細(xì)胞凋亡原理VIP

1、流式細(xì)胞儀技術(shù)概述適當(dāng)染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細(xì)胞在懸液中以單行流過(guò)高強(qiáng)度光源的焦點(diǎn)，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)焦點(diǎn)時(shí)，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經(jīng)過(guò)過(guò)濾及光鏡系統(tǒng)收集到達(dá)一個(gè)光電檢測(cè)器(光電倍增管或一個(gè)固態(tài)裝置)，光檢測(cè)器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化后而成整數(shù)，然后進(jìn)行電子存儲(chǔ)，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進(jìn)行分析。其優(yōu)點(diǎn)如下：1、具有操作簡(jiǎn)便，只要將染色的單個(gè)細(xì)胞推入儀器中，就會(huì)得出數(shù)據(jù)。2、具有較高的靈敏度及測(cè)定速度，而且每次可測(cè)出許多數(shù)據(jù)，一般情況下，每秒可測(cè)5000個(gè)細(xì)胞，能迅速分析和記數(shù)大量細(xì)胞，并能準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)群體中熒光標(biāo)記細(xì)胞的比例。3、應(yīng)用廣泛，即可用于測(cè)定

2、細(xì)胞活力、繁殖周期和細(xì)胞定型分析，也可區(qū)別死亡細(xì)胞、分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群，既可測(cè)定DNA和RNA、測(cè)凋亡峰，又可測(cè)蛋白含量，特別是胞漿蛋白。一、樣品的制備流式細(xì)胞儀是測(cè)定一個(gè)或重復(fù)的每個(gè)顆粒經(jīng)光路的信號(hào)，因此，細(xì)胞必須做成單個(gè)細(xì)胞懸浮狀態(tài)，不能聚集，也不允許有細(xì)胞碎片存在。所用染料必須特異（如特異單抗），而且不允許滲透至載液中。標(biāo)本如果是屬于淋巴細(xì)胞等血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或白血病細(xì)胞系或類淋巴細(xì)胞系，要經(jīng)Ficoll分離，作單細(xì)胞分離處理，但若為實(shí)體組織或貼壁生長(zhǎng)的上皮成纖維樣細(xì)胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)，化學(xué)法（EDTA、EGTA和檸檬酸鹽）消化分散液或洗液最好用無(wú)鈣、鎂PBS，檸

3、檬酸鹽的濃度為40mol/L，并同時(shí)采用機(jī)械分散法，將經(jīng)消化處理的膨松組織，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗23次后重懸，最好過(guò)一下尼龍或不銹鋼網(wǎng)篩100m和20m。細(xì)胞濃度要保證在1-2106/mL若標(biāo)本用于測(cè)定單個(gè)細(xì)胞，需加入15mg/L的DNAase，將有助于阻止破碎細(xì)胞釋放的DNA造成細(xì)胞再聚集，但是若分離的細(xì)胞要作DNA含量測(cè)定之用時(shí)，則切勿加DNAase。二、懸浮細(xì)胞的固定上述制備的活細(xì)胞即可用于流式細(xì)胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進(jìn)行，或?yàn)榱颂岣呷旧Ч?，則要將細(xì)胞預(yù)固定。乙醇固定是常用的方法。1、固定方法：(1)甲醛法：在細(xì)胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank

4、S液配)4下固定12-18小時(shí)。(2)乙醇法：細(xì)胞懸于PBS中，緩慢加入-20預(yù)冷的95%乙醇，使終濃度為70%，冰浴30分鐘。(3)丙酮法：于細(xì)胞懸液中，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%。2、實(shí)例：(1)用預(yù)冷的無(wú)鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細(xì)胞制成1106細(xì)胞的懸液。(2)在4下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達(dá)70%。(3)該細(xì)胞可在4下保存數(shù)日。(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇，再將細(xì)胞懸于PBS中或要求的試劑中。三、流式細(xì)胞儀分析的應(yīng)用(一)非染色細(xì)胞的光散射一個(gè)粒子(如細(xì)胞)出現(xiàn)在一束光線中，立即會(huì)干擾該光束，造成

5、該光束入射光的重分布，該細(xì)胞所獲能量則以衍散、折射、反射等復(fù)雜的參數(shù)形式重新發(fā)射出來(lái)，這些參數(shù)與細(xì)胞體積、表面構(gòu)象、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成函數(shù)關(guān)系，可測(cè)低角前面約10的光散射及90的光散射。一般認(rèn)為，90位置的光散射值主要受細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)所致的光反射和折射影響，而低角前面10位置的光散射則主要代表細(xì)胞大小。光散射測(cè)量方法如下：(1)將細(xì)胞懸浮于HBSS中，濃度介于11062106/mL濃度之間。(2)以懸浮細(xì)胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細(xì)胞貯藏池。(3)設(shè)定細(xì)胞流量為500個(gè)/S(秒)，以獲得最佳測(cè)定結(jié)果。(二)染色法1 細(xì)胞的碘化丙錠(propiolium iodide PI)染色PI和EB(溴

6、化乙錠)為同類物質(zhì)，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強(qiáng)度增加約20倍，PI的熒光強(qiáng)度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長(zhǎng)激發(fā)，DNA/PI復(fù)合物最大的發(fā)射波長(zhǎng)約為615nm。1.1 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(3LL)DNA含量測(cè)定方法(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS沖洗；(2)去除結(jié)締組織及脂肪，剪碎腫塊；(3)小碎片移入1.2038mm注射針,加壓使其通過(guò),于4條件下重懸細(xì)胞于HBSS中。(4)將200300L細(xì)胞懸液(5105細(xì)胞/mL)中加入3mL PI(50g/mL)，染色3LL細(xì)胞，于4存放2030分鐘。(5)測(cè)定580750nm之間的發(fā)射熒光，

7、以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。1.2 培養(yǎng)細(xì)胞DNA的流式細(xì)胞儀分析(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次；(2)加入PI5mL于培養(yǎng)皿中，在4放10分鐘；(3)用吸管反復(fù)次打細(xì)胞，使細(xì)胞破壞，胞核釋放出來(lái)，再行流式細(xì)胞儀分析。1.3 完整細(xì)胞DNA的PI染色(1)70%乙醇固定的細(xì)胞懸液，離心，去固定液；(2)室溫條件下加入PI染色一批細(xì)胞（105106細(xì)胞/mL），時(shí)間為30分鐘，然后行流式細(xì)胞儀分析。1.4 光輝霉素和PI的DNA染色在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過(guò)

8、程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實(shí)體腫瘤組織，精子細(xì)胞及婦科標(biāo)本，同時(shí)也適用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。(1)分離制備的細(xì)胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。(2)以PI/光輝霉素染色，41小時(shí)（PI為10 mg/L、光輝霉素為10 mg/L）。(3)染色后進(jìn)樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法(one seep filter)。2、DNA和RNA的鑒別染色利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細(xì)胞核酸，或作溶酶體的一種標(biāo)記。觀察死亡細(xì)胞熒光變色性變化以及

9、區(qū)別分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群體。雖然測(cè)定DNA和RNA含量時(shí)較難獲得好的重復(fù)性結(jié)果，但該方法已被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。方法如下：(1)試劑：溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL1mol/L NacL 15ml蒸餾水76mL，PH1.5（100mL）溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月，最好除菌以后(高壓或過(guò)濾)貯存。0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L檸檬酸18.5mL蒸餾水24mL，總體積為99mL pH6.0吖啶橙母液：用吖啶橙/蒸餾水配成1mg

10、/mL(致癌物，應(yīng)小心)，吖啶橙應(yīng)用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀釋。注意：儀器鞘流系統(tǒng)應(yīng)保持4。氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F600nm),綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F530nm)(2)方法用含15%血清的PBS配制細(xì)胞懸液，取0.2mL(8106細(xì)胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4放置4560秒。加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。應(yīng)在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進(jìn)流式細(xì)胞儀分析。注意：細(xì)胞數(shù)保持恒定；核酸與吖啶橙的比例；染色時(shí)間及溫度。(三)染色法的應(yīng)用1、變性及雙鏈DNA的鑒別染色(1)試劑：HBSS內(nèi)含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl

11、pH1.35吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5 mg/L(16.7m),0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液，pH2.6。2106細(xì)胞懸于1mL HBSS/RNase液中。37溫育1小時(shí)。將0.2mL細(xì)胞懸液(含4105細(xì)胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20 30分鐘。加2mL吖啶橙染色2分鐘。綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細(xì)胞中單鏈及雙鏈DNA含量。2、DNA與癌基因探針雙標(biāo)記測(cè)定這種測(cè)定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標(biāo)記癌基因表達(dá)產(chǎn)物，然后用PI標(biāo)記DNA，現(xiàn)以研究白血病細(xì)胞增殖與癌基因的關(guān)系

12、說(shuō)明操作步驟：(1)制備白血病細(xì)胞懸液，用100%甲醇在-20固定10分鐘。(2)取50l50mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合)，4作用3045分鐘。(3)用PB離心洗滌2次，重懸浮于50L HBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。(4)加入50L 1:200兔抗鼠IgG，4放置3045分鐘。(5)同(3)洗滌后加入50L 1:40的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4反應(yīng)3045分鐘。(6)同(3)洗滌后，細(xì)胞用RNA酶消化，室溫2030分鐘。(7)同(3)洗滌后，用PI染液染2

13、0分鐘。(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定。FITC染色顯示ras癌基因表達(dá)產(chǎn)物，PI染色顯示DNA含量。注意事項(xiàng)：制備樣品時(shí)，離心次數(shù)不宜過(guò)多，防止細(xì)胞丟失和凝集；細(xì)胞固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑；為了降低本底，應(yīng)將細(xì)胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈；進(jìn)行雙標(biāo)記沉淀時(shí)，應(yīng)盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。3、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進(jìn)行細(xì)胞周期分析。(1)試劑：用培養(yǎng)基配制33 mg/L Brdu及脫氧細(xì)胞苷26.4g/mL。染色液：Hoechst33258溶于PBS，細(xì)胞染色24小時(shí)后進(jìn)行分析，據(jù)報(bào)道染色的穩(wěn)定時(shí)間在30分鐘

14、至24小時(shí)之間。(2)方法：將Brdu溶液按1:10加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。根據(jù)細(xì)胞周期時(shí)間不同，選擇不同時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞。孵育后，搖散細(xì)胞以傳代培養(yǎng)。直接用染液重懸細(xì)胞，進(jìn)入流式細(xì)胞儀分析。Hoechst33258熒光值在410580nm之間，需用330360nm紫外光激發(fā)。應(yīng)特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對(duì)。因此，不僅特異性標(biāo)記DNA，亦可標(biāo)記胸腺嘧啶。在細(xì)胞周期分析時(shí)，在與細(xì)胞孵育過(guò)程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內(nèi)的細(xì)胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰，此項(xiàng)技術(shù)可用于直接測(cè)定細(xì)胞G2期及分裂時(shí)間。4、Hoechst33342染色活細(xì)胞

15、DNA(1)試劑：Hoechst 33342,用蒸餾水配成0.25mol/L。(2)方法：制備106/m細(xì)胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為510 mg/L ，室溫下20分鐘。分析前切勿洗滌細(xì)胞。Hoechst33342可用作細(xì)胞DNA的活體染料，據(jù)信可在保持細(xì)胞活性的同時(shí)，呈現(xiàn)出相當(dāng)好的DNA化學(xué)計(jì)量關(guān)系，激發(fā)波在紫外范圍350363nm之間，發(fā)射波則在450nm處。5、以異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyante FIFC）染色蛋白質(zhì)。(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.11.0 mg/L濃度。(2)方法：

16、染色前用終濃度70%乙醇固定細(xì)胞，至少18小時(shí)。離心固定細(xì)胞，棄去固定液。室溫下用FIFC染色細(xì)胞蛋白，30分鐘。流式細(xì)胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)515535nm。也可于固定細(xì)胞中，以18 mg/L (0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/LRNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對(duì)DNA和蛋白質(zhì)雙重染色，分別呈現(xiàn)紅色熒光（DNA）和綠色熒光（蛋白質(zhì)）。6、熒光素抗體的應(yīng)用該技術(shù)既可用于檢測(cè)帶有特異性膜抗原的細(xì)胞，可用熒光素或若丹明標(biāo)記單克隆抗體處理上述細(xì)胞；也可用于測(cè)定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)，后者

17、在細(xì)胞凋亡章節(jié)中已介紹從略。用磷酸鹽緩沖液EaglesMEM稀釋FIFC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FIFC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細(xì)胞中加入50L不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認(rèn)最佳染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時(shí)，應(yīng)稀釋成5mg/L或 0.25 mg/L。無(wú)論鼠或人細(xì)胞在2107濃度時(shí)其存活率應(yīng)在90%以上。方法：(1)于微量滴定板加入50L抗體稀釋度，再加入50L細(xì)胞懸液，混勻。(2)冰浴45分鐘，離心滴定板（1500r/min 10分鐘）。(3)棄上清，以培養(yǎng)基100L洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min 10分鐘，棄上清。(4)

18、以1ml預(yù)冷的培養(yǎng)基配成1106細(xì)胞/mL的已染色細(xì)胞懸液，進(jìn)樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4)。目前流式細(xì)胞儀(FCM)已在各學(xué)科中獲得應(yīng)用。細(xì)胞生物學(xué)：定量分析細(xì)胞周期并分選不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達(dá)產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系，進(jìn)行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體。腫瘤學(xué)：DNA倍體含量測(cè)定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標(biāo)。近年來(lái)已應(yīng)用DNA倍體測(cè)定技術(shù)，對(duì)白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細(xì)胞。免疫學(xué)：研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系；進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的分型與純化；

19、分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)等。血液學(xué)：血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過(guò)氧化物酶、非特異性酯酶等；用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)胞增殖周期變化的關(guān)系，檢測(cè)母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽(yáng)性細(xì)胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血；檢測(cè)血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。藥物學(xué)：檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥的作用機(jī)制，亦可用于篩選新藥，如化療藥物對(duì)腫瘤的凋亡機(jī)制，可通過(guò)測(cè)DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡PI單染色法基本原

20、理其原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變最具特征性，主要包括以下幾個(gè)方面：1. 細(xì)胞核的改變：由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。2. 光散射特性：凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上，前散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)，而側(cè)散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在

21、細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核破裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞腫脹，其前散射光增大；側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大，因此可根據(jù)前散射光和側(cè)散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側(cè)散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測(cè)凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測(cè)凋亡細(xì)胞最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來(lái)，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。也可用于活細(xì)胞的分類。試劑