凝膠電泳課件

1、凝膠電泳凝膠電泳擴(kuò)增原理擴(kuò)增原理分子雜交分子雜交DNA測(cè)序測(cè)序一、凝膠電泳一、凝膠電泳 它是一種分析鑒定重組它是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同時(shí)也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。時(shí)也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳脈沖電場(chǎng)凝膠電泳脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 帶有負(fù)電荷的帶有負(fù)電荷的DNA或或RNA核苷酸鏈，依靠無反核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，凝膠）和緩沖液，在電場(chǎng)中以一定的

2、遷移率從負(fù)在電場(chǎng)中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。將其混合物中的不同成分彼此分開。 1 DNA分子的大小分子的大小 雙鏈雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成反比；反比； 2 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快；濃度越低，相同核酸分子遷移越快； 3 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 一般同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀。一般同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀切口

3、環(huán)狀。 4 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）插入雙鏈）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。長度增加。 5 所用的電壓所用的電壓低電壓時(shí)低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。片段遷移率與所用的電壓成正比。 6 瓊脂糖種類瓊脂糖種類 常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；凝膠電泳的分辨力：凝膠電泳的分辨力： 與凝膠的類型和密度相關(guān)與凝膠的類型和密度相關(guān) 瓊脂糖凝膠的分辨力在瓊脂糖凝膠的分辨力在0.250Kb之間之間; 聚丙烯酰胺的分辨力在聚丙烯酰胺的分辨力在110

4、00bp之間之間Separation Range Vs. % AgaroseLow Geling Agarose 4-6 0.02-0.4 瓊脂糖類型瓊脂糖類型凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度/熔化溫度熔化溫度/ 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35389095不同廠家不同廠家生產(chǎn)的不生產(chǎn)的不同商品其同商品其凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度和熔化溫和熔化溫度有一定度有一定差異差異40428590 高強(qiáng)度瓊脂糖高強(qiáng)度瓊脂糖34438595 修飾的低熔點(diǎn)修飾的低熔點(diǎn)/ 凝點(diǎn)瓊脂糖凝點(diǎn)瓊脂糖253563653565 超低熔點(diǎn)超低熔點(diǎn)8154045 低黏性低熔點(diǎn)瓊低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖脂糖25307038853075Agarose Gel Elec

5、trophoresis 瓊脂糖（瓊脂糖（agarose）是一種從紅色海藻中提?。┦且环N從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。出的線性多糖聚合物。半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷荷分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖。）瓊脂糖。 （1）LMP瓊脂糖瓊脂糖 熔點(diǎn)：熔點(diǎn)：6265 熔解后，在熔解后，在37可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)；在可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)；在25可可保持液態(tài)約保持液態(tài)約10min回收回收DNA操作：將凝膠在操作：將凝膠在65下加熱數(shù)分鐘，再下加熱數(shù)分鐘，再向液態(tài)瓊脂糖中加入過量酚液抽提向液態(tài)瓊脂糖中加入過量酚液抽提DNA

6、，經(jīng)離心，經(jīng)離心獲得含獲得含DNA分子的上清液，酶切分子的上清液，酶切DNA片段后電泳。片段后電泳。 緩沖液：緩沖液：1 TAE（TBE TPE） 凝膠的含量：根據(jù)檢測(cè)的凝膠的含量：根據(jù)檢測(cè)的DNA大小大小 加加DNA樣品：樣品：1g，指示劑，指示劑溴酚藍(lán) 電泳條件：大片斷低電壓長時(shí)間，小片段高電壓電泳條件：大片斷低電壓長時(shí)間，小片段高電壓短時(shí)間短時(shí)間 (5V/cm)染色和觀察：溴化乙錠（染色和觀察：溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，在染色，在300nm波長的紫外下觀察（凝膠成像波長的紫外下觀察（凝膠成像儀），儀）， 能看到能看到0.05 g的微量的微量DNADNA的片斷

7、大小與熒光強(qiáng)度成正比的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比 用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)DNA片斷大小的估算 Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8% Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit: 5-10 ng DNAAgarose gel electrophoresisAgarose gel electrophoresis 1. 瓊脂糖融化時(shí)，檔位不宜太高。瓊脂糖融化時(shí)，檔位不宜太高。2. 制膠和加樣過程中要防止氣泡的產(chǎn)生。制膠和加樣過程中要防止氣泡的產(chǎn)生。3. EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必

8、須戴手套操作，嚴(yán)格具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。注意防護(hù)。4. 加樣時(shí)，加樣時(shí)，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA帶型不整齊。帶型不整齊。5. 電源接通時(shí)，應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確。電源接通時(shí)，應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確。6. 電泳儀有電壓顯示，并不一定標(biāo)志電泳槽已接通，電泳儀有電壓顯示，并不一定標(biāo)志電泳槽已接通，應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況。負(fù)極的氣泡比正極多一倍，應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況。負(fù)極的氣泡比正極多一倍，表示電泳已開始。表示電泳已開始。7.溴化乙錠可插入到溴化乙錠可插入到DNA分子的雙

9、鏈中，在紫外光的分子的雙鏈中，在紫外光的照射下，插入溴化乙錠的照射下，插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色熒光，所以溴呈橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作為熒光指示劑指示化乙錠可以作為熒光指示劑指示DNA含量和位置。含量和位置。 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE- 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡，簡稱稱Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，簡稱，簡稱Bis)在加速劑在加速劑N，N，N ，N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N，N，N

10、 ，N -tetramethyl ethylenedia mine，簡稱，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸和催化劑過硫酸銨銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱，簡稱AP)或或核黃素核黃素(ribofavin即即vita min B2，C17H20O6N4)的作的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱，簡稱PAGE)。 丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯

11、酰胺 聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu)聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu) 1 變性聚丙烯酰胺凝膠變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈用于單鏈DNA片段的分離或純化。片段的分離或純化。 變性的變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)?；M成及序列完全無關(guān)。 用途：放射性用途：放射性DNA探針的分離、探針的分離、DNA測(cè)序反應(yīng)等。測(cè)序反應(yīng)等。 2 非變性聚丙烯酰胺凝膠非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈用于雙鏈DNA片段的分離和純化。片段的分離和純化。 注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。 用途：制備高純度的用途：制備高純度的DNA片段。片段。丙

12、烯酰胺濃度丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/301/30; ; Home SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的原理）的原理 ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在它所

13、帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可和形狀無關(guān)。因此可以利用以利用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分測(cè)定蛋白質(zhì)分子量子量。Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE緩沖液：緩沖液：TBE凝膠聚丙烯酰胺電泳：凝膠聚丙烯酰胺電泳： 丙稀酰胺丙稀酰胺/ 亞甲雙丙稀酰胺（

14、亞甲雙丙稀酰胺（29：1）；）； TEMED（四甲基乙二胺，加速劑）（四甲基乙二胺，加速劑） 過硫酸銨（過硫酸銨（ 10，催化劑，催化劑 ）。）。 垂直板垂直板電泳裝置電泳裝置加樣加樣樣品遷樣品遷移方向移方向電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。混合樣品混合樣品帶孔膠帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子夾在兩塊玻璃夾在兩塊玻璃板之間的凝膠板之間的凝膠 電泳電泳緩沖液緩沖液 電泳電泳緩沖液緩沖液

15、加在槽中的經(jīng)加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品處理的樣品分子量小分子量小分子量大分子量大電源電源電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片水平式電泳裝置水平式電泳裝置電泳緩沖液電泳緩沖液凝膠凝膠1984年，年，D.R.Cantor發(fā)明的。發(fā)明的。分離超大分子量的分離超大分子量的DNA分子分子。在脈沖電泳中，電場(chǎng)方向是周期變化的，頭一個(gè)在脈沖電泳中，電場(chǎng)方向是周期變化的，頭一個(gè)脈沖電場(chǎng)方向與核酸的移動(dòng)方向成脈沖電場(chǎng)方向與核酸的移動(dòng)方向成45 度角，下一度角，下一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45 度角。

16、度角。B+A-+A-B脈沖電場(chǎng)電泳示意圖脈沖電場(chǎng)電泳示意圖脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖 北北 南南 脈沖場(chǎng)電泳脈沖場(chǎng)電泳 常規(guī)電泳常規(guī)電泳 兩組電極，排列不均勻兩組電極，排列不均勻; 一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻，一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻， 定時(shí)改變電場(chǎng)方向，定時(shí)改變電場(chǎng)方向，DNA分子的凈分子的凈 DNA移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳 移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈45o，在電泳過，在電泳過 過程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備過程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備DNA 程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而

17、樣品增加，品增加， 制備制備DNA樣品與常規(guī)方法樣品與常規(guī)方法不同不同由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場(chǎng)方向、電流大由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場(chǎng)方向、電流大小、以及作用時(shí)間都在交替地變換著，這就使得小、以及作用時(shí)間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)的方向，來適應(yīng)凝分子必須隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量小的與分子量小的DNA分子相比，分子量大的分子相比，分子量大的DNA分分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動(dòng)，所以遷移率就慢，從而達(dá)到夠按新的方向游動(dòng)，所以遷移率就慢，

18、從而達(dá)到了分離大分子量了分離大分子量DNA分子的目的。分子的目的。PFGE can resolve large DNA fragments 垂直脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)垂直脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)(vertical pulsed field) 場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(field inversion) 旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(rotating gel) 箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)(contour-clamped homogeneous electric field)動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)電泳電泳A-+AB-+B垂直交變電場(chǎng)系統(tǒng)垂直交變電場(chǎng)系統(tǒng)場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場(chǎng)系統(tǒng)旋

19、轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+1 1 脈沖時(shí)間脈沖時(shí)間（0.1s-1000s)0.1s-1000s)：增加脈沖時(shí)間分離較增加脈沖時(shí)間分離較大分子，減少脈沖時(shí)間分離較小分子。大分子，減少脈沖時(shí)間分離較小分子。2 2 電壓：電壓：若固定脈沖時(shí)間，增加電場(chǎng)強(qiáng)度就增大若固定脈沖時(shí)間，增加電場(chǎng)強(qiáng)度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場(chǎng)強(qiáng)度了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致較小片段泳動(dòng)的紊亂。會(huì)導(dǎo)致較小片段泳動(dòng)的紊亂。3 電場(chǎng)夾角：電場(chǎng)夾角：電場(chǎng)方向的夾角常為電場(chǎng)方向的夾角常為1100 - 1200，研究證實(shí)研究證實(shí)900夾角也非常有效的。夾角也非常有效的。4

20、溫度：溫度：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳基本在室溫進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳基本在室溫進(jìn)行，PFGE一般應(yīng)在一般應(yīng)在4 進(jìn)行。較高的溫度進(jìn)行。較高的溫度DNA泳動(dòng)較快；但是較高的溫度也引起較小片泳動(dòng)較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動(dòng)截留和明顯的條帶變寬。段的泳動(dòng)截留和明顯的條帶變寬。種類種類 1) 按凝膠材料分按凝膠材料分: 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖) 2) 按電泳裝置分按電泳裝置分: 水平式水平式/瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠; 豎式豎式/聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍兩種方法比較：分離效果

21、和分離范圍; 操作難易操作難易 2. 用途用途 瓊脂糖凝膠用于瓊脂糖凝膠用于DNA和和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序凝膠電泳的一般程序 制膠制膠 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 電泳電泳 染色染色 觀察觀察DNA電泳電泳 1. DNA分子種類分子種類 1) 線狀線狀DNA單鏈與雙鏈，單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成成ds-DNA，造成遷移距離不確定，造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀環(huán)狀DNA單鏈（如單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒）和雙鏈（質(zhì)粒DNA） 3) 線狀線狀ds-DNA電泳

22、電泳使用頻率最高的一種電泳使用頻率最高的一種電泳 這類這類DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個(gè)因分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個(gè)因素的影響：素的影響： i. 分子量分子量 的大小的大小: 遷移距離與分子量的遷移距離與分子量的常用對(duì)數(shù)常用對(duì)數(shù)成反比成反比 ii. 凝膠濃度凝膠濃度: 濃度越高，移動(dòng)距離越短，適合分離低分子量濃度越高，移動(dòng)距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動(dòng)距離越長，適合分離高分子量濃度越低，移動(dòng)距離越長，適合分離高分子量DNAiii.電壓電壓: 低電壓時(shí)，遷移率與低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小不同大小DNA片段遷移率

23、片段遷移率增大是不同的。增大是不同的。iv.堿基組成與溫度堿基組成與溫度: 不受影響不受影響,溫度高可導(dǎo)致溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形帶變形或解鏈?；蚪怄?。4) 環(huán)狀環(huán)狀ds-DNA電泳電泳: 常用于質(zhì)粒常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定的初步鑒定5) 線狀線狀ss-DNA電泳電泳 鏈分離凝膠鏈分離凝膠：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。變性雙鏈，兩條單鏈。 核酸定序凝膠核酸定序凝膠(染料指染料指示劑示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)：為避免局

24、部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）甲胺等）RNA凝膠電泳凝膠電泳 方法：不同的方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且在整個(gè)電泳過程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。而且在整個(gè)電泳過程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。 1. 乙二醛乙二醛/二甲基亞砜法二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是原理：

25、乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止鳥苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生作用發(fā)生 步驟：步驟：RNA+10mM羥甲基醛和羥甲基醛和50% DMSO混合混合 50、1 h變性變性 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 電泳電泳 染色染色 觀察觀察 2. 羥甲基汞法羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。 步驟：步驟：RNA+10mM羥甲基醛羥甲基醛 點(diǎn)樣在含點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上瓊脂糖凝

26、膠上 電泳電泳 染色觀察染色觀察 3. 甲醛法甲醛法 步驟：步驟：RNA+2.2M甲醛甲醛+50%甲胺甲胺 點(diǎn)樣在含點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂甲醛瓊脂糖凝膠上糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳緩沖液電泳 染色觀察染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳電泳. 4. 三種方法的比較三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩

27、種變性劑樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。有毒。蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDS-PAGE。差別：有無變性劑。差別：有無變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中，可直接用用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中，可直接用于酶促反應(yīng)（顏色變化）于酶促反應(yīng)（顏色變化） SDS-PAGE可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測(cè)定?？捎糜诘鞍踪|(zhì)分子量、亞基組成的測(cè)定。mRNA翻翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定等。譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定等。 核酸片段的分離與回收核酸片段的分離與回收

28、 1.方法方法 用于用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收以及蛋白質(zhì)的回收 1) 電洗脫法電洗脫法: 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中；介質(zhì)中； 2) 濾紙法濾紙法 核酸凝膠染色核酸凝膠染色 長波紫外光確定位置長波紫外光確定位置 在分在分離帶前方切一口子并插入濾紙條離帶前方切一口子并插入濾紙條(其背面覆蓋透析袋膜其背面覆蓋透析袋膜) 電泳至電泳至DNA帶全部進(jìn)入濾紙條帶全部進(jìn)入濾紙條 洗脫洗脫DNA 純化、沉淀純化、沉淀 3) 透析袋法透析袋法切下含切下含DNA帶瓊脂塊帶瓊脂塊 放入透析袋，封口放入透析袋，封口 放入電泳槽放入電泳槽 電泳電泳2

29、3小時(shí)至全部小時(shí)至全部DNA離開凝膠塊離開凝膠塊 反向電泳反向電泳1分鐘分鐘 取出取出DNA液液 純化、沉淀純化、沉淀 4) 凍融法凍融法 5) 酶解法酶解法 待回收待回收DNA 切口切口 DNA 切口切口 凝膠塊凝膠塊 濾紙法濾紙法 透析袋透析袋 凝膠塊凝膠塊 待回收待回收DNA DNA 透析袋法透析袋法 待回收待回收DNA 凝膠塊凝膠塊 V-型槽型槽 電洗脫槽法電洗脫槽法 回收回收DNA方法方法 影響回收率的因素影響回收率的因素 1）DNA分子大小分子大小回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)；回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)； 2）乙醇沉淀）乙醇沉淀其中溫度、時(shí)間和其中溫度、時(shí)間和DNA濃度（回收時(shí)體積）

30、濃度（回收時(shí)體積）均與回收率有關(guān)；均與回收率有關(guān)； 3）離心時(shí)間）離心時(shí)間時(shí)間越長，效果越好，對(duì)低濃度時(shí)間越長，效果越好，對(duì)低濃度DNA尤其尤其明顯。明顯?；厥栈厥誅NA片段質(zhì)量片段質(zhì)量 凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽 沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、鹽、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 1.體外擴(kuò)增體外擴(kuò)增 2.通過體外重組和轉(zhuǎn)化，將目的基因在宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)通過體外重組和轉(zhuǎn)化，將目的基因在宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增增 3.在環(huán)境作用下，生物體內(nèi)相關(guān)保衛(wèi)基因的擴(kuò)增。在環(huán)境作

31、用下，生物體內(nèi)相關(guān)保衛(wèi)基因的擴(kuò)增。 4.程序基因擴(kuò)增程序基因擴(kuò)增 5.進(jìn)化過程中的基因擴(kuò)增進(jìn)化過程中的基因擴(kuò)增分子雜交：指具有一定分子雜交：指具有一定同源序列同源序列的兩條核酸單鏈的兩條核酸單鏈（DNA或或 RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過退火處理，形成則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈異質(zhì)雙鏈的過程。由于操作方的過程。由于操作方式相似，通常將檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)也看作是式相似，通常將檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)也看作是分子雜交。分子雜交。作用：用于檢測(cè)混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)作用：用于檢測(cè)混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì) 是是否存在否存在，以及其，以

32、及其相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小。 分類：根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同可分為分類：根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同可分為Southern雜交、雜交、 Northern雜交、雜交、Western雜交。雜交。Southern雜交：雜交： 即即DNA-DNA雜交分析，檢測(cè)樣品中特定雜交分析，檢測(cè)樣品中特定的的DNA及其含量及其含量 。Northern雜交：雜交： 即即RNA-DNA雜交分析。檢測(cè)樣品中是否含有特雜交分析。檢測(cè)樣品中是否含有特定定 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量）及其含量 。Western雜交：雜交： 即利用抗原即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維

33、素 膜上的特異性蛋白質(zhì)。膜上的特異性蛋白質(zhì)。 核酸分子雜交（核酸分子雜交（DNA/DNA or DNA/RNA）技術(shù)）技術(shù) 核酸分子雜交技術(shù)，是在核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（學(xué)院（Cavnegie Institute of Washington）的）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，具有互及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對(duì)補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過程。原則形成雙鏈的過程。 探針探針Hybridization of Nucleic AcidsRNADNA

34、1DNA2DNASouthernhybridizationNorthernhybridizationJuang RH (2004) BCbasics探針探針DNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性1.DNA變性變性定義：氫鍵斷裂，單鏈定義：氫鍵斷裂，單鏈方法方法:熱變性熱變性: 90100 熔解溫度熔解溫度(Tm) 酸堿變性酸堿變性:常采用堿變性常采用堿變性 化學(xué)試劑變性化學(xué)試劑變性;尿素、甲醛等尿素、甲醛等 2.DNA復(fù)性復(fù)性(退火退火)DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA Southern 印跡法印跡法 Northern 印跡法印跡法 斑點(diǎn)印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交 原位雜交原位雜交 Western

35、 印跡法印跡法 液相雜交液相雜交固相雜交固相雜交 雜種核酸分子：雜種核酸分子： 彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，而形彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子。成的雙鏈分子。 DNA/DNA的雜交作用的雜交作用 檢測(cè)特定生物有機(jī)體檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系之間的親源關(guān)系 DND/DNA或或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。中某種特定基因的位置。核酸雜交常用幾種膜的核酸雜交常用幾種膜的性能比較性能比較硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜 不能滯留小于不能滯留小于150bp的的DNA片斷，不能同片斷，不能同RNA結(jié)結(jié)合。合。 應(yīng)用應(yīng)用1mol/L醋

36、酸銨和醋酸銨和0.2mol/L的的NaOH緩沖液緩沖液代替代替SSC緩沖液可改善對(duì)小片斷緩沖液可改善對(duì)小片斷DNA的滯留能力。的滯留能力。 RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。 尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟：尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是上。利用的是 (毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法) 2. 印跡雜交：印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的記的DNA/RNA進(jìn)行雜交。進(jìn)行雜交。1

37、、薩瑟恩、薩瑟恩DNA印跡雜交印跡雜交 根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈標(biāo)記的單鏈DNA或或 RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡印跡雜交技術(shù)。由于它是由雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于于1975年首先設(shè)年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫計(jì)出來的，故又叫Southern DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。 （a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADN

38、A限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片雜交步驟：1.酶切2.電泳3.轉(zhuǎn)膜4.雜交5.顯影Southern BlottingSouthern Blotting的過程的過程1.1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNADNA2.2.通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNADNA3.3.固定膠中的固定膠中的DNADNA4.4.預(yù)雜交、雜交（放射性和熒光檢測(cè)預(yù)雜交、雜交（放射性和熒光檢測(cè)5.5.結(jié)果檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)電轉(zhuǎn)印法電轉(zhuǎn)印法 在理想條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的在理想條件下，應(yīng)用放射

39、性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每帶電泳特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每帶電泳條帶僅含有條帶僅含有2ng的的DNA也能被清晰地檢測(cè)出來也能被清晰地檢測(cè)出來。由于放射性同位素對(duì)人體的危害，近年來又。由于放射性同位素對(duì)人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測(cè)雜交信號(hào)的技術(shù)發(fā)展了熒光法檢測(cè)雜交信號(hào)的技術(shù)，雖然靈敏，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實(shí)驗(yàn)變得更度略低于同位素法，卻使核酸雜交實(shí)驗(yàn)變得更為安全。為安全。 在進(jìn)行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時(shí)，在進(jìn)行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時(shí)， 1. 要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤度下烘烤12小時(shí)；小時(shí)； 2. 紫外線交聯(lián)法，將紫外

40、線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團(tuán)之間進(jìn)殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團(tuán)之間進(jìn)行交聯(lián)。行交聯(lián)。 2、諾賽恩、諾賽恩RNA印跡技術(shù)（印跡技術(shù)（Northern blotting） 1979年，年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將等人發(fā)展而來，是將RNA分子從分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫印跡雜交技術(shù)十分類似，所以

41、叫做諾賽恩做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（印跡技術(shù)（Northern blotting）。）。 而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）。）。 1) 轉(zhuǎn)移的對(duì)象不同，轉(zhuǎn)移的對(duì)象不同，Northern印跡轉(zhuǎn)移的印跡轉(zhuǎn)移的是是RNA，Southern印跡轉(zhuǎn)移的是印跡轉(zhuǎn)移的是DNA。2) 電泳前的處理不同，電泳前的處理不同，RNA在電泳前需要在電泳前需

42、要甲醛變性處理，甲醛變性處理，DNA在電泳前不必變性處在電泳前不必變性處理。理。3) 電泳后的處理不同，電泳后的處理不同，RNA在電泳后可直在電泳后可直接轉(zhuǎn)移到固相支持物上，接轉(zhuǎn)移到固相支持物上，DNA在電泳后需在電泳后需要經(jīng)過堿變性處理及相應(yīng)的中和處理。要經(jīng)過堿變性處理及相應(yīng)的中和處理。 NorthernNorthern印跡雜交法和印跡雜交法和SouthernSouthern印跡雜交法有何不同印跡雜交法有何不同 3、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點(diǎn)印跡雜交（斑點(diǎn)印跡雜交（dot blotting）和狹線印跡雜交）和狹線印跡雜交（slot blotting ）是在）

43、是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測(cè)特定核酸（上發(fā)展的量種類式的快速檢測(cè)特定核酸（DNA和和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾加樣過程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測(cè)樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，多待測(cè)樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測(cè)。適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測(cè)。 通過抽真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核通過抽真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上。酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上。4、菌落雜交、菌落雜交 也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶同濾膜原位結(jié)合，帶有有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的的DNA或或RNA探針雜交。探針雜交。 鑒定重組子。鑒定重組子。檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技檢測(cè)重組