熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則

1、1. 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用dnaman,alignment 軟件 看看結(jié)果。2. 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61kj/mol）。3.引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。4.g+c含量在40%60%之間，45-55最佳。5.堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。8.引物5端可以修飾。9.3端不可修飾，而且要避開(kāi)at,gc rich的區(qū)域，避開(kāi)t/c,a/g連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個(gè)）。10. 引物3端要避開(kāi)密碼子的第3位。11.引物整

2、體設(shè)計(jì)自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于9kj/mol。可用oligo 6 軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。12.做熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好，最長(zhǎng)是300bp.13.引物設(shè)計(jì)避免dna污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。14.引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。15.查看有無(wú)假基因的存在。假基因就是無(wú)功能的dna序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度相似。16.tm值在58-62度之間。17.引物設(shè)計(jì)的軟件primer 5.0 有專門針對(duì)熒光的。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過(guò)使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取

3、得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理： 引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為1830堿基?？偟恼f(shuō)來(lái)，決定引物退火溫度（tm值）最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。在引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí)：4(g+c)+2(a+t)-5在引物長(zhǎng)度大于20bp時(shí)：62.3+0.41(%g-c)-500/length-5另外有許多軟件也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理會(huì)各有不同，因此有時(shí)計(jì)算出的數(shù)值可能會(huì)有少量差距。為了優(yōu)化pcr反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54的最短的引物可獲得最好的效率和特異性?？偟恼f(shuō)來(lái)，每增加一個(gè)核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。

4、引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶dna上形成供dna聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。 gc含量一般引物序列中g(shù)+c含量一般為40%60%，一對(duì)引物的gc含量和tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的gc傾向或at傾向則可以在引物5端加適量的a、t或g、c尾巴。 退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低5，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使pcr的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是dna雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差46不會(huì)影響pcr的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在5575間變化。 避免擴(kuò)

5、增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（g）小于58.6lkj/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧gtp取代dgtp對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 與靶dna的錯(cuò)配當(dāng)被擴(kuò)增的靶dna序列較大的時(shí)候，一個(gè)引物就有可能與靶dna的多個(gè)地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用blast軟件進(jìn)行檢測(cè)，網(wǎng)址：/blast/。選擇align two sequences (bl2seq)，如

6、下圖。blast的使用方法也十分簡(jiǎn)單，如下圖所示。將引物序列粘貼到1區(qū)，將靶dna序列粘貼到2區(qū)，這兩者可以互換的，并且blast會(huì)計(jì)算互補(bǔ)、反義鏈等多種可能，所以不需要用戶注意兩條鏈?zhǔn)欠穸际怯辛x鏈。如果知道序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中的gi號(hào)也可以直接輸入gi號(hào)，這樣就不用粘貼一大段的序列了。最后在3處點(diǎn)擊align就可以查看引物在靶dna中是否有多個(gè)同源位點(diǎn)了。可是使用blast還是有其不方便的地方。因?yàn)樗淮沃荒鼙容^兩條序列，那么一對(duì)引物就需要分開(kāi)進(jìn)行比對(duì)。如果存在錯(cuò)配，還需要自己計(jì)算由于錯(cuò)配形成的片段長(zhǎng)度有多大。在下一篇中將介紹一個(gè)軟件，可以直接將靶dna和引物輸入對(duì)產(chǎn)物片段進(jìn)行預(yù)測(cè)。 引物末端引物

7、3端是延伸開(kāi)始的地方，因此要防止錯(cuò)配就從這里開(kāi)始。3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的g或c，因這樣會(huì)使引物在g+c富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的pcr（as-pcr）反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4

8、個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合dna序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)摹盃奚?。很多時(shí)候pcr只是初步克隆，之后我們還需要將目的片段亞克隆到各種載體上，那么就需要在pcr這個(gè)步驟為下一步的操作設(shè)計(jì)額外的堿基。以下總結(jié)一些為了亞克隆所要設(shè)計(jì)的序列。a 添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn)是將pcr產(chǎn)

9、物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點(diǎn)是六個(gè)堿基，另外在酶切位點(diǎn)的5端還需要加23個(gè)保護(hù)堿基。但是不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目是不相同的，例如：sal不需要保護(hù)堿基，ecor需要1個(gè)，not需要2個(gè)，hind 3個(gè)。其中，在原核表達(dá)設(shè)計(jì)引物時(shí)還有一些小技巧，大家可以參考：原核表達(dá)之實(shí)驗(yàn)前的分析。里面一些規(guī)則是所有表達(dá)都通用的。有一種做法是在進(jìn)行pcr反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在pcr反應(yīng)中的酶切反應(yīng)率，見(jiàn)附錄。不過(guò)這種方法雖然方便但并不推薦。有時(shí)候，就是把pcr產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進(jìn)行會(huì)使出現(xiàn)問(wèn)題的原因變得更加復(fù)雜。一旦出現(xiàn)問(wèn)題，分析起來(lái)更麻煩。b

10、 lic添加尾巴lic的全稱是ligation-independent cloning，它是navogen公司專門為其部分的pet載體而發(fā)明的一種克隆方法。用lic 法制備的pet 載體有不互補(bǔ)的1215 堿基單鏈粘端，與目的插入片段上相應(yīng)粘端互補(bǔ)。擴(kuò)增目的插入片段的引物5序列要與lic載體互補(bǔ)。t4 dna 聚合酶的35外切活性經(jīng)短時(shí)間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖俑咝?，而且為定向克隆。c 定向ta克隆添加尾巴在t載體剛出的時(shí)候大家都拍手稱贊，真是方便，哪個(gè)小子腦子這么聰明想出來(lái)的。但是后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)ta克隆無(wú)法將片段定向克隆到載體中，所以后來(lái)invitrogen推出了可以定向克隆的載體，它的一端含有四個(gè)突出的堿基gtgg。因此在pcr引物設(shè)計(jì)時(shí)也要相應(yīng)的加上與之互補(bǔ)的序列，這樣片段就可以“有方向”了。d in-fusion克隆方法這項(xiàng)技術(shù)是clontech還屬于bd的時(shí)候推出的。此技術(shù)就其步驟來(lái)說(shuō)是及其方便的，不需連接酶，不需長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)。只要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候引入一段線性化載體兩端的序列，然后將pcr產(chǎn)物和線性化的載體加入到含有bsa的in-fusion酶溶液中，在室溫下放置半個(gè)小時(shí)就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化了。這種方法特別適合大批量的轉(zhuǎn)化。如果要加入額外的堿基總是或多或少會(huì)影