動(dòng)植物檢疫論文

1、學(xué)號(hào)：20071040114河北北方學(xué)院畢業(yè)論文奶牛酮病紅細(xì)胞膜上atp酶活性變化的研究 the study on changes of atpase activity on the membrance of rbc in holstein dairy cow with ketosis學(xué) 生：劉帥帥指導(dǎo)教師：張麗云院 系：動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系專(zhuān) 業(yè)：動(dòng)植物檢疫班 級(jí)：07動(dòng)植物檢疫本科班論文提交日期：2011年6月9日目錄引言51 材料和方法81.1 實(shí)驗(yàn)材料81.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物81.1.2 藥品81.1.3實(shí)驗(yàn)儀器81.2 方法81.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理82結(jié)果92.1酮病陽(yáng)性牛的診斷92

2、.1.1酮粉法診斷92.2紅細(xì)胞膜上atpase活性測(cè)定結(jié)果93討論104結(jié)論11參考文獻(xiàn)12致謝13奶牛酮病紅細(xì)胞膜上atp酶活性變化的研究劉帥帥（河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系）指導(dǎo)教師：張麗云摘要： 為了深入研究酮病的發(fā)生機(jī)理，選擇荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。應(yīng)用酮粉法和改良式水楊醛比色法隨機(jī)檢測(cè)分組，組為10頭對(duì)照牛、組為10頭陽(yáng)性牛。應(yīng)用試劑盒比色法測(cè)定紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化。結(jié)果表明，陽(yáng)性組和對(duì)照組相比，紅細(xì)胞膜上atpase的活性顯著下降(p0.05)，說(shuō)明奶牛酮病影響紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化。關(guān)鍵詞：酮??；atp酶；奶牛the study on changes

3、 of atpase activity on the membrance of rbc in holstein dairy cow with ketosis.liu shuaishuai(veterinary medicine, colloge of animal science and technology, hebei northern university)guide teacher:zhang liyunabstract：in attempt to study the mechanism of ketosis, the holstein dairy cows were randomly

4、 divided into two groups according to the ketone bodies powder method and improvemental salicylaldehyde colorimetric method, group（n=10）was the control, group（n=10）was experimental, and determination changes of atpase activity by reagent case colorimetric method. the results expresses that was signi

5、ficantly difference on changes of atpase activity on the membrance of control group and experimental group（p0.05）.therefore ketosis in dairy cow was influence to changes of atpase activity on the membrance.key words: ketosis；atpase activity；dairy cow引言近年來(lái)，我國(guó)奶牛酮病發(fā)病率顯著增高，尤其是隱性酮病。降低奶產(chǎn)量，影響奶質(zhì)量，給奶牛業(yè)發(fā)展帶來(lái)了重

6、大的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛酮病是高產(chǎn)奶牛產(chǎn)犢后6周內(nèi)，最常發(fā)生的一種以碳水化合物和揮發(fā)性脂酸代謝紊亂為基礎(chǔ)的營(yíng)養(yǎng)代謝病。臨床表現(xiàn)為：頑固性消化紊亂、產(chǎn)奶量下降、機(jī)體脫水和一定的神經(jīng)癥狀。臨床特征為酮血、酮尿、酮乳、低血糖、血漿游離脂肪酸濃度升高和肝糖元含量降低2。為了進(jìn)一步揭示奶牛酮病的發(fā)生機(jī)理，首次對(duì)奶牛酮病紅細(xì)胞膜上atpase活性進(jìn)行了測(cè)定，旨在為臨床防治奶牛酮病提供科學(xué)依據(jù)3。為了深入研究酮病的發(fā)生機(jī)理,選擇奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。應(yīng)用酮粉法和改良式水楊醛比色法隨機(jī)檢測(cè)分組4:組為10頭對(duì)照牛、組為10頭陽(yáng)性牛，應(yīng)用試劑盒比色法測(cè)定紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化。結(jié)果表明，陽(yáng)性組和對(duì)照組相比,紅細(xì)

7、胞膜上atpase的活性顯著下降(p0.05)，說(shuō)明奶牛酮病影響紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化。1 酮病發(fā)生的有關(guān)因素：1.1與生理狀態(tài)的關(guān)系 在正常生理情況下，母牛分娩后的4周6周出現(xiàn)泌乳高峰，但其食欲恢復(fù)和采食量的高峰約在產(chǎn)犢后8周10周。因此，在產(chǎn)犢后10周內(nèi)乳牛的食欲較差，能量和葡萄糖的來(lái)源本來(lái)就不能滿(mǎn)足泌乳消耗的需要，如果母牛泌乳量過(guò)高，將勢(shì)必加劇這種不平衡。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，奶牛每天適合的產(chǎn)奶量為22 kg；如果每天產(chǎn)奶34 kg，則血液中全部的葡萄糖都將被乳腺所攝取，這就造成了乳牛血糖過(guò)低而引發(fā)酮病，所以，高產(chǎn)乳牛酮病的發(fā)病率較高。干奶期供應(yīng)能量水平過(guò)高，母牛產(chǎn)前過(guò)度肥胖，分娩后嚴(yán)

8、重影響采食量的恢復(fù)，同樣會(huì)使機(jī)體的生糖物質(zhì)缺乏，引起能量負(fù)平衡，產(chǎn)生大量酮體而發(fā)病。 1.11產(chǎn)前過(guò)度肥胖干奶期供應(yīng)能量水平過(guò)高，母牛產(chǎn)前過(guò)度肥胖，分娩后嚴(yán)重影響采食量的恢復(fù)，同樣會(huì)使機(jī)體的生糖物質(zhì)缺乏，引起能量負(fù)平衡，產(chǎn)生大量酮體而發(fā)病。 1.12泌乳期趙海忠等研究表明，亞臨床酮病主要集中在產(chǎn)后3個(gè)月，并隨泌乳月增加而減少，第1個(gè)泌乳月發(fā)病率最高，達(dá)41.82%，依次為26.83%、13.64%，產(chǎn)后第4個(gè)月降為7.69%；酮病發(fā)病高峰期在分娩后第2周3周7。 1.13產(chǎn)奶量產(chǎn)奶量越高，酮病發(fā)生率也高，年平均產(chǎn)奶量在900 kg以上的高產(chǎn)牛發(fā)病率最高，達(dá)68.18%，但低產(chǎn)奶量(3.0噸以下

9、)的奶牛酮病發(fā)生率也有上升的趨勢(shì)7。 1.14胎次研究顯示，隨胎次升高而發(fā)病率逐漸降低，一般多發(fā)生于第2胎第5胎的高產(chǎn)奶牛，第6胎以后的奶牛酮病發(fā)生率降低。 1.2與營(yíng)養(yǎng)組分的關(guān)系 飼料供應(yīng)過(guò)少、品質(zhì)低劣，飼料單一、日糧不平衡；或精料(高蛋白質(zhì)、高脂肪和低碳水化合物飼料)過(guò)多、粗飼料不足等，均會(huì)使機(jī)體的生糖物質(zhì)缺乏，可引起能量負(fù)平衡，產(chǎn)生大量酮體而發(fā)病。 添加下列營(yíng)養(yǎng)組分可降低酮病的發(fā)生率，莫能菌素能改善奶牛的能量代謝，降低產(chǎn)后酮病發(fā)生率。在日糧中添加莫能菌素緩釋膠囊，奶牛產(chǎn)后酮病降低，真胃異位發(fā)生率降低40%(p0.05)，胎盤(pán)滯留的發(fā)生率降低25%8。 在干奶期日糧中添加12.5 g/kg

10、的沸石粉，奶牛產(chǎn)后1個(gè)月內(nèi)的酮病發(fā)生率降低，產(chǎn)奶量提高，但長(zhǎng)期使用效果不明顯9。 纖維素可有效降低奶牛酮病發(fā)生率，何寶祥等10比較甲乙兩個(gè)奶牛場(chǎng)的酮病發(fā)生率和日糧結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，乳酮及血酮含量在2個(gè)奶牛場(chǎng)間均存在著極顯著差異(p0.01)，原因可能是日糧中纖維素的差異。 煙酸具有降低體脂分解，降低血液-羥丁酸、血中酮體和游離脂肪酸的能力。drackley等研究表明，奶牛因分娩可導(dǎo)致煙酸的暫時(shí)缺乏，此時(shí)補(bǔ)煙酸可以提高奶牛采食量并且還有生糖作用，可以誘導(dǎo)生糖氨基酸轉(zhuǎn)化為糖，提高血糖濃度。 丙二醇或者甘油可提高血糖水平，減少血漿中游離脂肪酸和酮體，降低酮病發(fā)生率11。 1.3與飼養(yǎng)水平的關(guān)系 干奶期限飼可

11、降低酮病的發(fā)生率，將35頭經(jīng)產(chǎn)干奶牛分成兩組，自由采食和限飼(ri，按照凈能的80%來(lái)計(jì)算日糧的飼喂量)，結(jié)果顯示產(chǎn)前采食量對(duì)奶牛產(chǎn)后采食量、血清代謝物、產(chǎn)奶量沒(méi)有影響，但自由采食組產(chǎn)后第1天肝中脂肪含量超過(guò)限飼組12；也發(fā)現(xiàn)干奶期限飼(滿(mǎn)足凈能需要的80%)可減少分娩后肝中總脂肪水平和三酰甘油的聚集，提高產(chǎn)后dmi的量。 泌乳初期限飼，在分娩后的第4天開(kāi)始對(duì)奶牛實(shí)施限飼(按照50%的能量水平)，導(dǎo)致奶牛血液中nefa、bhba濃度和肝臟中三酰甘油增加，但血糖降低。 1.4與奶牛體況的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)體況指數(shù)(bci)在3.5以上的奶牛酮病發(fā)生率較高(p0.05)2。bci4.0的奶牛易發(fā)酮病和

12、脂肪肝，bci3.25和bci3.25相比，母牛有較高的非酯化脂肪酸(nefa)和bhba的血液濃度，bci平均在3.280.08時(shí)，nefa平均151.8 eq/l18.3 eq/l，bci平均在3.680.11時(shí)，nefa平均388.5 eq/l71 eq/l，說(shuō)明體況較好的奶牛更易發(fā)生酮病。 2 酮病發(fā)生主要機(jī)制：2.1丙酸來(lái)源不足 丙酸的主要作用除異生成糖以外，還參與體內(nèi)的脂肪代謝。當(dāng)奶牛產(chǎn)奶的能量需要超過(guò)其食入的能量時(shí)，奶牛就開(kāi)始動(dòng)用體脂，脂肪首先被分解為nefa。nefa在肝臟被分解為乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)被徹底分解為二氧化碳和水以產(chǎn)生更多的能量，但這個(gè)過(guò)程需要丙酸；如果沒(méi)有足夠的丙

13、酸可被利用，過(guò)多的乙酸就會(huì)在肝臟中聚集，在酶的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮、乙酰乙酸和-羥基丁酸。 2.2葡萄糖來(lái)源不足 葡萄糖缺乏時(shí)，生成的丙酸過(guò)少，使脂肪分解生成的甘油成為糖異生的重要前體；且由于糖缺乏刺激糖異生加速，使甘油代謝加快，同時(shí)脂肪酸的-氧化也加快，使生成的乙酰輔酶a增多。另一方面當(dāng)糖缺乏時(shí)，草酰乙酸生成量嚴(yán)重不足，而草酰乙酸是乙酰輔酶a進(jìn)入三羧酸循環(huán)所必需的。在這種情況下，乙酰輔酶a會(huì)大量生成酮體。同時(shí)因糖的缺乏不能產(chǎn)生更多的3-磷酸甘油，并且由組織中動(dòng)員出來(lái)的甘油，在肝中也大部分沿糖異生途徑進(jìn)行代謝。這樣肝中3-磷酸甘油的產(chǎn)量受到限制，不能將很多的ffa酯化為三酰甘油，進(jìn)一步促使更多的f

14、fa氧化為乙酰輔酶a，這樣更加劇了酮體的生成。 血糖濃度下降，引起胰高血糖素分泌增多，胰島素分泌減少，垂體內(nèi)葡萄糖受體興奮，促進(jìn)腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素，肝糖原分解增多，脂肪水解為甘油和游離脂肪酸的速度加快，酮體生成增多。由此可見(jiàn)酮病的發(fā)病機(jī)理很復(fù)雜，但普遍接受的是糖缺乏理論。機(jī)體低血糖是產(chǎn)生酮病的關(guān)鍵。由于各種原因所致碳水化合物供應(yīng)不足及高泌乳消耗大量的糖，導(dǎo)致機(jī)體低血糖及能量負(fù)平衡。為此,動(dòng)用體脂肪和體蛋白，補(bǔ)充能量的不足。但是，脂肪和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸和生酮氨基酸，經(jīng)肝臟的-氧化為乙酰輔酶a，乙酰輔酶a可與草酰乙酸縮合成檸檬酸經(jīng)三羧酸循環(huán)氧化供能。如果生成草酰乙酸的先質(zhì)丙酸的碳

15、水化合物不足,使得大量乙酰輔酶a不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致酮體蓄積，進(jìn)而引起一系列的代謝與機(jī)能紊亂4。臨床表現(xiàn)為消化型、神經(jīng)型和癱瘓型酮病5。atp酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，它包括na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase 4種，在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用，機(jī)體在缺氧及某些病理情況下，此酶活性發(fā)生一系列改變6。為了深入研究酮病的發(fā)生機(jī)理，本試驗(yàn)選擇奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用酮粉法和改良式水楊醛比色法隨機(jī)檢測(cè)紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1

16、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 黑龍江某牛場(chǎng)泌乳量在6.5103kg以上的36胎荷斯坦奶牛。1.1.2 藥品 紅細(xì)胞膜上atpase活性測(cè)定試劑盒，南京建成生物研究所；亞硝基鐵氰化鈉,無(wú)水碳酸鈉，硫酸銨(分析純)，天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)。 1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 7230g分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠(chǎng))；低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；旋渦混勻器(上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠(chǎng))。1.2 方法1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理應(yīng)用酮粉法2和改良式水楊醛比色法3對(duì)黑龍江某農(nóng)場(chǎng)的荷斯坦奶牛進(jìn)行酮病抽樣檢測(cè)。分為兩組，每組10頭，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組。1.2.2 紅細(xì)胞膜上atpase活性測(cè)定于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組奶牛尾靜脈采取1 ml肝素抗凝全血

17、，測(cè)定紅細(xì)胞數(shù),然后加4倍左右的0.86% nacl溶液，2 000r/min離心10 min，棄去上層血清，留紅細(xì)胞沉淀。在沉淀的紅細(xì)胞中加雙蒸水1.0 ml反復(fù)混勻，使其充分溶血,直至溶液透亮，取0.2 ml溶血液應(yīng)用試劑盒比色法測(cè)定紅細(xì)胞膜上atpase活性。 1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析采用excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1酮病陽(yáng)性牛的診斷2.1.1酮粉法診斷酮體的含量與實(shí)驗(yàn)色澤反應(yīng)的快慢,深淺成正比，陰性反應(yīng)成土褐色，陽(yáng)性結(jié)果以“+”表示，并代表乳中酮體的大約含量。陽(yáng)性牛顯示有紫色跡象，并逐漸加深，于30 s達(dá)頂點(diǎn)者為(+)，表示乳中約含酮體4.0 mmol/l以上。圖1酮

18、粉法測(cè)定結(jié)果 fig.1result of determination by ketone bodies powder method 2.1.2 改良式水楊醛比色法診斷在酮粉法診斷結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良式水楊醛比色法血清酮體含量的測(cè)定(表1)，根據(jù)上述兩種方法選擇實(shí)驗(yàn)牛。表1血清酮體含量的測(cè)定結(jié)果table 1determination results of ketone body content in serummmol/l 組別groups樣本數(shù)number酮體ketone body對(duì)照組control group實(shí)驗(yàn)組experimental group10100.6512.062.2紅細(xì)

19、胞膜上atpase活性測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性組和對(duì)照組相比,紅細(xì)胞膜上atpase的活性顯著下降(p0.05) 。表2實(shí)驗(yàn)各組紅細(xì)胞膜上atpase活性測(cè)定 table 2determination results of atpase activity on membrance of rbc molpi/107 rbc/h組別groups樣本數(shù)numbersna+-k+-atpaseca+-mg+-atpase ca+atpasemg+atpase對(duì)照組control group 實(shí)驗(yàn)組experimental group 10100.45140.0361a0.10860.0089b0.68070.06

20、24a0.30120.0210b0.39160.0436a0.25000.0123b0.23110.0193a0.09640.0082b 注：ab表示對(duì)照組和陽(yáng)性組相比，na+-k+-atpase、ca+-mg+-atpase、ca+-atpase和mg+-atpase活性變化均差異顯著（p0.05）note:ab mean na+-k+-atpase、ca+-mg+-atpase、ca+-atpase and mg+-atpase activity p0.05 between control group and experimental group.3討論 酮病的發(fā)病機(jī)理很復(fù)雜，但普遍接受的

21、是糖缺乏理論。機(jī)體低血糖是產(chǎn)生酮病的關(guān)鍵。由于各種原因所致碳水化合物供應(yīng)不足及高泌乳消耗大量的糖，導(dǎo)致機(jī)體低血糖及能量負(fù)平衡。為此，動(dòng)用體脂肪和體蛋白,補(bǔ)充能量的不足。但是,脂肪和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸和生酮氨基酸,經(jīng)肝臟的-氧化為乙酰輔酶a，乙酰輔酶a可與草酰乙酸縮合成檸檬酸經(jīng)三羧酸循環(huán)氧化供能。如果生成草酰乙酸的先質(zhì)丙酸的碳水化合物不足，使得大量乙酰輔酶a不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致酮體蓄積,進(jìn)而引起一系列的代謝與機(jī)能紊亂1。床表現(xiàn)為消化型、神經(jīng)型和癱瘓型酮病。 atp酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，它包括na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpa

22、se、ca2+-atpase和mg2+-atpase 4種，在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用，機(jī)體在缺氧及某些病理情況下，此酶活性發(fā)生一系列改變4。試驗(yàn)結(jié)果表明,酮病陽(yáng)性組與對(duì)照組相比，na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase活性均有程度不同的下降，并且差異顯著。從而說(shuō)明奶牛酮病影響紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有以下兩方面的原因：酮病陽(yáng)性牛的高酮血癥和低糖血癥導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體缺氧，缺氧則導(dǎo)致atpase活性降低；酮陽(yáng)性牛早期的食欲下降和代謝紊亂，使血液中na+、k+、ca2+、mg2+水平發(fā)

23、生變化，進(jìn)而影響n(yōu)a+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase活性，表現(xiàn)程度不同的下降，尤其是神經(jīng)型酮病和癱瘓型酮病更為突出。另外，atpase作為生物膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)酮病敏感，故可作為奶牛酮病的早期診斷、治療和預(yù)防效果監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。綜上所述，奶牛酮病影響紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化，這一結(jié)果對(duì)深入揭示酮病的發(fā)生機(jī)理和臨床防治具有重要的意義。4結(jié)論 4.1 在酮粉法診斷中，陽(yáng)性牛顯示有紫色跡象，并逐漸加深，于30 s達(dá)頂點(diǎn)者為(+)，表示乳中約含酮體4.0 mmol/l以上，比陰性牛含酮體多。4.2 在酮粉法診斷結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行改良式水楊醛比色法血清酮體含的測(cè)定，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組奶牛酮體含量比對(duì)照組奶牛酮體含量高很多。4.3 應(yīng)用試劑盒比色法測(cè)定紅細(xì)胞膜上atpase的活性變化，結(jié)果表明：陽(yáng)性組和對(duì)照組相比，紅細(xì)胞膜上atpase的活性顯著下降(p0.05)。參考文獻(xiàn)1 夏成,孫恒,武瑞.改良的水楊醛比色法檢測(cè)奶牛血酮、尿酮的研究j.吉林畜牧獸醫(yī),2003,14(12):3-5.2 孫斌,趙凱