分子生物學實驗

1、分 子 生 物 學 實 驗河南農業(yè)大學生理生化教研室實驗操作基本要求實驗操作基本要求認真預習實驗指導；認真預習實驗指導；按照操作規(guī)程使用儀器設備按照操作規(guī)程使用儀器設備, 注意個人以及注意個人以及公共設施安全；公共設施安全；節(jié)約實驗試劑及材料；節(jié)約實驗試劑及材料；實驗完畢后，將實驗器皿清洗干凈，并清理實驗完畢后，將實驗器皿清洗干凈，并清理實驗臺面；實驗臺面；按時、按質、按量完成實驗工作，不遲到，按時、按質、按量完成實驗工作，不遲到，不早退；不早退；實事求是、認真而及時地寫出實驗報告。實事求是、認真而及時地寫出實驗報告。質粒（plasmid）通常指細菌中獨立于染色體外，能自主復制的遺傳因子，它能

2、夠穩(wěn)定地遺傳某些性狀。天然的質粒都是環(huán)狀雙鏈DNA，大小從5kb到400kb不等。質粒按照其穩(wěn)定拷貝數(shù)的多少可分為嚴謹型和松弛型，嚴謹型質粒在每個細菌細胞中有15拷貝，松弛型質粒在每個細菌細胞中可達10200個，甚至更多拷貝。相關背景 抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene, Kanamycine resistance gene)resistan

3、ce gene) 啟始復制子（啟始復制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)； 多克隆位點多克隆位點(MSC, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；質粒的結構：質粒的結構：質粒中的多克隆位點細菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于質粒大量提取。SDSSDS是一種陰離子表面活性劑，它既能是一種陰離子表面活性劑，它既能使

4、細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性，使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性，所以所以SDSSDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質粒壁的破裂，從而使質粒DNADNA以及基因組以及基因組DNADNA從從細胞中同時釋放出來。細胞中同時釋放出來。*溶液溶液I： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。*溶液溶液20.2mol/L-NaOH, 1%SDS*溶液溶液3乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2O*

5、飽和酚飽和酚(pH8.0 Tris-HCl飽和飽和)*氯仿氯仿*3M乙酸鈉溶液乙酸鈉溶液(pH5.2)* TE緩沖液緩沖液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇與乙醇與70乙醇乙醇培養(yǎng)細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種到培養(yǎng)細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基，含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)培養(yǎng)1216小時小時;取液體培養(yǎng)液取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于于Eppendorf管中，管中，10000r/min離心離心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100 l溶液溶液I，充分混勻，充分混勻

6、;置冰上置冰上;加入加入200 l新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（溶液（溶液II ），加蓋顛倒），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上次使之混勻，冰上放置放置2-3min;加入加入150 l乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(溶液溶液III)，加蓋后顛倒，加蓋后顛倒6-7次混勻，次混勻，冰上放置5min;用臺式高速離心機，用臺式高速離心機，12000r/min離心離心10min，上清移入另一干凈離心管，并加上清移入另一干凈離心管，并加3ul RNaseA, 37C保溫保溫45min;上清中加入等體積的酚上清中加入等體積的酚/氯仿抽提一次氯仿抽提一次,等體積等體積氯仿抽提一次氯仿抽提一次;每次

7、均要振蕩每次均要振蕩離心離心(10000rpm離心離心1min) 吸取上清到新的離心管中吸取上清到新的離心管中;上清中加入上清中加入1/10 體積體積3M乙酸鈉溶液乙酸鈉溶液(pH5.2) ,和和2.2倍體積的無水乙醇倍體積的無水乙醇,混勻后混勻后-20保存。保存。8. 12000rpm 離心15分鐘，棄去上清，沉淀加入1ml 75乙醇洗滌， 12000rpm 離心2分鐘，徹底棄去上清，烘干。9. 沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 電泳檢查實驗得到的質粒溶液，用電泳法進行檢測，下圖為提取的質粒電泳照片，所得結果比較好返回目錄返回目錄多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應(Polymerase C

8、hain Reaction, PCR )：是一種對特定的：是一種對特定的DNA片段在片段在體外進行快速擴增的方法。體外進行快速擴增的方法。1985年年 Kary Mullis及同事創(chuàng)立。隨后借及同事創(chuàng)立。隨后借助于熱穩(wěn)定性助于熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，使聚合酶的發(fā)現(xiàn)，使PCR自動化成為可能；自動化成為可能；1987年年Kary Mullis等完成了等完成了自動化操作裝置，使自動化操作裝置，使PCR技術進行實用階段。技術進行實用階段。1993年度，年度，Kary Mullis因發(fā)明了因發(fā)明了“聚合酶鏈式聚合酶鏈式反應反應”而獲得諾貝爾化學獎。而獲得諾貝爾化學獎。相關基礎知識相關基礎知識

9、類似于類似于DNA的變性和復性過程，即在高溫的變性和復性過程，即在高溫（93-95）下，待擴增的靶）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性雙鏈受熱變性成為兩條單鏈成為兩條單鏈DNA模板；模板；而后在低溫（而后在低溫（3765）情況下，兩條人）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結模板結合，形成部分雙鏈；合，形成部分雙鏈；在在Taq酶的最適溫度（酶的最適溫度（72）下，以引物）下，以引物3端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成方向延伸，合成DNA新鏈。新鏈。PCR 的特點及應用：的特點及

10、應用：PCR操作簡便、省時、靈敏度高、對原始材料的質和操作簡便、省時、靈敏度高、對原始材料的質和量要求低。因此，廣泛應用于許多領域。量要求低。因此，廣泛應用于許多領域?；蚩寺〖岸俊U增特異性片段用于探針、體外基因克隆及定量、擴增特異性片段用于探針、體外獲得突變體、提供大量獲得突變體、提供大量DNA用于測序等；用于測序等；遺傳病的產前診斷；遺傳病的產前診斷；致病病原體的檢測；致病病原體的檢測；癌基因的檢測和診斷；癌基因的檢測和診斷；DNA指紋、個體識別、親子關系鑒別及法醫(yī)物證；指紋、個體識別、親子關系鑒別及法醫(yī)物證；動、植物檢疫；動、植物檢疫；在轉基因動植物中檢查植入基因的存在。在轉基因動植

11、物中檢查植入基因的存在。PCR PCR 反應系統(tǒng)的組成反應系統(tǒng)的組成PCRPCR反應系統(tǒng)的組成主要包括：反應系統(tǒng)的組成主要包括： 引物、寡核苷酸引物、寡核苷酸 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 模板模板DNADNA、緩沖液、緩沖液引物：引物：要擴增模板要擴增模板DNADNA，首先要設計兩條寡核，首先要設計兩條寡核苷酸引物苷酸引物, ,實際上就是兩段與待擴增靶實際上就是兩段與待擴增靶DNADNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定間距離決定擴增片段的長度擴增片段的長度，兩引物的，兩引物的55端決定擴增產物的兩個端決定擴增產物的兩個55末端位置。末端位置。

12、由于引物是決定由于引物是決定PCRPCR擴增片段長度、位擴增片段長度、位置和結果的關鍵，置和結果的關鍵， 因此，引物設計也因此，引物設計也就更為重要就更為重要。PrimerIPrimerIIAmplified target fragment引物的設計：引物的設計：長度一般最低不少于長度一般最低不少于1616個核苷酸，最佳長度為個核苷酸，最佳長度為20202424個核苷酸。有時可在個核苷酸。有時可在55端添加不與模板互端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點等，以完成基因克補的序列，如限制性酶切位點等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位點的隆和其它特殊需要，但要在酶切位點的55端加上端

13、加上額外的核苷酸，以確保附加的酶切位點有效。額外的核苷酸，以確保附加的酶切位點有效。兩個引物之間不應發(fā)生互補，特別是在引物兩個引物之間不應發(fā)生互補，特別是在引物33端，端，即使無法避免，其即使無法避免，其33端互補堿基也不應大于端互補堿基也不應大于2 2個個堿基，否則易生成堿基，否則易生成“引物二聚體引物二聚體”或或“引物二倍引物二倍體體”（Primer dimerPrimer dimer）。）。(G+C(G+C）% %含量引物的組成應均勻，兩個引物中含量引物的組成應均勻，兩個引物中（G+CG+C）% %含量應盡量相似。含量應盡量相似。1.1. 引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其引物內

14、部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是發(fā)夾結構（是發(fā)夾結構（hairpin structureshairpin structures）。）。引物在引物在PCRPCR反應中的濃度反應中的濃度一般在一般在0.10.11M1M之間。濃度過高之間。濃度過高易形成引物二聚體且產生非特異性產物。易形成引物二聚體且產生非特異性產物。一般來說用低濃度引物經濟、特異，但一般來說用低濃度引物經濟、特異，但濃度過低，不足以完成濃度過低，不足以完成3030個循環(huán)的擴增個循環(huán)的擴增反應，則會降低反應，則會降低PCRPCR的產率。的產率。引物退火溫度引物退火溫度決定決定PCRPCR特異性與產量；溫度高特異性強，特異性與產

15、量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNADNA擴增效擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。板錯配，非特異性產物增加。一般可根據引物的（一般可根據引物的（G+CG+C）% %含量進行推測，含量進行推測，一般實驗中退火溫度可按公式進行粗略計算：一般實驗中退火溫度可按公式進行粗略計算：Ta = Tm - Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -55= 4(G+C) + 2(A+T) -5其中其中A A，T T，G G，C C分別表示相應堿基的個數(shù)。在典分

16、別表示相應堿基的個數(shù)。在典型的引物濃度時（如型的引物濃度時（如0.2mol/L0.2mol/L）, ,退火反應數(shù)退火反應數(shù)秒即可完成。秒即可完成。引物延伸溫度引物延伸溫度溫度的選擇取決于溫度的選擇取決于DNADNA聚合酶的最適溫度。聚合酶的最適溫度。一般取一般取70707575，在，在7272時酶催化核苷酸的標時酶催化核苷酸的標準速率可達準速率可達3535100100個核苷酸個核苷酸/ /秒。秒。對于對于1kb1kb以上的以上的DNADNA片段，可根據片段長片段，可根據片段長度將延伸時間控制在度將延伸時間控制在1 17min7min。寡核苷酸（寡核苷酸（dNTPdNTP）在在PCRPCR反體系

17、中反體系中,dNTP,dNTP終濃度高于終濃度高于50mM50mM會抑制會抑制TaqTaq酶的活性，使用低濃度酶的活性，使用低濃度dNTPdNTP可以減少在可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度濃度dNTPsdNTPs易產生錯誤摻入，而濃度太低，易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。勢必降低反應物的產量。PCRPCR常用的濃度為常用的濃度為5050200M200M，不能低于，不能低于101015M15M。四種。四種dNTPdNTP的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，

18、降低或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。合成速度，過早終止反應。Taq DNATaq DNA聚合酶最早是從嗜熱水生菌中提純出聚合酶最早是從嗜熱水生菌中提純出來的。來的。PCRPCR反應混合物中，催化一典型的反應混合物中，催化一典型的PCRPCR所所用酶量為用酶量為2U2U。常用范圍為。常用范圍為1 14U/100l4U/100l。由于。由于DNADNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，聚合酶的用量亦有差異，酶量過多會導差異，聚合酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。致非特異產物的增加。TaqTaq酶有酶有5 35

19、 3外切酶活性，但無外切酶活性，但無3355外切核酸酶校正活性，無法校正外切核酸酶校正活性，無法校正DNADNA合成過程合成過程中產生的錯配。中產生的錯配。 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶: :單、雙鏈單、雙鏈DNADNA或或RNARNA都可以作為都可以作為PCRPCR的樣品。的樣品。若起始材料是若起始材料是RNARNA，須先通過逆轉錄得到第一條，須先通過逆轉錄得到第一條cDNAcDNA。用質粒作模板時，線性化的比環(huán)狀的效果。用質粒作模板時，線性化的比環(huán)狀的效果好，但在實際操作中，往往不需要將質粒線性化，好，但在實際操作中，往往不需要將質粒線性化，而直接用做模板。當使用高分子量的而直

20、接用做模板。當使用高分子量的DNADNA（如基（如基因組因組DNADNA）做模板時，如果用適當?shù)拿赶冗M行消）做模板時，如果用適當?shù)拿赶冗M行消化再作為模板，擴增效果會更好?；僮鳛槟０?，擴增效果會更好。對于模板的用量來說，雖然對于模板的用量來說，雖然PCRPCR可以僅用極可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNADNA，但為，但為了保證反應的特異性，還應用了保證反應的特異性，還應用ngng級的級的DNADNA。模板模板模板變性溫度模板變性溫度是決定是決定PCRPCR反應中雙鏈反應中雙鏈DNADNA解鏈的溫度，解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈達不到變性

21、溫度就不會產生單鏈DNADNA模板，模板，PCRPCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，全，DNADNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取一般取90909595。樣品一旦到達此溫度宜迅。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。速冷卻到退火溫度。DNADNA變性不需要時間過變性不需要時間過久，在高溫時間應盡量縮短，以保持久，在高溫時間應盡量縮短，以保持DNADNA聚聚合酶的活力，加入合酶的活力，加入Taq Taq DNADNA聚合酶后最高變聚合酶后最高變性溫度不宜超過性溫度不宜超過9595。PCRPCR緩沖液緩沖液: :用于用

22、于PCRPCR的標準緩沖液為的標準緩沖液為101050mM50mM的的Tris Tris HClHCl緩沖液（緩沖液（pH8.3pH8.3）和）和1.5mM MgCl1.5mM MgCl。在。在7272時，反應體系的時，反應體系的pHpH值將下降值將下降1 1個單位，接近于個單位，接近于7.27.2。二價陽離子的存在至關重要，影響。二價陽離子的存在至關重要，影響PCRPCR的的特異性和產量。實驗表明，特異性和產量。實驗表明，MgMg2+2+優(yōu)于優(yōu)于MnMn2+2+，而，而CaCa2+2+無任何作用。無任何作用。MgMg2+2+過量易生成非特異性擴過量易生成非特異性擴增產物，增產物，MgMg2+

23、2+不足易使產量降低。首次使用靶不足易使產量降低。首次使用靶序列和引物結合時，都要把序列和引物結合時，都要把MgMg2+2+濃度調到最佳，濃度調到最佳，其濃度變化范圍為其濃度變化范圍為1 110mmol/L10mmol/L。PCRPCR循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)常規(guī)常規(guī)PCRPCR循環(huán)次數(shù)一般為循環(huán)次數(shù)一般為25254040個周個周期。一般是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景期。一般是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴重，復雜度增加。當然循環(huán)反應的次數(shù)嚴重，復雜度增加。當然循環(huán)反應的次數(shù)太少，則產率偏低。所以，在保證產物得太少，則產率偏低。所以，在保證產物得率前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù)。率前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù)。

24、PCRPCR擴增過程擴增過程 在微量離心管中加入適量緩沖液、在微量離心管中加入適量緩沖液、微 量 模 板微 量 模 板 DNADNA、 四 種 脫 氧 單 核 苷 酸、 四 種 脫 氧 單 核 苷 酸（dNTPdNTP）和耐熱）和耐熱TaqTaq聚合酶及兩個合成聚合酶及兩個合成DNADNA引物，并有引物，并有MgMg2+ 2+ 存在。其循環(huán)的溫存在。其循環(huán)的溫度取決于引物的度取決于引物的TmTm值、模板的種類以及值、模板的種類以及聚合酶的耐熱性。聚合酶的耐熱性。(1)(1)變性階段變性階段 加熱使模板加熱使模板DNADNA在高溫下在高溫下（90-9590-95）變性，雙鏈解鏈；）變性，雙鏈解鏈

25、；(2)(2)退火階段退火階段 降低溶液溫度，使合成引降低溶液溫度，使合成引物在低溫（物在低溫（353565,65,一般低于模板一般低于模板TmTm值的值的55左右），與模板左右），與模板DNADNA互補退火互補退火形成部分雙鏈；形成部分雙鏈；(3)(3)延伸階段延伸階段 溶液反應溫度升至中溫溶液反應溫度升至中溫(72)(72)，在，在 TaqTaq酶作用下，以酶作用下，以dNTPdNTP為為原料，引物為復制起點，模板原料，引物為復制起點，模板DNADNA的一的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈。雙鏈。PCR Mixture:Template DNA: 1

26、l (10ng) Primer 1: 1 l (10 M) Primer 2: 1 l (10 M) dNTPs: 1 l (10mM each) Taq DNA polymerase: 0.5 l(5U/ l)10buffer: 5 l25mM MgCl2: 3 lddH2O: 37.5 l Total: 50 l將將PCRPCR反應體系加好混勻后，按照下面步反應體系加好混勻后，按照下面步驟調好驟調好PCRPCR儀，開始擴增儀，開始擴增9494變性變性2.5min2.5min后開始以下循環(huán)后開始以下循環(huán) 9494變性反應變性反應30 sec30 sec； 5656退火反應退火反應30 sec

27、30 sec； 7272延伸反應延伸反應1 min1 min； 進行進行3030個循環(huán)；個循環(huán)； 最后最后7272反應反應7min7min； 4 4 冷卻恒定。冷卻恒定。取取5 5 l PCRl PCR產物，采用產物，采用1.01.0瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳分析電泳分析PCRPCR產物的量、引物擴增的特異性。產物的量、引物擴增的特異性。下圖為比較好的實驗結果。下圖為比較好的實驗結果。PCRPCR結果：結果：DNA MarkerPCR product學生實驗結果學生實驗結果(4 l)返回目錄返回目錄相關基礎知識相關基礎知識 限制性核酸內切酶：是一類能識別雙限制性核酸內切酶：是一類能識別雙鏈鏈DN

28、ADNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNADNA水解酶。是水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，與核酸聚合體外剪切基因片段的重要工具，與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。酶。限制性核酸內切酶不僅是限制性核酸內切酶不僅是DNADNA重組中重重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。的鑒定。1) 1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段。段。 各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割各種細菌都能合成一種或幾種能

29、夠切割DNADNA雙鏈的核酸內切酶，它們以此來限制外源雙鏈的核酸內切酶，它們以此來限制外源DNADNA存在于自身細胞內，但合成這種酶的細胞存在于自身細胞內，但合成這種酶的細胞自身的自身的DNADNA不受影響，因為這種細胞還合成了不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的一種修飾酶，對自身的DNADNA進行了修飾，限制進行了修飾，限制性酶對修飾過的性酶對修飾過的DNADNA不能起作用。這種現(xiàn)象被不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。2)2)限制性核酸內切酶的類型及特性限制性核酸內切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關系按限制酶的組成、與

30、修飾酶活性關系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：以及切斷核酸的情況不同，分為三類： 型型 型型* * 型型第一類（第一類（I I型）限制性內切酶型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割別點附近的一些核苷酸上切割DNADNA分子中分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNADNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析于分析DNADNA結構或克隆基因。這類酶如結構或克隆基因。這類酶如EcoEco

31、B B、EcoEcoK K等。等。 第二類第二類(II(II型型) )限制性內切酶限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。這種酶識別的專內的固定位置上切割雙鏈。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是一核苷酸順序最常見的是4 4個或個或6 6個核苷酸，少個核苷酸，少數(shù)也有識別數(shù)也有識別5 5個核苷酸以及個核苷酸以及7 7個、個、8 8個、個、9 9個、個、1010個和個和1111個核苷酸的。個核苷酸的。 II II 型限制性內切酶的識別順序是一個回型限制性內切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸文對稱順序，即有

32、一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向朝二個方向“讀讀”都完全相同。這種酶的切割都完全相同。這種酶的切割可以有可以有兩種方式兩種方式：粘性末端：粘性末端：是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。所以稱為粘性末端。如如EcoRIEcoRI的識別順序為：的識別順序為： 5 GAA|TT_C 35 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂直線表示中心對稱軸，從兩側垂直線表示中心對稱軸，從兩側“讀讀”核苷酸順序都是核苷酸順序都是GAATTCGA

33、ATTC或或CTTAAGCTTAAG，這就是回文順序（，這就是回文順序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成5G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二個二個DNADNA片段，各片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過鍵以及氫鍵可通過DNADNA連接酶的作用而連接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一種是在同一位置上切型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末

34、端。例如割雙鏈，產生平頭末端。例如EcoEcoRV RV 的識別的識別位置是：位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。這種末端同。這種末端同樣可以通過樣可以通過DNADNA連接酶連接起來。連接酶連接起來。平頭末端：平頭末端：第三類（第三類（ IIIIII型）限制性內切酶型）限制性內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序文順序, ,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定在識別順序旁邊幾個核

35、苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度一定長度DNADNA片段，具有各種單鏈末端。因此片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。不能應用于基因克隆。3) 3) 限制性核酸內切酶的命名法限制性核酸內切酶的命名法v 用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用用Eco表示，所以用斜體字。表示，所以用斜體字。v 用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌用一個字母代表

36、菌株或型，如流感嗜血菌RdRd菌株用菌株用d d，即，即Hind d。v 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, d, Hindd，Hindd等。等。4) 4) 影響核酸限制性內切酶活性的因素影響核酸限制性內切酶活性的因素(1) DNA(1) DNA的純度；的純度；(2) (2) 酶切消化反應的溫度；酶切消化反應的溫度；(3) (3) 溶液中離子濃度及種類；溶液中離子濃度及種類；(4) (4) 緩沖液的緩沖液的 pHpH值。值。EcoEcoR I R I 酶切位點：酶切位點：GA

37、ATT_CGAATT_CHindIII HindIII 酶切位點：酶切位點：AAGCT_TAAGCT_T1010 buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl酶活性的定義：酶活性的定義：一個活性單位（一個活性單位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反應體系中，反應體系中，3737o oC C的條件下，經過的條件下，經過1 1小時的反應時間，

38、將小時的反應時間，將1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因為不同的酶所要求的最適反應條件不同，所因為不同的酶所要求的最適反應條件不同，所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按照銷售酶的公司所提供的相應緩沖液。雙酶切照銷售酶的公司所提供的相應緩沖液。雙酶切或多酶切時要考慮相容性緩沖液問題，一般公或多酶切時要考慮相容性緩沖液問題，一般公司會給用戶提供這方面的信息。司會給用戶提供這方面的信息。學習限制性內切酶的特性、酶解的操作方學習限制性內切酶的特性、酶解的操作方法；法；掌握利用瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定掌握利用瓊脂糖凝膠

39、電泳分離鑒定DNADNA片片段的有效方法。段的有效方法。 ddH2O : 8.4ul10XBuffer: 2 ulPlasmid: 10 ulEcoRI : 0.5 ulHindIII : 0.5ul1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 酶切后直接進行電泳檢測，下圖是較好的酶切后直接進行電泳檢測，下圖是較好的酶切結果。酶切結果。返回目錄返回目錄 DNADNA片段的純化：片段的純化： DNADNA純化的主要目的是回收純化的主要目的是回收得到純的目的得到純的目的DNADNA片段，去除影響片段，去除影響DNADNA連接酶活性的連接酶活性的物質以及其它的物質以及其它的DNADNA片段。片段。純化

40、純化DNADNA片段的方法有多種，如：電洗脫法、片段的方法有多種，如：電洗脫法、從低熔點或普通瓊脂糖凝膠中回收、玻璃珠純化、從低熔點或普通瓊脂糖凝膠中回收、玻璃珠純化、柱層析以及硅膠吸附等方法。目前一些生物公司推柱層析以及硅膠吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接從出了直接從 PCRPCR產物中或瓊脂糖凝膠中回收產物中或瓊脂糖凝膠中回收DNADNA片片段的試劑盒，有效地加快了段的試劑盒，有效地加快了DNADNA的純化的速度。的純化的速度。 用用1%1%瓊脂糖凝膠電泳分離上次的瓊脂糖凝膠電泳分離上次的PCRPCR片段片段(marker(marker為為6 6l 100bp DNA ladder)

41、l 100bp DNA ladder)，紫，紫外燈下觀察染色條帶；外燈下觀察染色條帶； 用干凈的刀片切出所需用干凈的刀片切出所需DNADNA條帶，注意要在條帶，注意要在長波長（長波長（300nm300nm）UVUV燈下燈下( (如果有的話如果有的話) )操操作，并快速操作，以免損傷作，并快速操作，以免損傷DNADNA。應盡可能。應盡可能多地去除瓊脂糖凝膠；多地去除瓊脂糖凝膠； 將切下的瓊脂糖凝膠放入離心管中，稱重，將切下的瓊脂糖凝膠放入離心管中，稱重，（空管預先稱重），計算凝膠重量；（空管預先稱重），計算凝膠重量；4 4）按照）按照100mg100mg凝膠加入凝膠加入700ul700ul的比例

42、加入溶膠液，的比例加入溶膠液，5555水浴放置水浴放置5-105-10分鐘，其間偶爾顛倒離心管數(shù)分鐘，其間偶爾顛倒離心管數(shù)次，至凝膠完全融化；（凝膠重量盡量小于次，至凝膠完全融化；（凝膠重量盡量小于100mg)100mg)5 5）將離心管中的溶液轉移到吸附柱中，室溫放置）將離心管中的溶液轉移到吸附柱中，室溫放置1 1分鐘，分鐘，1200012000轉離心轉離心0.50.5分鐘分鐘, ,吸附柱容量約吸附柱容量約800l, 800l, 一次上不完可分兩次上樣；一次上不完可分兩次上樣；6 6）取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，向吸附柱中）取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，向吸附柱中加入加入500ul50

43、0ul漂洗液漂洗液(Wash Buffer), 12000(Wash Buffer), 12000轉離心轉離心0.50.5分鐘；分鐘；7 7）重復一次步驟重復一次步驟6 6；8) 8) 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，1200012000轉轉離心離心2 2分鐘；分鐘；9 9）吸附柱放入新的離心管中，在吸附柱的膜中）吸附柱放入新的離心管中，在吸附柱的膜中 央加入央加入30ul 30ul 洗脫緩沖液洗脫緩沖液( (或或TETE溶液溶液) )，室溫放，室溫放 置置2 2分鐘；分鐘；1010）1200012000轉離心轉離心1 1分鐘分鐘 PCR實驗結果實驗結果PCR

44、產物純化后產物純化后返回目錄返回目錄返回目錄返回目錄感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞(Competent cells)受體細胞經過一些特殊方法（如：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl2，等化，等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源化，成為能容許外源DNA的載體分子通過的感的載體分子通過的感受態(tài)細胞受態(tài)細胞(competent cell) 。 轉化（轉化（transformation）是將異源是將異源DNA分子引入一細胞株系，使分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究

45、領域的基本實驗技術。因工程等研究領域的基本實驗技術。 進入細胞的進入細胞的DNA分子通過復制表達，才分子通過復制表達，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的能實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。切酶和甲基化酶的突變株。轉化的方法：轉化的方法：化學的方法化學的方法(熱擊法熱擊法)；使用化學試劑（如；使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體理將載體DNA分子導入

46、受體細胞；分子導入受體細胞；1. 電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。分子導入受體細胞?？寺〉暮Y選：克隆的篩選：主要用不同抗生素基因篩選。常用的主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；將經過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養(yǎng)將經過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉化體，基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源即帶有異源DNA分子的受體細胞。否則，分子的受體細胞。否則，如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細菌的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。質粒。重組重組DNADNA轉化細轉化細菌過程示意圖菌過程示意圖1 1）大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備）大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(CaCl(CaCl2 2法法) ) （1 1）從）從E.coliE.coli DH5 DH5菌平板上挑取一單菌菌平板上挑取一單菌落，接種于落，接種于3ml LB3ml LB液體培養(yǎng)基中，液體