細菌生理檢查法

1、第二章細菌生理學檢查法 第一節(jié)細菌的培養(yǎng)一、培養(yǎng)基及種類二、細菌培養(yǎng)的條件三、細菌的接種與培養(yǎng)第二節(jié)常用培養(yǎng)基的制備一、生化試驗培養(yǎng)基和試劑二、一般培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基及種類根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分： (1)(1)通用培養(yǎng)基通用培養(yǎng)基：培養(yǎng)異氧細菌最常用的培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；配制適合于厭氧菌生長的培養(yǎng)基時，通常須在培養(yǎng)基中加入適量的還原劑如巰基醋酸鈉、維生素c或半胱氨酸來降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，以利于厭氧菌的生長。 (2)(2)鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：是一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應的指示劑，從而達到只需用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌落的培養(yǎng)

2、基。(伊紅美藍瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂、微生物快速顯色培養(yǎng)基） (3)(3)選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基：根據(jù)某微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌。（馬丁氏培養(yǎng)基、ashby無氮培養(yǎng)基）有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分是否完全了解來區(qū)分：根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分是

3、否完全了解來區(qū)分： ）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號等因素的影響。 ）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學成分精確、重復性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只

4、適用于做一些科學研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。 ）半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分： ）液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。 ）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。 ）半固體培養(yǎng)基

5、 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.21%之間。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。培養(yǎng)基制備技術(shù)培養(yǎng)基制備技術(shù) 培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項培養(yǎng)基所用化學藥品均應是化學純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長;因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、ph會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行ph的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低ph0.2，而腸浸液ph卻會有顯著的升高。培養(yǎng)基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內(nèi):液體分裝至試管1/4左右

6、為宜；如固體則分裝量為管高的1/5；半固體培養(yǎng)基，則分裝至試管的1/21/3為宜；錐形瓶分裝培養(yǎng)基時，容量應不超過容積的一半為宜；9cm的培養(yǎng)皿可倒入15ml培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)基可采用121c高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50c左右的培養(yǎng)基中。 滅菌和消毒 消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法， 滅菌是指用物理和化學方法

7、殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。 滅菌和消毒 物理方法物理方法溫度 ：利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒瀯游锏氖w等的滅菌。b.干熱空氣滅菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160c，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。附：電熱恒溫干燥箱（俗稱附：電熱恒溫干燥箱（俗稱“烤

8、箱烤箱”）的使用）的使用 把待滅菌的物品均勻地放入烤箱中，關(guān)上箱門，調(diào)節(jié)溫度至160c，打開電源，待溫度上升至160c時計時，維持該溫度0.5-1小時。注意：多觀察幾次溫度，防止溫度失控。用量較少的實驗室可以做幾個鐵皮筒，蓋子側(cè)面帶孔，滅菌時將孔打開，滅菌冷卻過后將孔關(guān)閉?？梢詫⑽苊恐为氂冒准埌妹撍成希ǚ乐辜埳㈤_來），裝入鐵皮筒滅菌，使用時可以單獨拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可以單獨用白紙包裹用脫水粘上，裝入鐵皮筒滅菌。無菌瓶可以蓋上蓋子，用用白紙包起蓋子，用棉線扎起來，不可以用尼龍線，因為尼龍線不耐高溫，易斷。滅菌和消毒 物理方法物理方法濕熱滅菌法:在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果

9、比干熱滅菌好，這是因為一方面細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。a.巴氏消毒法：有些食物會因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養(yǎng)和風味，又進行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62c，30分鐘既可達到消毒目的。此法為法國微生物學家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死細菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇

10、滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100c，1530分鐘，殺死其中的營養(yǎng)體。然后冷卻，放入37c恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時間長。滅菌和消毒 物理方法物理方法d. 加壓蒸汽滅菌法：把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，水的沸點也隨之提高。在蒸汽壓達到1.055公斤/厘米2時，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達到121c

11、。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在1520分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長滅菌時間。 在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。附：高壓鍋的使用附：高壓鍋的使用打開鍋蓋，取出內(nèi)鍋，觀察水量，補充水量至比墩子略高，將需滅菌的物品放入內(nèi)鍋，蓋上蓋子，對稱旋緊螺栓，關(guān)閉放氣閥，打開電源，待壓力表上指針指向0.05時打開放氣閥放冷氣，等到壓力表上指針指向0時關(guān)閉放氣閥，待壓力表上指針指向0.05時再次打開放氣閥放冷氣，等到壓

12、力表上指針指向0時關(guān)閉放氣閥；冷氣放完后，待壓力表上指針指向0.10時打開放氣閥，等到壓力表上指針指向0時關(guān)閉放氣閥，反復放氣2-3次，最后撥下電源，不打開放氣閥，讓其自然冷卻。取物品時一定要將放氣閥打開，等到壓力表上指針指向0時方可對稱旋松螺栓，打開蓋子取出物品。 滅菌和消毒 物理方法物理方法影響滅菌的因素影響滅菌的因素 a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在5065c，10分鐘就會被殺死；但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱，其中抗熱性最強的是嗜熱脂肪芽孢桿菌，要在121c，12分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感; b.微生物的

13、數(shù)量多少顯然會影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時間越長; c.培養(yǎng)基的成分與組成也會影響滅菌效果。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，ph在7附近，抗熱性最強，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可能對滅菌產(chǎn)生不同的影響；固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時間長。滅菌對培養(yǎng)基成分的影響滅菌對培養(yǎng)基成分的影響 a.ph值普遍下降; b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學反應而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如ca+2與po4-3化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀; c.不少培養(yǎng)基顏色加深; d.體積和濃度有所變化; e.營養(yǎng)成分有時受到破壞。滅菌和消毒 物理方法物理方法輻射：利用輻射進行滅菌消毒，可以避免

14、高溫滅菌或化學藥劑消毒的缺點，所以應用越來越廣，目前主要應用在以下幾個方面：）接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應用紫外線殺菌。）應用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。過濾：采用機械方法，設(shè)計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學成分。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時會給實驗帶來一定的麻煩。滅菌和消

15、毒 化學方法化學方法一般化學藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區(qū)分。消毒劑在低濃度時也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。 微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 接種工具

16、和方法 在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。接種和分離工具 1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)劃線接種： 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。劃線接種，分離純化inoculatin

17、ganagarplatetoobtainsinglecolonies灼燒灼燒微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)斜面接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)細菌的涂布分離技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 液體接種法、穿刺接種穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時要求無菌操作。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、

18、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵酵搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)：除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學或生物學的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，化學或生物學的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用的方法。在進行

19、厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原的方法。在進行厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖美蘭指示劑。美蘭指示劑。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低?；瘜W方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應時吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出

20、密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達到嚴格厭氧目的，常采用物理和化學相結(jié)合并用的方法。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006n naoh 0.015% 美蘭溶液 6 葡萄糖溶液 上列三種溶液在使用時等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小?微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 液體接種法、穿刺接種穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時要求無菌操作。微生

21、物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵酵搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)：除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學或生物學的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，化學或生物學的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的

22、氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用的方法。在進行厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原的方法。在進行厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖美蘭指示劑。美蘭指示劑。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低?；瘜W方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子

23、酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應時吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達到嚴格厭氧目的，常采用物理和化學相結(jié)合并用的方法。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006n naoh 0.015% 美蘭溶液 6 葡萄糖溶液 上列三種溶液在使用時等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小?微生物細胞大小和數(shù)量的測定目的要求：學習使用目鏡測微尺和鏡臺測微尺在顯學習使用目鏡測微尺和鏡臺測微尺在顯微鏡下測定微生物大小的

24、方法；學習使用血球記數(shù)微鏡下測定微生物大小的方法；學習使用血球記數(shù)板測定微生物數(shù)量的方法。板測定微生物數(shù)量的方法。實驗材料：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、細顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、細菌染色片、血球記數(shù)板、酵母菌懸液、蓋玻片、無菌染色片、血球記數(shù)板、酵母菌懸液、蓋玻片、無菌滴管、西水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯菌滴管、西水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯測定微生物的大小測定微生物的大小 測定的工具：目鏡測微尺測定的工具：目鏡測微尺 鏡臺測微尺鏡臺測微尺測定微生物的大小測定微生物的大小 目鏡測微尺的校正：在高倍鏡下，看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器

25、，使目鏡測微尺的0點與鏡臺測微尺的某一刻度重合，然后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度。計算兩刻度間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。由于鏡臺測微尺的刻度每格長10m，所以可得： 目鏡測微尺每格長度（目鏡測微尺每格長度（m m）= =（鏡臺測微尺格數(shù)（鏡臺測微尺格數(shù)1010）/ /目鏡測微尺格數(shù)目鏡測微尺格數(shù) 注意：校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的接物鏡、接目鏡、鏡筒長度等）進行，而且只能在這特定的情況下才可重復使用。菌體大小的測定：取下鏡臺測微尺，將細菌染色標本置于載物臺上，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的長和寬。測定微生物數(shù)量測定微生物數(shù)量方法：活菌計數(shù)法方法：活菌計數(shù)

26、法平板菌落計數(shù)法；總菌計數(shù)法平板菌落計數(shù)法；總菌計數(shù)法血球計數(shù)板或霍瑟血球計數(shù)板或霍瑟（peroff hausserperoff hausser）細菌計數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而）細菌計數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。已）。 測定微生物數(shù)量測定微生物數(shù)量本實驗用血球計數(shù)板計數(shù)酵母菌的數(shù)量 取清潔無油的血球計數(shù)板，在計數(shù)室上面加蓋玻片。 取酵母菌液，搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。靜止5min后，用低倍鏡觀察并將計數(shù)室移至視野中央。 高倍鏡下計數(shù)：隨機計數(shù)五個中格的平均值，然后求得每個中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中

27、的總菌數(shù)，最后再換算到每ml菌液中的含菌數(shù)。計算方法：注意事項：壓在方格線上的菌體，以壓在底線和右側(cè)線上的菌體計入本格內(nèi)；遇到有芽體的酵母時，若芽體和母體同等大，就按單個酵母計數(shù)。計數(shù)完畢后，血球計數(shù)板要立即清洗干凈，并用吸水紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內(nèi)。（x1+x2+x3+x4+x5）5 25（或（或16）10 1000 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 酵母菌細胞數(shù)酵母菌細胞數(shù)/ml=細菌生理學檢查法微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長出孢子，貼上標簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙

28、或防水紙包好，放入40c冰箱中保藏。一般每隔3個月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡便，實驗室均采用。 缺點：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化缺點：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。石蠟封藏法：石蠟封藏法：在已長好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細菌和放線菌。 石蠟的處理：250ml三角瓶裝100ml液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050c左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。砂土管保藏法：砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細菌）。 1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過篩，出去大顆粒，加10hcl后煮沸30

29、min，除去有機質(zhì)（也可用10hcl浸泡24h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃土若干，曬干磨細，過120目篩。 2.按 土：砂1：4 的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，1601700c干熱滅菌2h。 3.在新鮮菌種斜面上加入3ml左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取0.20.3ml的菌懸液放入每個砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標簽，注明菌名。 4.菌液加好后，立即進行抽真空干燥，要求在24h內(nèi)抽干，尤其是夏天要求較短時間內(nèi)抽干。搖散砂土，放干燥器內(nèi)冰箱保藏。 冷凍真空干燥保藏法：冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護劑。細菌生理學檢查法微生物生化反應生化反應來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。 糖酵解試驗 淀粉水解試驗 v-p試驗甲基紅（m