構(gòu)建葉酸修飾的乳腺癌靶向納米超聲造影微粒

1、www.CRTER.org陳園園，等. 構(gòu)建葉酸修飾的乳腺癌靶向納米超聲造影微粒構(gòu)建葉酸修飾的乳腺癌靶向納米超聲造影微粒陳園園1，徐 楓1，楊 輝2，劉 婷1，周建橋3，蔡晨蕾4，葉園園1，劉培峰4，韓寶三1(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院普外科、普外科實(shí)驗(yàn)室，上海市 200092；2教育部高分子合成與功能構(gòu)造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)系，浙江省杭州市 310027；3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院超聲科，上海市 200025；4上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海市 200127)引用本文：陳園園，徐楓，楊輝，劉婷，周建橋，蔡晨蕾，葉園園，劉培峰，韓寶三. 構(gòu)建葉酸修

2、飾的乳腺癌靶向納米超聲造影微粒J.中國組織工程研究，2016，20(30):4425-4433.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.30.003 ORCID: 0000-0002-0322-5403(韓寶三)文章快速閱讀：乳腺癌靶向納米超聲造影微粒的構(gòu)建陳園園，女，1989年生，江蘇省泗洪縣人，漢族，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在讀碩士，醫(yī)師，主要從事乳腺癌的臨床與基礎(chǔ)及納米材料的研究。通訊作者：韓寶三，主任醫(yī)師，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院普外科、普外科實(shí)驗(yàn)室，上海市 200092中圖分類號:R318文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2016)30-044

3、25-09稿件接受：2016-05-18逐滴加入40 L液態(tài)氟碳，超聲波細(xì)胞粉粹儀震蕩，超聲強(qiáng)度400 W，超聲時間每次為10 s，共8次再加入2 mL F68 (1%)溶液， 超聲強(qiáng)度400 W，時間設(shè)為每次為10 s，共8次真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得造影微粒葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒稱取葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物4 mg，充分溶于200 L二氯甲烷文題釋義：納米級超聲對比劑：具有較強(qiáng)的穿透能力，能夠穿越血管內(nèi)皮進(jìn)入組織間隙，使血管外靶組織顯像成為可能，從而超越了微米級對比劑僅能發(fā)生血池內(nèi)顯像的局限性，推動了超聲分子顯像技術(shù)的發(fā)展，特別是針對腫

4、瘤等重大疾病的早期診斷技術(shù)；使構(gòu)建納米級靶向超聲對比劑成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。超聲靶向分子成像技術(shù)：是利用對比劑表面固有的化學(xué)特性或通過對對比劑表面進(jìn)行特殊處理，構(gòu)建特異性靶向超聲對比劑，使其經(jīng)靜脈注入后能靶向性聚集并較長時間滯留于靶組織器官，再通過超聲對比顯影，產(chǎn)生分子水平顯影，提高超聲對早期病變的診斷及鑒別能力。摘要背景：研究表明，納米級超聲對比劑具有較強(qiáng)的穿透能力，使血管外靶組織顯像成為可能，超越了微米級對比劑僅能發(fā)生血池內(nèi)顯像的局限性。目的：構(gòu)建葉酸修飾的乳腺癌靶向納米超聲造影微粒，評估其與細(xì)胞靶向結(jié)合的能力及體外超聲成像效果。方法：采用超聲乳化-蒸發(fā)法制備對比劑聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共

5、聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒(記為mPP/PFOB)和葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒(記為mPPF/PFOB)。生物相容性檢測：取對數(shù)生長期的人皮膚成纖維細(xì)胞HFF-1、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，分別加入0，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，1 g/L的mPP/PFOB或mPPF/PFOB，培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞活力。體外尋靶能力檢測：取對數(shù)生長期的HFF-1、MCF-7細(xì)胞，均分3組干預(yù)，A、B組分別加入Cy5標(biāo)記的mPP/PFOB與mPPF/PFOB，C組在加入Cy5標(biāo)記的mPP/PFOB前以葉酸處理2 h，培養(yǎng)0.5 h后，流式細(xì)胞儀檢測熒光

6、強(qiáng)度；培養(yǎng)20 min后，共聚焦顯微鏡觀察對比劑在細(xì)胞中的分布。體外超聲顯影：實(shí)驗(yàn)分3組，A組為生理鹽水，B組制備 mPPF/PFOB納米粒與生理鹽水混懸液，C組以 mPPF/PFOB納米粒與生理鹽水混懸液重懸MCF-7細(xì)胞沉淀，制備納米粒與細(xì)胞混懸液，將3種液體加入乳膠手套中扎緊，采用超聲診斷儀檢測體外超聲成像效果。結(jié)果與結(jié)論：生物相容性檢測結(jié)果：兩種納米粒無明顯的細(xì)胞毒性；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：在MCF-7細(xì)胞中，B組平均熒光強(qiáng)度明顯高于A組和C組；而在HFF-1細(xì)胞中，3組平均熒光強(qiáng)度無顯著差別；共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果：mPPF/PFOB主要聚集在MCF-7細(xì)胞膜周圍，mPP/PFOB則分布

7、在胞漿。體外超聲顯影結(jié)果：mPPF/PFOB與MCF-7細(xì)胞結(jié)合后，在體外能增強(qiáng)超聲回聲；結(jié)果提示：葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒具有良好的生物相容性，具有與乳腺癌MCF-7細(xì)胞靶向結(jié)合能力和增強(qiáng)超聲顯像效果。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083關(guān)鍵詞：生物材料；納米材料；納米粒；聚乙二醇；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；葉酸受體；超聲診斷；靶向?qū)Ρ葎?；乳腺癌；國家自然科學(xué)基金主題詞：納米粒；超聲檢查；造影劑；組織工程 基金資助：國家自然科學(xué)基金(81172078)，寧波市社會發(fā)展重大擇優(yōu)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012C5013)Che

8、n Yuan-yuan, Studying for masters degree, Physician, Department of General Surgery, General Surgery Laboratory, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, ChinaCorresponding author: Han Bao-san, Chief physician, Department of General Surgery, Genera

9、l Surgery Laboratory, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, ChinaConstruction of folate-modified nanoparticles as ultrasound contrast agent targeting breast cancerChen Yuan-yuan1, Xu Feng1, Yang Hui2, Liu Ting1, Zhou Jian-qiao3, Cai Chen-lei4,

10、Ye Yuan-yuan1, Liu Pei-feng4, Han Bao-san1 (1Department of General Surgery, General Surgery Laboratory, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, China; 2Key Laboratory of Macromolecular Synthesis and Functionalization of Ministry of Education, Dep

11、artment of Polymer Science and Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China; 3Department of Ultrasound, Affiliated Ruijin Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; 4Medical Science Research Center, Affiliated Renji Hospital, Med

12、ical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China)AbstractBACKGROUND: Studies have testified that nano-ultrasound contrast agents have a strong permeability, making it possible to image the targeted tissues outside blood vessels and overcome the limitation that micron contrast age

13、nts are only available for the blood pool imaging.OBJECTIVE: To construct the folate-modified nanoparticles targeting breast cancer as ultrasound contrast agents, as well as to observe their ability to specifically bind to cells and imaging effect in vitro.METHODS: Both contrast agents, pegylated la

14、ctic acid-glycolic acid copolymer wrapping liquid fluorocarbon formed nanoparticles (mPP/PFOB) and folate modified pegylated lactic acid-glycolic acid wrapping liquid fluorocarbon formed nanoparticles (mPPF/PFOB), were constructed by phacoemulsification-evaporation method. (1)Biocompatibility detect

15、ion: HFF-1 and MCF-7 cells in the logarithmic phase were cultivated with various concentrations (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 and 1 g/L) of mPP/PFOB or mPPF/PFOB for 24 hours respectively, and then the cell viability was measured. (2)Targeting ability detection in vitro: HFF-1 and MCF-7 cell

16、s in the logarithmic phase were divided into three groups. Cy5-labled mPP/PFOB and mPPF/PFOB were added into groups A and B, respectively; the cells in group C were pretreated with folate for 2 hours, and sequentially Cy5-labled mPPF/PFOB was added into group C. Fluorescence intensity was detected b

17、y flow cytometry after 0.5 hours of culture. The distribution of contrast agents in cells was observed using confocal microscopy after 20 minutes of culture. (3)Ultrasound imaging in vitro: there were three groups: saline was as group A; the suspension of saline and mPPF/PFOB nanoparticles was prepa

18、red as group B; MCF-7 cells were resuspended with the mixture of saline and mPPF/PFOB nanoparticles to prepare the suspension of nanoparticles and cells as group C. In each group, the suspension was added into latex gloves, that were then tightened and immersed in water. Finally, the ultrasound was

19、use to detect the ultrasound imaging effect in vitro.RESULTS AND CONCLUSION: Neither nanoparticles were with significant cytotoxicity. The flow cytometry showed that the mean fluorescence intensity in MCF-7 cells of group B was significantly higher than that of groups A and C. But there were no sign

20、ificant differences in the mean fluorescence intensity in HFF-1 cells among the three groups. It was observed that mPPF/PFOB mainly gathered around the MCF-7 cell membrane, while mPP/PFOB randomly distributed in the cytoplasm. After mPPF/PFOB binding to MCF-7 cells, they could enhance ultrasound ech

21、o in vitro. These findings indicate that the targeted nanoparticles mPPF/PFOB have good biocompatibility and can specifically bind to breast cancer MCF-7 cells in vitro and enhance the imaging capability.Subject headings: Nanoparticles; Ultrasonography; Contrast Media; Tissue EngineeringFunding: the

22、 National Natural Science Foundation of China, No. 81172078; Major Science and Technology Project of Ningbo Social Development, No. 2012C5013Cite this article: Chen YY, Xu F, Yang H, Liu T, Zhou JQ, Cai CL, Ye YY, Liu PF, Han BS. Construction of folate-modified nanoparticles as ultrasound contrast a

23、gent targeting breast cancer. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(30):4425-4433.4431ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位，死亡率占第2位，嚴(yán)重威脅女性的身心健康1。乳腺癌的早期診斷和早期治療是提高治愈率和降低死亡率的關(guān)鍵。研究表明，早期乳腺癌的治愈率可達(dá)90%以上，并且早期乳腺癌患者可進(jìn)行保乳根治手術(shù)，可顯著減輕對女性身心造成的創(chuàng)傷。如何無創(chuàng)傷性提高早期乳腺癌診斷的準(zhǔn)確性，已成為當(dāng)今乳腺惡

24、性腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。目前，臨床使用的常規(guī)超聲對比劑(如聲諾維)對良惡性乳腺腫瘤的判定有良好的靈敏度和特異性，顯著提高了乳腺癌診斷的正確性，但仍然存在很多局限性2-5。它們粒徑多數(shù)為微米級，只能在腫瘤組織毛細(xì)血管中循環(huán)，不能透過血管內(nèi)皮間隙，屬于血管池顯像6，非腫瘤特異性成像；乳腺癌等實(shí)性腫瘤超早期靠周圍組織供血，在癌組織較小(體積2.0-3.0 mm3)的無血管期容易被漏診，無法實(shí)現(xiàn)腫瘤超早期的準(zhǔn)確診斷及鑒別診斷。超聲靶向分子成像技術(shù)及納米生物技術(shù)的迅猛發(fā)展和學(xué)科的交叉滲透，為克服這些不足提供了新的研究思路。超聲靶向分子成像技術(shù)是利用對比劑表面固有的化學(xué)特性或通過對對比劑表面進(jìn)行特殊處理，構(gòu)

25、建特異性靶向超聲對比劑，使其經(jīng)靜脈注入后能靶向性聚集并較長時間滯留于靶組織器官，再通過超聲對比顯影，產(chǎn)生分子水平顯影，提高超聲對早期病變的診斷及鑒別能力。研究表明，疾病(如腫瘤)狀態(tài)中血管內(nèi)皮細(xì)胞連接存在缺陷，內(nèi)皮間隙可允許直徑小于700 nm的顆粒穿過，這為納米級超聲對比劑應(yīng)用于血管外靶組織顯像、實(shí)現(xiàn)病變組織特異性診斷提供了理論基礎(chǔ)。葉酸受體是一種通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜上的糖蛋白7，在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在乳腺癌8-10、卵巢癌11、子宮內(nèi)膜癌12、肺腺癌等腫瘤中過度表達(dá)13。與抗體類大分子相比，葉酸免疫原性低，生物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于修飾，相對分子質(zhì)量小，穿透能力強(qiáng)，能很快滲

26、透到實(shí)體腫瘤中；葉酸-葉酸受體的結(jié)合具有高度親和力，且葉酸的羧基與其他分子偶聯(lián)后仍能保持與葉酸受體的高親和性，這些優(yōu)點(diǎn)使得葉酸成為目前腫瘤診斷和治療的理想靶向載體14-22。聚乳酸-羥基乙酸共聚物是一種具有良好生物相容性、可生物降解、無毒的高分子化合物23-24，已通過美國的FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典，具有良好的成囊、成膜性能和特有的機(jī)械強(qiáng)度，已成為目前超聲對比劑和藥物載體研制中最具前途的材料25-26。以可生物降解的高分子多聚物為疏水段與水溶性好、柔性好、低免疫原性的聚乙二醇等組成的兩親性兩嵌段共聚物，因有疏水段和親水段而具有類似非離子表面活性劑的性質(zhì)，在水中能自發(fā)形成具有

27、極穩(wěn)定殼-核結(jié)構(gòu)的有序聚集體-膠束。Rapoport等27用兩嵌段共聚物聚乙二醇-聚乳酸作為成膜材料制成能發(fā)生氣液相變的納米泡，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)穩(wěn)定，長循環(huán)，通過被動靶向到達(dá)腫瘤組織間隙后，在超聲誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)變成微泡，增強(qiáng)成像效果。因此實(shí)驗(yàn)采用具有多模態(tài)造影潛能的液態(tài)氟碳作為納米粒的核，用葉酸修飾的聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物作納米粒殼膜，擬構(gòu)建一種新型的葉酸修飾乳腺癌靶向的納米超聲對比劑，并探討其細(xì)胞毒性，體外尋靶能力及顯像效果；為乳腺癌等葉酸受體陽性腫瘤的早期診斷和靶向治療提供有益借鑒。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 觀察性實(shí)驗(yàn)。1.2 時間及地點(diǎn) 實(shí)

28、驗(yàn)于2014年11月至2015年12月在上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室、仁濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及教育部高分子合成與功能構(gòu)造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 對比劑的制備與表征 采用超聲乳化-蒸發(fā)法制備納米粒28-29，具體步驟如下：稱取葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物4 mg，充分溶于200 L二氯甲烷。逐滴加入40 L液態(tài)氟碳，超聲波細(xì)胞粉粹儀震蕩，超聲強(qiáng)度400 W，超聲時間每次為10 s，共8次。再加入2 mL F68(1%)溶液，超聲強(qiáng)度400 W，時間設(shè)為每次為10 s，共8次。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得造影微粒葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟

29、碳的納米粒(記為mPPF/PFOB)。將步驟中的葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物換為聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物，以相同方法制備造影微粒聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒(記為mPP/PFOB)。熒光染料Cy5-NHS標(biāo)記的納米粒的制備步驟如下：稱取葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物 4 mg，充分溶于180 L二氯甲烷。逐滴加入20 L Cy5-NHS (濃度為10 mg/L)，充分混勻。之后重復(fù)上述的第2-4步，即可制得Cy5標(biāo)記的Cy5/mPPF/PFOB和Cy5/mPP/ PFOB納米粒。取適量納米粒懸液稀釋一定倍數(shù)，用激光粒徑儀檢測其粒徑和表面電位，顯微鏡

30、和透射電鏡觀察其形態(tài)。葉酸修飾的靶向納米超聲造影劑制備及性能研究所需的主要材料、試劑和儀器：材料、試劑與儀器來源聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乙二醇乙二胺西安瑞禧生物有限公司葉酸中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物、葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室Cyanine5 NHS ester美國Lumiprobe公司二氯甲烷重慶川江化學(xué)試劑廠PluronicF68(F68)德國BASF公司胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA美國Gibco公司PFOBTCI公司葉酸受體抗體、山羊抗小鼠二抗英國abcam公司JEM-123

31、0透射電子顯微鏡日本JEOL公司JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀寧波新芝生物科技股份有公司精密電子天平北京賽多利思科學(xué)儀器有限公司Zetasizer Nano 分析儀英國馬爾文儀器有限公司激光共聚焦顯微鏡Carl Zeiss Jena公司流式細(xì)胞儀BD公司SpectraMax 190型全波長酶標(biāo)儀美谷分子儀器（上海）有限公司TGL-16B臺式離心機(jī)上海精密儀表有限公司真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司DAPI、40 g/L多聚甲醛上海碧云天生物技術(shù)有限公司飛利浦IU22型超聲診斷儀德國西門子股份有限公司1.3.2 納米粒的細(xì)胞相容性檢測細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)：人皮膚成纖維細(xì)胞HFF-1及人乳腺癌細(xì)

32、胞MCF-7、MDA-MB-231購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫(上海)。將HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基；將培養(yǎng)皿置于37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。每三四天傳代1次，傳代時用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)葉酸受體蛋白的相對含量：收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床孵育1.5 h，TBST漂洗3遍，

33、加入小鼠源性一抗(抗FR 1500，抗-actin 11 000)，4 孵育過夜。次日TBST漂洗3遍，加入山羊抗小鼠的二抗(11 000)室溫?fù)u床孵育1 h，TBST漂洗3遍，ECL顯色。以-actin作為內(nèi)參。CCK8法檢測細(xì)胞活力：將對數(shù)生長期的HFF-1、MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，每孔5103個細(xì)胞，培養(yǎng) 24 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)組分別加入質(zhì)量濃度為0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，1 g/L的mPP/PFOB或mPPF/PFOB，對照組不加對比劑，空白組不加對比劑和細(xì)胞，每組設(shè)3個平行孔。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8溶液10 L，繼

34、續(xù)培養(yǎng)3 h。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測每孔的吸光度值(A450 nm)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其均值。使用GraphPad Prism 5.0軟件作細(xì)胞活力曲線時，橫坐標(biāo)采用各個濃度Log10的值。細(xì)胞活力=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)100%1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測納米粒與細(xì)胞的黏附結(jié)合能力 將葉酸受體陰性的HFF-1細(xì)胞和葉酸受體陽性的MCF-7細(xì)胞均分為3組，分別為A組、B組及C組。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，每孔5104個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行處理。A組、B組分別加入熒光染料Cy5標(biāo)記的納米粒mPP/PFOB、mPPF/PFOB，C組在加入Cy5標(biāo)

35、記的納米粒mPPF/PFOB前用葉酸預(yù)處理2 h，納米粒終質(zhì)量濃度為0.1 g/L；共孵育0.5 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕吹打洗滌3次，胰酶消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，PBS洗滌2次后重懸于300 L緩沖液內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞攝取Cy5標(biāo)記的納米粒后的平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為633 nm，發(fā)射光波長為670 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。激光共聚焦顯微鏡觀察對比劑在細(xì)胞中的分布情況：將葉酸受體陰性的HFF-1細(xì)胞和葉酸受體陽性的MCF-7細(xì)胞均分為3組，分別為A組、B組及C組。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于已放有小圓玻片的24孔板，每孔5103個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞

36、貼壁后進(jìn)行處理。A組、B組分別加入熒光染料Cy5標(biāo)記的納米粒mPP/PFOB、mPPF/PFOB，C組在加入mPPF/PFOB前用葉酸預(yù)處理2 h，對比劑終濃度為0.1 g/L；共孵育20 min后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕吹打洗滌3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min后，0.5%Trton透化10 min，PBS洗滌1次，DAPI染色15 min，PBS洗滌2次，抗淬滅劑封固后暗盒保存，于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組對比劑在細(xì)胞中的分布情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.4 靶向?qū)Ρ葎w外超聲顯影 實(shí)驗(yàn)分為3組，A組取4 mL生理鹽水加入乳膠手套中扎緊；B組將mPPF/ PFOB納米粒與生理鹽水混

37、合，制備0.2 mg/L混懸液，取4 mL該混懸液加入乳膠手套中扎緊；C組以B組中制得的混懸液重懸MCF-7細(xì)胞沉淀，制備納米粒與細(xì)胞混懸液，置于37 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育15 min，取4 mL混懸液輕輕吹勻后加入乳膠手套中扎緊；將上述3組手套分別固定在25 水中，使用飛利浦超聲診斷儀IU22，L9-3型探頭，頻率4 MHz的寬頻基波成像。淺表器官常規(guī)設(shè)置，機(jī)械指數(shù)為0.05，采用實(shí)時造影匹配成像技術(shù)檢測納米粒的超聲顯影性能，用超聲儀內(nèi)部工作站存儲圖像資料。1.4 主要觀察指標(biāo) 葉酸修飾的乳腺癌靶向納米超聲造影微粒與細(xì)胞靶向結(jié)合的能力以及體外超聲成像的效果。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用G

38、raphPad Prism 5.0軟件(La Jolla，CA，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以s表示，兩組間均數(shù)比較用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05，P 0.05)，此結(jié)果與顯微鏡下觀察結(jié)果一致；而在相同時刻mPPF/PFOB納米粒的平均粒徑均較mPP/PFOB略大，而mPPF/PFOB納米粒Zeta電位的絕對值均較mPP/PFOB小(P 0.05)。透射電鏡觀察納米粒為大小較均勻的球形，平均直徑小于1 000 nm，直徑大小與粒徑儀器檢測結(jié)果相吻合(圖1C，D)。納米粒Cy5/mPPF/PFOB及Cy5/mPP/PFOB的粒徑及Zeta電位如表

39、2所示，檢測結(jié)果顯示，Cy5/mPPF/ PFOB納米粒的平均粒徑較Cy5/mPP/PFOB略大，Cy5/mPPF/ PFOB納米粒Zeta電位的絕對值較Cy5/mPP/PFOB小(P 0.05)。2.2 細(xì)胞內(nèi)葉酸受體蛋白相對表達(dá)量 如圖2所示，葉酸受體蛋白在人成纖維細(xì)胞HFF-1中的表達(dá)量很低，而乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231內(nèi)葉酸受體的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HFF-1細(xì)胞的表達(dá)量。研究之后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以HFF-1為葉酸受體表達(dá)陰性細(xì)胞的代表，以MCF-7細(xì)胞為葉酸受體表達(dá)陽性細(xì)胞的代表。2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測HFF-1、MCF-7細(xì)胞與不同濃度mPP/PFOB

40、、mPPF/PFOB共孵育24 h后細(xì)胞的活力，來評估m(xù)PP/PFOB、mPPF/PFOB的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，在對比劑質(zhì)量濃度低于0.2 g/L的低濃度時，兩種細(xì)胞的活力均在90%以上；即使在對比劑為高質(zhì)量濃度1 g/L時，兩種細(xì)胞的活力仍在75%以上，結(jié)果見圖3；提示小劑量對比劑mPP/PFOB、mPPF/PFOB沒有明顯的細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性。2.4 納米粒體外尋靶能力的檢測 用流式細(xì)胞儀檢測Cy5標(biāo)記mPP/PFOB和mPPF/PFOB對比劑與HFF-1、MCF-7細(xì)胞的黏附結(jié)合能力，細(xì)胞內(nèi)攝取或者表面黏附的對比劑越多，所檢測細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度越強(qiáng)30。檢測結(jié)果如圖4a所示：

41、在HFF-1細(xì)胞中，3組平均熒光強(qiáng)度無明顯差別(P 0.05)；而在MCF-7細(xì)胞中，B組的平均熒光強(qiáng)度明顯高于A組和C組，且C組熒光強(qiáng)度顯著低于A組(F=129.8，P 0.05)；而在MCF-7細(xì)胞中，B組熒光強(qiáng)度明顯高于A組和C組，且C組熒光強(qiáng)度顯著低于A組(F=129.8，P 0.001)。b為激光共聚焦顯微鏡觀察對比劑在HFF-1、MCF-7細(xì)胞中的分布情況，兩種對比劑均無規(guī)則地分散在HFF-1細(xì)胞漿中，且葉酸不能有效阻止靶向?qū)Ρ葎┤~酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒與HFF-1細(xì)胞的結(jié)合；而在MCF-7細(xì)胞中，聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒對

42、比劑無規(guī)則地分布于細(xì)胞漿內(nèi)，葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒對比劑主要黏附在細(xì)胞表面，沿細(xì)胞膜較規(guī)則地排列呈花環(huán)狀圍繞在核周，且葉酸可有效阻止靶向?qū)Ρ葎┙Y(jié)合至細(xì)胞表面。HFF-1 MDA-MB-231 MCF-7葉酸受體-actin圖5 葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒對比劑體外超聲顯影Figure 5 The ultrasound imaging in vitro of folate-modified pegylated lactic acid-glycolic acid wrapping liquid fluorocarbon forme

43、d nanoparticles圖注：圖中A為單純生理鹽水，無回聲信號；圖B為加入對比劑的生理鹽水，顯像效果僅稍微增強(qiáng),表現(xiàn)為少許點(diǎn)狀強(qiáng)回聲；圖C為加入MCF-7細(xì)胞后，葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒對比劑回聲則明顯增強(qiáng)，顯示為密集的點(diǎn)狀強(qiáng)回聲。圖2 HFF-1、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中葉酸受體的蛋白表達(dá)量Figure 2 Protein expression of folate receptor in HFF-1, MDA-MB-231 and MCF-7 cells圖注：圖中-actin為內(nèi)參，葉酸受體蛋白在HFF-1中的表達(dá)量很低，而在MCF-7和

44、MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)。表1 納米對比劑的粒徑和電位 (s)Table 1 Mean diameter and potential of nano contrast agents項(xiàng)目0 h48 hmPPF/PFOBmPP/PFOBmPPF/PFOBmPP/PFOB平均直徑(nm)347.322.2306.212.9 a362.433.4 314.315.9 aZeta電位(mV)-(21.41.4)-(26.11.2) a-(21.71.8) a-(25.91.3) a表注：mPP/PFOB為聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒，mPPF/PFOB為葉酸修飾的聚乙二醇化乳

45、酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒。與同時刻mPPF/PFOB納米粒比較，aP 0.05。表2 Cy5標(biāo)記的納米對比劑的粒徑和電位 (s)Table 2 Mean diameter and potential of Cy5-labeled nano contrast agents項(xiàng)目Cy5/mPPF/PFOBCy5/mPP/PFOBmPPF/PFOBmPP/PFOB平均直徑(nm)348.425.9308.522.4a 347.322.2306.212.9Zeta 電位(mV)-(21.31.6)-(26.30.95) -(21.41.4)-(26.11.2)表注：mPP/PFOB為聚乙二醇

46、化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒，mPPF/PFOB為葉酸修飾的聚乙二醇化乳酸羥基乙酸共聚物包裹液態(tài)氟碳的納米粒。與對比劑Cy5/mPPF/PFOB比較，aP 0.05。單純生理鹽水比較，顯像效果僅稍微增強(qiáng)，表現(xiàn)為少許點(diǎn)狀強(qiáng)回聲，但mPPF/PFOB納米對比劑回聲信號仍然很低，接近無回聲(圖5B)；加入MCF-7細(xì)胞后，mPPF/ PFOB納米對比劑回聲則明顯增強(qiáng)，顯示為密集的點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(圖5C)；提示mPP/PFOB對比劑結(jié)合至靶細(xì)胞并在其表面聚集之后，可產(chǎn)生明顯增強(qiáng)的超聲信號。3 討論 Discussion超聲具有經(jīng)濟(jì)、安全、方便、短期內(nèi)可重復(fù)檢查、普及率高等優(yōu)點(diǎn)，在中國是乳腺疾病

47、臨床檢查最常用的影像學(xué)方法之一。研究表明，納米級超聲對比劑具有較強(qiáng)穿透能力，能夠穿越血管內(nèi)皮進(jìn)入組織間隙，使血管外靶組織顯像成為可能，從而超越了微米級對比劑僅能發(fā)生血池內(nèi)顯像的局限性，推動了超聲分子顯像技術(shù)的發(fā)展，特別是針對腫瘤等重大疾病的早期診斷技術(shù)；使構(gòu)建納米級靶向超聲對比劑成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)31。田慧玲等32研究表明，葉酸受體在乳腺惡性腫瘤中高表達(dá)，且葉酸受體過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)；因而針對乳腺癌這一特征制備一種具有靶向作用的納米級超聲對比劑，將有利于提高乳腺癌的早期檢出率和對預(yù)后的判定。 實(shí)驗(yàn)采用先將葉酸修飾于聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸后，再用超聲乳化-蒸發(fā)法包裹液態(tài)氟碳，制備納米對比

48、劑，擬通過葉酸與乳腺癌細(xì)胞膜上的葉酸受體特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)納米粒與腫瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合，制備過程簡單，技術(shù)成熟；避免了先制備納米粒，再在納米粒表面修飾葉酸的繁雜步驟和修飾葉酸時對納米粒結(jié)構(gòu)可能造成的破壞。通過體外尋靶實(shí)驗(yàn)證明了該納米對比劑能主動與乳腺癌細(xì)胞MCF-7靶向結(jié)合。研究表明，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面的負(fù)電荷量比同源正常細(xì)胞多。實(shí)驗(yàn)制備的納米對比劑表面電位均為負(fù)，根據(jù)同種電荷相斥原理，對比劑很難吸附于HFF-1、MCF-7細(xì)胞表面。但是流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞與mPPF/PFOB對比劑共孵育后，MCF-7細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度較A組顯著增高，并且葉酸能夠使MCF-7細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯降

49、低；而在HFF-1細(xì)胞中，3組間的平均熒光強(qiáng)度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；此結(jié)果提示對比劑與MCF-7細(xì)胞的粘附并不依賴于兩者間電荷的吸引作用，而是依靠FA與RA的特異性靶向結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示的mPPF/PFOB納米粒，呈花環(huán)狀圍繞在MCF-7細(xì)胞膜周圍，mPP/PFOB納米粒無規(guī)則地分布在胞漿內(nèi)的結(jié)果，也再次證明了mPPF/PFOB納米對比劑能與MCF-7細(xì)胞特異性地靶向結(jié)合。傳統(tǒng)超聲對比劑的粒徑和散射強(qiáng)度是一對矛盾體。粒徑越小穿透能力越強(qiáng)，產(chǎn)生的散射越弱，成像效果越差，反之亦然。實(shí)驗(yàn)制備的靶向納米對比劑超聲成像則不完全依賴于對比劑粒徑，其體外超聲結(jié)果顯示，游離狀態(tài)下的成像效果非常弱，只有在與MCF-7細(xì)胞結(jié)合后，才產(chǎn)生明顯增強(qiáng)的超聲信號?？赡茉颍褐苽涞募{米粒在游離狀態(tài)下粒徑很小，即使液態(tài)氟碳與水的聲阻抗差異巨大也不能在聲場中形成有效的界面，反射超聲波信號；而與細(xì)胞集合后，對比劑微粒發(fā)生團(tuán)聚，形成反射超聲波的有效界面，此時液態(tài)氟碳與水之間巨大聲阻抗差形成的回聲反射就被超聲儀接收而轉(zhuǎn)化為增強(qiáng)的信號。因此，在進(jìn)行靶向造影時，微粒型對比劑在未靶向結(jié)合至靶組織之前，以游離狀態(tài)存在時只產(chǎn)生極微弱的信號；而當(dāng)納米粒靶向結(jié)合至靶