析細(xì)菌的遺傳分析 一、一、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation) n概念：概念：某些細(xì)菌某些細(xì)菌( (或其他生物或其他生物) )能通過其細(xì)胞膜能

2、通過其細(xì)胞膜攝攝 取周圍供體取周圍供體(donor)(donor)的染色體片段的染色體片段，并將此外源，并將此外源 DNADNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。片段通過重組整合到自己染色體組的過程。 n只有當(dāng)整合的只有當(dāng)整合的DNADNA片段片段產(chǎn)生新的表現(xiàn)型產(chǎn)生新的表現(xiàn)型時(shí)，才能測時(shí)，才能測 知知轉(zhuǎn)化的發(fā)生。轉(zhuǎn)化的發(fā)生。轉(zhuǎn)化中接受供體遺傳物質(zhì)的稱為轉(zhuǎn)化中接受供體遺傳物質(zhì)的稱為 受體受體(receptor) (receptor) 。 P213 (一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) (二)、轉(zhuǎn)化過程 (三)、轉(zhuǎn)化在遺傳分析中的應(yīng)用 (一一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1. 1. 基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識 莢膜

3、菌落 毒性類型 光滑型S 發(fā)達(dá) 光滑有I, II, III 粗糙型R 無粗糙無I, II n野生型肺炎雙球菌的菌落野生型肺炎雙球菌的菌落 n一種突變型為一種突變型為粗糙型粗糙型 n兩者根本差異在于莢膜形成；兩者根本差異在于莢膜形成； n莢膜的主要成分是多糖，莢膜的主要成分是多糖， 具特殊的抗原性；具特殊的抗原性； n不同抗原型是遺傳的、穩(wěn)不同抗原型是遺傳的、穩(wěn) 定的，一般情況下不發(fā)生定的，一般情況下不發(fā)生 互變?；プ?。 2. Griffith2. Griffith轉(zhuǎn)化研究轉(zhuǎn)化研究 P213 Griffith對其試驗(yàn)結(jié)論及發(fā)展對其試驗(yàn)結(jié)論及發(fā)展 n根據(jù)上述研究結(jié)果Griffith認(rèn)為： (有毒)

4、死細(xì)菌中的某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到(無毒)活細(xì)菌中，并使 之具有毒性，導(dǎo)致小家鼠死亡。 他將這種細(xì)菌遺傳類型的轉(zhuǎn)變稱為轉(zhuǎn)化，并將引起轉(zhuǎn)化的 物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子(tranforming principle)。 n以后一些研究者重復(fù)上述試驗(yàn)，并且加入了體外培養(yǎng)試 驗(yàn)，即：將加熱殺死的SIII細(xì)菌與無毒RII細(xì)菌混合培養(yǎng)， 然后注入小家鼠體內(nèi)，同樣導(dǎo)致家鼠死亡。表明： 細(xì)菌在培養(yǎng)條件下也能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳類型間的定向轉(zhuǎn)化。 3.3.阿維利阿維利(Avery)(Avery)等的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(1944)(1944) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 來源于加熱 殺死的SIII 細(xì)菌，并使 RII細(xì)菌轉(zhuǎn)化 成為SIII型 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 因

5、子是DNA。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 n 轉(zhuǎn)化定義：某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收 來自另一基因型的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā) 生變化的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。 n Avery等人的實(shí)驗(yàn)也表明：決定細(xì)菌遺傳類型的物 質(zhì)是DNA，即證明了DNA就是遺傳物質(zhì)。（p36） 由于他們采用的由于他們采用的實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)時(shí)不被人們廣泛接受，實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)時(shí)不被人們廣泛接受， 而且得出的結(jié)論而且得出的結(jié)論與當(dāng)時(shí)人們的傳統(tǒng)觀念與當(dāng)時(shí)人們的傳統(tǒng)觀念( (認(rèn)為蛋白認(rèn)為蛋白 質(zhì)是遺傳物質(zhì)質(zhì)是遺傳物質(zhì)) )不符合，而不符合，而長期沒有得到人們的承長期沒有得到人們的承 認(rèn)。認(rèn)。 P213 細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程 v（一）轉(zhuǎn)化的過程（一）轉(zhuǎn)化的

6、過程 非感受態(tài)細(xì)胞非感受態(tài)細(xì)胞 外源外源DNA被洗掉了被洗掉了 轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 外源外源DNA仍與細(xì)胞結(jié)合仍與細(xì)胞結(jié)合 整合整合 吸收吸收 吸附 洗滌 兩種核酸酶：兩種核酸酶： 切為約切為約14kb14kb的片段的片段 使外源使外源DNADNA片段變?yōu)閱捂溒巫優(yōu)閱捂?(二二)、轉(zhuǎn)化過程、轉(zhuǎn)化過程P214 (二二)、轉(zhuǎn)化過程、轉(zhuǎn)化過程 1. 感受態(tài)與感受態(tài)因子： 感受態(tài)指細(xì)菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化 的生理狀態(tài)。 感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)(感受態(tài)因子)影響，感受態(tài)因 子可以在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從感受態(tài)細(xì)菌中傳遞到非感 受態(tài)細(xì)菌中，可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。 一般認(rèn)

7、為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌對數(shù)生長后期，并且某些處 理過程可以誘導(dǎo)或加強(qiáng)感受態(tài)，以大腸桿菌為例，用 Ca2+(CaCl2)處理對數(shù)生長后期的大腸桿菌可以增強(qiáng)其感 受能力。 P214 轉(zhuǎn)化過程 2.供體DNA與受體細(xì)胞結(jié)合(binding)： 結(jié)合發(fā)生在受體細(xì)胞特定部位； 供體DNA片段為雙鏈； 結(jié)合過程是一個(gè)可逆過程。 3.DNA的穿入和攝取： 當(dāng)細(xì)菌結(jié)合點(diǎn)飽和之后，細(xì)菌開始攝取外源DNA； 往往只有一條DNA單鏈進(jìn)入細(xì)胞，另一條鏈在膜上降解。 4.聯(lián)會(synapsis)與外源DNA片段整合(integration)： 整合指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對應(yīng)位點(diǎn)的置換，穩(wěn)定 摻入到受體DNA中的過程

8、，實(shí)際就是遺傳重組的過程。 研究整合的分子機(jī)制也就是研究遺傳重組的分子機(jī)制。 P214 轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程 P213 (三三)、轉(zhuǎn)化在遺傳分析中的應(yīng)用 n共轉(zhuǎn)化 供體一條DNA片段上的兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象稱為。 共轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制共轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制 n利用共同轉(zhuǎn)化繪制細(xì)菌連鎖遺傳圖譜的基本原理： 相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的概率與兩者的距離成正向關(guān)系 基因間距離越近，發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越 低。 因此可能通過測定兩基因共同轉(zhuǎn)化的頻率來指示基因間 的相對距離。 轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜 v應(yīng)用：應(yīng)用： 兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化的效率（連鎖或不連鎖）兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化的效率（連鎖或不連鎖） 基因定

9、位（遺傳作圖）（枯草桿菌）基因定位（遺傳作圖）（枯草桿菌） P215 v雜交實(shí)驗(yàn)：雜交實(shí)驗(yàn)：trp2+his2+tyr1+ trp2- his2-tyr1- （黎德伯格等）（黎德伯格等） v結(jié)果結(jié)果(轉(zhuǎn)化子類型轉(zhuǎn)化子類型): 基因座位基因座位 trp2 + - - - + + + his2 + + - + - - + tyr1 + + + - - + - 數(shù)目數(shù)目 11940 3660 685 418 2600 107 1180 3660 p215 trp2 34 his2 13 tyr1 表表10-5 18 二、接合二、接合 (conjugation) (一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) (二)、

10、F因子及其在雜交中的行為 (三)、中斷雜交試驗(yàn)作圖 概念：在原核生物中，接合是指遺傳物質(zhì)從 供體“雄性”轉(zhuǎn)移到受體“雌性”的過程。 P215 重點(diǎn)：重點(diǎn)：接合的概念與基本原理、掌握接合的概念與基本原理、掌握F F- -、F F+ +、HfrHfr 菌株的概念、區(qū)別和用途；中斷雜交試驗(yàn)及重組菌株的概念、區(qū)別和用途；中斷雜交試驗(yàn)及重組 作圖。作圖。 ( (一一) )、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) 材料：材料：大腸桿菌大腸桿菌(Escherichia coli) K K12 12菌株的兩個(gè)營養(yǎng) 菌株的兩個(gè)營養(yǎng) 缺陷型品系：缺陷型品系： A甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷

11、型和生物素缺陷型bio-； B蘇氨酸缺陷型蘇氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型和亮氨酸缺陷型leu-。 方法：方法： 將將A、B兩菌株混和，在基本培養(yǎng)基兩菌株混和，在基本培養(yǎng)基(固體固體)上涂布培養(yǎng)。上涂布培養(yǎng)。 結(jié)果：結(jié)果： 平板上長出原養(yǎng)型菌落平板上長出原養(yǎng)型菌落(+)。 P215 19461946年，年，黎德伯格和塔特姆的大腸桿菌雜交試驗(yàn)：黎德伯格和塔特姆的大腸桿菌雜交試驗(yàn)： 1946年年 黎德伯格和塔特姆接合試驗(yàn)黎德伯格和塔特姆接合試驗(yàn) 原養(yǎng)型菌落頻率原養(yǎng)型菌落頻率10-7 幾種可能解釋及其分析幾種可能解釋及其分析 n 對上述試驗(yàn)結(jié)果原養(yǎng)型菌落可能產(chǎn)生于： v親本細(xì)菌A或B發(fā)生了回復(fù)突變

12、； v兩品系細(xì)胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料互養(yǎng)作用； v兩品系間交換DNA； v發(fā)生細(xì)胞融合，形成了異核體或雜合二倍體。 P216 n 結(jié)論：這些解釋均不成立。 回復(fù)突變？回復(fù)突變？ nLederbery和Tatum利用的雙營養(yǎng)缺陷型菌株 進(jìn)行試驗(yàn)，已基本排除A或B品系發(fā)生回復(fù)突 變產(chǎn)生原養(yǎng)型細(xì)菌的可能。 單基因回復(fù)突變的頻率約為10-6； 雙基因回復(fù)突變的頻率則為10-12，頻率很低。 但試驗(yàn)中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的頻率非常高， 因此基本可以排除回復(fù)突變的可能。 互養(yǎng)作用？互養(yǎng)作用？ n 試驗(yàn)材料： A品系：A-B+ T1S(met-bio-thr+leu+T1S)； B品系：A+B- T1R(met

13、+bio+thr-leu-T1R)。 n 試驗(yàn)方法： 將A、B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面； 短時(shí)間后噴T1殺死A品系，使其不能持續(xù)產(chǎn)生thr與leu 供B品系持續(xù)生長。 n 結(jié)果與結(jié)論： 仍然出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。 從而表明互養(yǎng)并非原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)的原因，而可能發(fā) 生了遺傳重組。 交換交換DNA？ nLederberg和Tatum曾把品系A(chǔ)的 培養(yǎng)液經(jīng)加熱滅菌，加入到B品 系的培養(yǎng)物中，未得到原養(yǎng)型 菌落；表明原養(yǎng)型菌落可能不 是由轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。 n戴維斯(Dawis 1950)U型管試驗(yàn)； n實(shí)驗(yàn)結(jié)論：細(xì)胞直接接觸是原 養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)生的必要條件。 結(jié)果沒有得到原養(yǎng)型細(xì)菌； 異核體和雜合二倍體？異核體

14、和雜合二倍體？ 若細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生融合，產(chǎn)生異核體或雙雜合二倍體。這兩種 情況類似于二倍體生物的雜合體,將產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落。 異核體：指由于細(xì)胞融合而在細(xì)胞內(nèi)含有遺傳組成 不同的兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核。 雙雜合二倍體：是指異核體進(jìn)一步發(fā)生核融合，形 成二倍體細(xì)胞核，核內(nèi)含有兩種遺傳物質(zhì)。 細(xì)菌為單倍配子體生物，異核體和二倍體只能暫存。 培養(yǎng)繁殖過程中必將發(fā)生分離，產(chǎn)生各種缺陷型菌落， 對試驗(yàn)中得到的原養(yǎng)型菌落后代研究表明，后代沒有 出現(xiàn)預(yù)期的性狀分離現(xiàn)象。 接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) n 經(jīng)過上述分析可認(rèn)為：經(jīng)過上述分析可認(rèn)為： 在在Lederberg和和Tatum的試驗(yàn)中，發(fā)生了一種不同于

15、的試驗(yàn)中，發(fā)生了一種不同于 轉(zhuǎn)化的遺傳重組方式，稱之為接合。轉(zhuǎn)化的遺傳重組方式，稱之為接合。 n Hayes(1952)研究表明：研究表明： 大腸桿菌兩種不同菌株大腸桿菌兩種不同菌株(品系品系)接合過程中遺傳物質(zhì)的接合過程中遺傳物質(zhì)的 轉(zhuǎn)移是轉(zhuǎn)移是單向的；單向的； P217 大腸桿菌存在兩種類型品系：大腸桿菌存在兩種類型品系：雌性與雄性雌性與雄性分別作為接分別作為接 合過程中遺傳物質(zhì)的合過程中遺傳物質(zhì)的供體與受體。供體與受體。 n 接合接合(conjugation)： 遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體的重組過程。從供體轉(zhuǎn)移到受體的重組過程。 1. F因子： n Hayes等深入研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿

16、菌在接合中作供 體的能力受細(xì)胞內(nèi)一種致育因子（ F因子-fertility factor；性因子-sex factor）控制。 ( (二二) )、F F因子及其在雜交中的行為因子及其在雜交中的行為 P217 n F因子的化學(xué)本質(zhì)是DNA，可以自主狀態(tài)存在于 胞質(zhì)中或整合到細(xì)菌的染色體上，又稱F質(zhì)粒。 ( (二二) )、F F因子及其在雜交中的行為因子及其在雜交中的行為 P217 n F因子可以在細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移并傳遞遺傳物質(zhì)。 圖10-14 nF因子結(jié)構(gòu)： 原點(diǎn)（origin） 致育基因（fertility gene） 配對區(qū)（pairing region） Hfr菌株重組頻率 比 F+ 高

17、500多倍 圖圖10-15 大腸桿菌大腸桿菌F因子的三種狀態(tài)因子的三種狀態(tài) 供體菌供體菌(雄性雄性)受體菌受體菌(雌性雌性)高頻重組高頻重組菌株菌株 具有F因子的菌株可作為供體， F因子中有控制F性傘毛(F pillus)形成的基因。 F性傘毛是由供體細(xì)胞表面伸 出的一種長附屬物，與受體細(xì) 胞接合，就成為兩個(gè)細(xì)胞之間 原生質(zhì)的通道，叫接合管 (conjugation tube) 。 接合現(xiàn)象接合現(xiàn)象 P217 圖圖10-1610-16 F因子及其在雜交中的行為因子及其在雜交中的行為 F因子在宿主染色體上有許多特定的插入位點(diǎn)和方向， 整合頻率為每代10-510-7。 性傘毛形成結(jié)合橋/管，產(chǎn)生核

18、酸內(nèi)切酶，該酶在oriT 轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)處一條單鏈上切開一個(gè)口，供體DNA從5末 端開始向受體轉(zhuǎn)移。 P218-220 接合過程： F 和 F 的雜交 細(xì)菌間接觸 接合管形成 單鏈斷裂單鏈DNA從供體 向受體轉(zhuǎn)移 環(huán)化環(huán)化（F+F-）或DNA雙鏈 的形成（部分二倍體） （Hfr Hfr F F- -） 重組交換（奇偶次交換）。 接合過程： F 和 F 的雜交 F因子的特點(diǎn) F細(xì)菌可以把F因子傳給后代。 F細(xì)菌經(jīng)吖啶橙處理F因子丟失，丟失后不再出現(xiàn)。 F可以和F雜交，而不能和F雜交。 F和F雜交后代皆為F，而且可以以107頻率獲得 重組體后代。 Hfr 和 F 雜交 v 僅有一部分F因子（近原點(diǎn) 處

19、）被轉(zhuǎn)移； v 受體獲得完整的F因子-這 種情況頻率非常低。 v 高頻重組：細(xì)菌重組子頻 率為104。 P219 接合過程： Hfr 和 F 雜交 v細(xì)菌重組特點(diǎn)：細(xì)菌重組特點(diǎn)： 只有偶數(shù)次交換才 能產(chǎn)生平衡的重組 子。 相反的重組子不出 現(xiàn)，所以在選擇性 培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一 種重組子。 部分二倍體部分二倍體/部分合子部分合子 圖圖10-1810-18細(xì)菌部分二倍體的形成及單交換和雙交換的結(jié)果細(xì)菌部分二倍體的形成及單交換和雙交換的結(jié)果 知識要點(diǎn)： p219 奇偶次交換 (三三)、中斷雜交試驗(yàn)作圖、中斷雜交試驗(yàn)作圖 n 雅各布(Jacob，F(xiàn))和沃爾曼 (Wollman，E.) 著名的 中斷雜交試

20、驗(yàn)(interrupted mating experiment)。 n 試驗(yàn)材料： Hfr: thr+ leu+ aziS tonS lac+ gal+ strs F: thr leu aziR tonR lac gal- strR P231 n thrthr、leuleu、laclac、galgal分別代表分別代表蘇氨酸、亮氨酸、乳糖蘇氨酸、亮氨酸、乳糖 和半乳糖和半乳糖，+ +代表原養(yǎng)型或發(fā)酵型，代表原養(yǎng)型或發(fā)酵型，代表營養(yǎng)缺陷型代表營養(yǎng)缺陷型 或不發(fā)酵型；或不發(fā)酵型；aziazi和和tonAtonA分別代表分別代表疊氮化納和疊氮化納和T T1 1噬菌體；噬菌體； StrStr表示表示鏈霉

21、素，鏈霉素，r r代表抗性，代表抗性，s s代表敏感。代表敏感。 v 理解細(xì)菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性和意義； v 掌握轉(zhuǎn)化、接合、性導(dǎo)與轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念與基本原理； v 掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、區(qū)別和用 途； v 區(qū)別F因子、F因子的異同； v 了解溫和性噬菌體、烈性噬菌體的生活周期； v 掌握原噬菌體、溶源性細(xì)菌的概念； v 了解細(xì)菌和病毒遺傳作圖的原理和基本過程。 本章要求 W.Hayes關(guān)于E.coli K12菌株A、B的實(shí)驗(yàn)（1952） 鏈霉素處理A菌 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間 洗滌離心 B菌 重組體未減少 基本培養(yǎng)基 鏈霉素處理B菌 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間 洗滌離心 A菌 無重組體產(chǎn)生 基本培養(yǎng)基 結(jié)論：細(xì)菌接合過程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向