蛋白質(zhì)的研究方法PPT課件

1、1 蛋白質(zhì)的研究方法蛋白質(zhì)的研究方法 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室2010-102010-102主要內(nèi)容v蛋白質(zhì)對(duì)象的選擇和樣品的獲取蛋白質(zhì)對(duì)象的選擇和樣品的獲取v蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定v蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析v蛋白質(zhì)生物功能檢測(cè)蛋白質(zhì)生物功能檢測(cè) 3 蛋白質(zhì)對(duì)象的選擇和樣品的蛋白質(zhì)對(duì)象的選擇和樣品的獲取獲取4 一、研究對(duì)象的選擇一、研究對(duì)象的選擇無(wú)論何種來(lái)源的生物材料一般都含有成千上萬(wàn)種不同無(wú)論何種來(lái)源的生物材料一般都含有成千上萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)分子；的蛋白質(zhì)分子；在一種生物組織中，同時(shí)又存在著多種蛋白質(zhì)組分。在一種生物組織中，同時(shí)又存在著多種蛋白質(zhì)組分。雖然它們都具有

2、肽鏈結(jié)構(gòu)，但在雖然它們都具有肽鏈結(jié)構(gòu)，但在分子大小分子大小、極性極性以以及及電荷電荷上會(huì)有所差異。上會(huì)有所差異。 5 選擇研究蛋白的原則選擇研究蛋白的原則： 在組織中含量比較高在組織中含量比較高 相對(duì)比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)（如血液中的相對(duì)比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)（如血液中的hbhb；肌肉中的；肌肉中的 肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白等）肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白等）從模式生物基因組測(cè)序結(jié)果來(lái)看，每一種生物有機(jī)體從模式生物基因組測(cè)序結(jié)果來(lái)看，每一種生物有機(jī)體內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)（內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)（5050左右）從來(lái)沒(méi)有被研究左右）從來(lái)沒(méi)有被研究過(guò)。過(guò)。6獲取蛋白樣品的方法獲取蛋白樣品的方法： u直接從生物組織中提純蛋白直接從

3、生物組織中提純蛋白為主為主u根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息 7應(yīng)用各種分辨效果好的應(yīng)用各種分辨效果好的化學(xué)化學(xué)及及物理化學(xué)物理化學(xué)方法方法8直接從生物組織中提純蛋白直接從生物組織中提純蛋白蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過(guò)程：蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過(guò)程：1.破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來(lái)；破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來(lái)； 2.將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀下來(lái)將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀下來(lái); （鹽析法或有機(jī)溶劑（鹽析法或有機(jī)溶劑法）法）3.應(yīng)用應(yīng)用層析法層析法或或電泳法電泳法使它們各自分開(kāi)使它們各自分開(kāi)； 4.蛋白質(zhì)結(jié)晶；蛋白質(zhì)結(jié)晶；5.蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測(cè)定

4、。蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測(cè)定。9u根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息根據(jù)基因組測(cè)序獲得的信息 （1 1）可以獲得所要研究的特定蛋白質(zhì)的）可以獲得所要研究的特定蛋白質(zhì)的aaaa序列。序列。 先根據(jù)推出的先根據(jù)推出的aa序列合成對(duì)象蛋白序列合成對(duì)象蛋白中的一段肽，用它中的一段肽，用它去獲去獲 得有關(guān)的得有關(guān)的抗體抗體，然后用抗體去探測(cè)蛋白質(zhì)的存在，然后用抗體去探測(cè)蛋白質(zhì)的存在，甚至可以用抗體通過(guò)親和層析純化對(duì)象蛋白甚至可以用抗體通過(guò)親和層析純化對(duì)象蛋白10（2 2）去獲得有關(guān)）去獲得有關(guān)基因的基因的cdnacdna全序列全序列，然后，然后通過(guò)重組通過(guò)重組dnadna技術(shù)去表達(dá)重組蛋白。技術(shù)去表達(dá)重組蛋白。 有

5、偏差，甚至完全是假象。有偏差，甚至完全是假象。 即使推測(cè)得到的蛋白質(zhì)編碼信息是對(duì)的，在細(xì)胞即使推測(cè)得到的蛋白質(zhì)編碼信息是對(duì)的，在細(xì)胞內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的rna加工，翻譯后的蛋白質(zhì)的加工，翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾和加工等基因序列上目前還無(wú)法反映的信息。修飾和加工等基因序列上目前還無(wú)法反映的信息。11制備過(guò)程中注意事項(xiàng)：制備過(guò)程中注意事項(xiàng)： 要求自始至終保持在要求自始至終保持在天然狀態(tài)天然狀態(tài) 避免一切過(guò)激因素避免一切過(guò)激因素-如過(guò)酸或過(guò)堿，高溫，如過(guò)酸或過(guò)堿，高溫， 重金屬等的影響。重金屬等的影響。2. 2. 通常都在低溫條件下操作。通常都在低溫條件下操作。3. 3. 盡可能使樣品中蛋白

6、質(zhì)的濃度維持在較高盡可能使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高 水平。水平。12二、細(xì)胞的破碎二、細(xì)胞的破碎 少數(shù)蛋白質(zhì)少數(shù)蛋白質(zhì)-存在于細(xì)胞外面（如血液和體液中）存在于細(xì)胞外面（如血液和體液中） 大多數(shù)蛋白質(zhì)大多數(shù)蛋白質(zhì)-都存在于細(xì)胞的里面。都存在于細(xì)胞的里面。 一般固形生物材料首先都必須加以破碎，以釋放出細(xì)一般固形生物材料首先都必須加以破碎，以釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。 生物材料生物材料 必須新鮮必須新鮮要求：要求： 1. 1. 材料材料 -80-80 2. 2. 或者制成干粉（丙酮）或者制成干粉（丙酮） 3. 3. 低溫存放低溫存放 破碎的方法：破碎的方法： 機(jī)械破碎法機(jī)械破碎

7、法： 利用機(jī)械力的攪切作用，使細(xì)胞研碎利用機(jī)械力的攪切作用，使細(xì)胞研碎高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）。2.2.滲透破碎法滲透破碎法： 利用低滲條件，使細(xì)胞溶脹破碎。利用低滲條件，使細(xì)胞溶脹破碎。 紅血球放于水中，便發(fā)生自溶紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。14*抽提作用抽提作用： 生物材料在破碎的過(guò)程中，通常被浸在生物材料在破碎的過(guò)程中，通常被浸在適當(dāng)?shù)木彌_液中，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等內(nèi)容適當(dāng)?shù)木彌_液中，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等內(nèi)容物釋放到這種溶液中去。物釋放到這種溶液中去。153

8、.3.交替凍融法交替凍融法： 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。而使細(xì)胞脹破。 4.4.超聲波法超聲波法： 利用超聲波震蕩，使細(xì)胞膜上所受張力不均利用超聲波震蕩，使細(xì)胞膜上所受張力不均而解體。而解體。 5.5.酶消化法酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復(fù)合酶等對(duì)利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復(fù)合酶等對(duì)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的分解作用，使它們解體細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的分解作用，使它們解體16三、去污劑處理溶解膜蛋白三、去污劑處理溶解膜蛋白 膜蛋白的提取與細(xì)胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去

9、污劑把蛋白從膜中釋放出來(lái)。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?膜蛋白的處理：復(fù)雜膜蛋白的處理：復(fù)雜 細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)18按其所在按其所在位置位置大體可分為：大體可分為：兩種類(lèi)型外周蛋白兩種類(lèi)型外周蛋白（通過(guò)次級(jí)鍵和外膜脂質(zhì)的通過(guò)次級(jí)鍵和外膜脂質(zhì)的極性頭螯合在一起）極性頭螯合在一起） 固有蛋白固有蛋白外周蛋白外周蛋白-選擇適當(dāng)離子強(qiáng)度及選擇適當(dāng)離子強(qiáng)度及phph的含有的含有edtaedta的的 緩沖液抽提（高鹽溶液）緩沖液抽提（高鹽溶液）固有蛋白固有蛋白-嵌合在膜雙層中，它通過(guò)嵌合在膜雙層中，它通過(guò)疏水作用疏水作用與與 膜內(nèi)部脂質(zhì)層膜內(nèi)部脂質(zhì)層的疏水性尾部相結(jié)合，的疏水

10、性尾部相結(jié)合， 具有具有螺旋結(jié)構(gòu)螺旋結(jié)構(gòu)。 去污劑去污劑：一類(lèi)具有一類(lèi)具有 親水性頭部親水性頭部 疏性尾巴疏性尾巴 的雙親性（的雙親性（amphipathicamphipathic）脂類(lèi)）脂類(lèi)分子分子作用：作用： 既可以破壞細(xì)胞的既可以破壞細(xì)胞的磷脂雙層結(jié)構(gòu)磷脂雙層結(jié)構(gòu)，又可以與具有，又可以與具有疏水性表面的疏水性表面的膜蛋白結(jié)合膜蛋白結(jié)合，從而阻止釋放出來(lái)的膜蛋，從而阻止釋放出來(lái)的膜蛋白通過(guò)疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。白通過(guò)疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。 20有的有的去污劑的親水性頭部可離子化去污劑的親水性頭部可離子化（即含有一帶電（即含有一帶電基團(tuán)）基團(tuán)） 如如： 脫氧膽

11、酸鈉（脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholatesodium deoxycholate） 十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfatesodium dodecylsulfate，sdssds）有的有的去去污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團(tuán)污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團(tuán)， 如：如： triton x-100triton x-100， 辛基葡萄糖苷辛基葡萄糖苷( octylglucoside( octylglucoside）21臨界微團(tuán)濃度臨界微團(tuán)濃度（critical micelle concentration，cmc)： 每一種去污劑都具有一特征性的

12、每一種去污劑都具有一特征性的cmc。 cmccmc值與其分子中值與其分子中疏水部分疏水部分與與親水部分親水部分的的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有有 關(guān)。關(guān)。 當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 低于此值的時(shí)候，去污劑分子在水溶液低于此值的時(shí)候，去污劑分子在水溶液中將不形成微團(tuán)，達(dá)到此值的時(shí)候，微團(tuán)開(kāi)始形成。中將不形成微團(tuán)，達(dá)到此值的時(shí)候，微團(tuán)開(kāi)始形成。 22 離子化去污劑（離子化去污劑（sdssds）：其其“疏水尾巴疏水尾巴”破壞蛋白質(zhì)分子的疏水性部分的破壞蛋白質(zhì)分子的疏水性部分的結(jié)構(gòu)，其帶電的結(jié)構(gòu)，其帶電的“頭部頭部”破壞蛋白質(zhì)分子中的氫破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和離子鍵。鍵和離子鍵。作用的結(jié)果是作用的結(jié)果是： 使任何蛋白（不管是

13、膜蛋白還是水溶性蛋白）使任何蛋白（不管是膜蛋白還是水溶性蛋白）都都，并，并溶液中，同時(shí)溶液中，同時(shí)。在部分情況下，當(dāng)去污劑被透析掉后，蛋白質(zhì)可在部分情況下，當(dāng)去污劑被透析掉后，蛋白質(zhì)可以復(fù)性并恢復(fù)生物活性。以復(fù)性并恢復(fù)生物活性。 23sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-polyacrylamide sds-polyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，sds-pagesds-page）：）：就是利用就是利用sdssds的這種結(jié)合在整個(gè)蛋白分子上，并的這種結(jié)合在整個(gè)蛋白分子上，并使蛋白完全變性的特性。使蛋白

14、完全變性的特性。這樣經(jīng)過(guò)這樣經(jīng)過(guò)sdssds變性的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中完全變性的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中完全按大小按大小分離開(kāi)。分離開(kāi)。 24非離子去污劑非離子去污劑：相對(duì)溫和，一般相對(duì)溫和，一般不會(huì)使蛋白質(zhì)變性不會(huì)使蛋白質(zhì)變性。只是將蛋白質(zhì)。只是將蛋白質(zhì)分子從膜上溶解下來(lái)而已。分子從膜上溶解下來(lái)而已。當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 其其cmccmc值的時(shí)候，去污劑分子與膜蛋值的時(shí)候，去污劑分子與膜蛋白表面的疏水區(qū)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水溶液中溶解白表面的疏水區(qū)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水溶液中溶解而不聚集。而不聚集。當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 其其cmccmc值的時(shí)候，去污劑分子將與膜值的時(shí)候，去污劑分子將與膜磷脂一起形成混合微團(tuán)，膜蛋白

15、以整合在微團(tuán)中的磷脂一起形成混合微團(tuán)，膜蛋白以整合在微團(tuán)中的形式存在。形式存在。一般選擇非離子去污劑一般選擇非離子去污劑來(lái)來(lái)保持膜蛋白生物活性保持膜蛋白生物活性 26 27 四、蛋白分子的穩(wěn)定四、蛋白分子的穩(wěn)定防止蛋白質(zhì)分子可能被同時(shí)釋放的蛋白質(zhì)水解酶降防止蛋白質(zhì)分子可能被同時(shí)釋放的蛋白質(zhì)水解酶降解、解、pr空間結(jié)構(gòu)可能被溫度或化學(xué)試劑等環(huán)境因素空間結(jié)構(gòu)可能被溫度或化學(xué)試劑等環(huán)境因素破壞而喪失生物學(xué)活性等。破壞而喪失生物學(xué)活性等。處理處理：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑；：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑； 在低溫下操作；在低溫下操作； 加入穩(wěn)定劑加入穩(wěn)定劑(如甘油等）如甘油等）28五、細(xì)胞碎片

16、的去除五、細(xì)胞碎片的去除離心離心( centrifugation)( centrifugation) 原理：懸浮在溶液中的兩個(gè)或多個(gè)不同質(zhì)量或密度原理：懸浮在溶液中的兩個(gè)或多個(gè)不同質(zhì)量或密度的顆粒（如細(xì)胞、細(xì)胞器、大分子復(fù)合體、或分子的顆粒（如細(xì)胞、細(xì)胞器、大分子復(fù)合體、或分子等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質(zhì)等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質(zhì)量越大、或密度越高沉降的速度越快。量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固體性的細(xì)胞碎片和細(xì)胞器沉降到離心管的沉淀：固體性的細(xì)胞碎片和細(xì)胞器沉降到離心管的底部形成；底部形成；上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復(fù)合體保留在細(xì)胞上清：絕大多數(shù)蛋白分子

17、或蛋白復(fù)合體保留在細(xì)胞抽提液中即上清中抽提液中即上清中 29 六、目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離、純化六、目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離、純化 -蛋白質(zhì)的分級(jí)沉淀和層析分離蛋白質(zhì)的分級(jí)沉淀和層析分離將不同蛋白質(zhì)分開(kāi)的性質(zhì)主要包括：將不同蛋白質(zhì)分開(kāi)的性質(zhì)主要包括： 分子量的大小分子量的大小 帶電情況帶電情況 水溶性水溶性 與某種物質(zhì)的特異高親和力等與某種物質(zhì)的特異高親和力等 30 （一）蛋白質(zhì)的分級(jí)沉淀（一）蛋白質(zhì)的分級(jí)沉淀 常用的方法有：常用的方法有：u 鹽析法鹽析法u 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法31蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)： 蛋白質(zhì)顆粒表面多為親水基團(tuán)，可吸引水分子，使蛋白質(zhì)顆粒表面多為親水基團(tuán)，可吸引水分子，使顆粒表面成有一層水膜

18、顆粒表面成有一層水膜，蛋白質(zhì)顆粒相互隔開(kāi)，不，蛋白質(zhì)顆粒相互隔開(kāi)，不會(huì)聚集成大顆粒而沉淀。會(huì)聚集成大顆粒而沉淀。 此外，蛋白質(zhì)表面可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的此外，蛋白質(zhì)表面可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的作用。作用。 若去除蛋白質(zhì)膠體表面電荷和水化膜兩個(gè)穩(wěn)定若去除蛋白質(zhì)膠體表面電荷和水化膜兩個(gè)穩(wěn)定因素因素 ，蛋白質(zhì)極易從溶液中析出，蛋白質(zhì)極易從溶液中析出 鹽析法鹽析法32#33 鹽析法鹽析法 概念：將概念：將中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，破壞水化膜和電中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。各種蛋白質(zhì)鹽析所需的荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。各種蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度及鹽濃度及ph不同，加入

19、不同濃度的中性鹽可不同，加入不同濃度的中性鹽可使各種蛋使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來(lái)。白質(zhì)依次分別沉淀出來(lái)。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便 對(duì)易變性的蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，對(duì)易變性的蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用， 適用范圍十分廣泛。適用范圍十分廣泛。 缺點(diǎn)：分辨能力差，純化倍數(shù)低缺點(diǎn)：分辨能力差，純化倍數(shù)低34 1. 1.基本原理基本原理在蛋白質(zhì)水溶液中添加無(wú)機(jī)鹽，可以產(chǎn)生兩種在蛋白質(zhì)水溶液中添加無(wú)機(jī)鹽，可以產(chǎn)生兩種影響：影響： (1)(1)鹽離子鹽離子與與prpr分子分子中的中的 極性基團(tuán)極性基團(tuán) 離子基團(tuán)離子基團(tuán) 作用作用 降低降低prpr分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度

20、 。(2)(2)鹽離子鹽離子也與也與水水這種偶極分子作用，使水分子的活這種偶極分子作用，使水分子的活 度降低，導(dǎo)致度降低，導(dǎo)致prpr水合程度的減少，從而趨使水合程度的減少，從而趨使prpr溶溶 解度解度 。35 * *鹽溶（鹽溶（salting in)salting in)-當(dāng)溶液中的鹽離子強(qiáng)度比較當(dāng)溶液中的鹽離子強(qiáng)度比較低的時(shí)候，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增加而低的時(shí)候，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象叫做增加，這種現(xiàn)象叫做.* *鹽析（鹽析（salting out )-salting out )-但當(dāng)溶液中的鹽離子強(qiáng)度但當(dāng)溶液中的鹽離子強(qiáng)度比較高的時(shí)候，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)

21、隨著鹽濃度的增比較高的時(shí)候，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增加而降低，這種現(xiàn)象叫做加而降低，這種現(xiàn)象叫做 . .一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶解度。解度。 36 影響鹽析作用的因素影響鹽析作用的因素（1 1）鹽的種類(lèi)）鹽的種類(lèi)（2 2）phph和溫度和溫度# #（3 3）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度% %37（1 1）鹽的種類(lèi)）鹽的種類(lèi)對(duì)同一種對(duì)同一種prpr而言，而言，價(jià)數(shù)愈高價(jià)數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力的鹽離子，鹽析能力也愈強(qiáng)也愈強(qiáng): : po3-4so42-c2o42-（chohcoo-）2 acclno3-br -i-cns- k+rb+

22、na+cs+li+nh4+ 負(fù)離子價(jià)數(shù)較高的中性鹽負(fù)離子價(jià)數(shù)較高的中性鹽（如硫酸鹽、磷酸鹽等）（如硫酸鹽、磷酸鹽等）的的ksks值常較一價(jià)中性鹽的值常較一價(jià)中性鹽的ksks值高。值高。 ks:鹽析常數(shù)（價(jià)數(shù)較高時(shí)，鹽析常數(shù)（價(jià)數(shù)較高時(shí)，ks 值也較大）。代表鹽析的效值也較大）。代表鹽析的效率，率， 是與是與pr及鹽種類(lèi)有關(guān)的特性常數(shù)。及鹽種類(lèi)有關(guān)的特性常數(shù)。38硫酸銨硫酸銨（常用鹽析劑）（常用鹽析劑） 優(yōu)點(diǎn)：鹽析能力較強(qiáng)優(yōu)點(diǎn)：鹽析能力較強(qiáng) 具有較高的溶解度具有較高的溶解度 較低的溶解度溫度系數(shù)較低的溶解度溫度系數(shù) 價(jià)格低廉價(jià)格低廉 不產(chǎn)生副作用。不產(chǎn)生副作用。 缺點(diǎn)：緩沖能力較差缺點(diǎn)：緩沖能力

23、較差 phph難控制難控制39（2 2）phph和溫度和溫度s s。代表蛋白質(zhì)在無(wú)機(jī)鹽溶液中的溶解度。代表蛋白質(zhì)在無(wú)機(jī)鹽溶液中的溶解度 除取決于除取決于prpr的種類(lèi)，還受的種類(lèi)，還受phph及溫度影響及溫度影響: : ph=pi ph=pi時(shí)，時(shí)，s s。的數(shù)值極小。的數(shù)值極小 s s。隨溫度增加而減低。隨溫度增加而減低。鹽析過(guò)程中，若增高溫度，有助于鹽析過(guò)程中，若增高溫度，有助于prpr的析出。的析出。# #40（3 3）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度 prpr較高較高，在較低無(wú)機(jī)鹽濃度時(shí)，在較低無(wú)機(jī)鹽濃度時(shí), ,蛋白質(zhì)便開(kāi)蛋白質(zhì)便開(kāi) 始析出，鹽析界限比較寬。始析出，鹽析界限比較寬。 prpr較低

24、較低，需要無(wú)機(jī)鹽的濃度也高，即鹽析，需要無(wú)機(jī)鹽的濃度也高，即鹽析 界限變窄。界限變窄。 41 蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。 但蛋白質(zhì)濃度愈高時(shí)，其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用但蛋白質(zhì)濃度愈高時(shí)，其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用 也愈強(qiáng)也愈強(qiáng) 所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液太濃時(shí)，應(yīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)援?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液太濃時(shí)，應(yīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)?通常在通常在2.52.53.03.0之間比較合適。之間比較合適。421.1.基本原理基本原理（1）在）在pi附近，附近，pr主要以中性離子形式存在。此時(shí)若添加主要以中性離子形式存在。此時(shí)若添加 有機(jī)溶劑，由于有機(jī)溶劑，由于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑可使溶液可使

25、溶液電離電離常數(shù)常數(shù)減小，增強(qiáng)了減小，增強(qiáng)了 中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來(lái)。中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來(lái)。（2）有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑本身的水合作用會(huì)破壞本身的水合作用會(huì)破壞pr表面的水合層，也表面的水合層，也 促使促使pr變得不穩(wěn)定而聚集析出變得不穩(wěn)定而聚集析出.常用的有機(jī)溶劑：乙醇和丙酮常用的有機(jī)溶劑：乙醇和丙酮 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 分辨力比鹽析方法高，提純效果好分辨力比鹽析方法高，提純效果好 43 2. 2. 影響有機(jī)溶劑沉淀影響有機(jī)溶劑沉淀prpr的因素的因素 （1 1） ph ph值值 ph=piph=pi時(shí)時(shí) 蛋白質(zhì)的溶解度最低。按蛋白質(zhì)的溶解度最低。按pi

26、pi來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)節(jié)phph值，值， 有利于分離。有利于分離。 （2 2）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度 prpr越高，加入一定量有機(jī)溶劑后，越高，加入一定量有機(jī)溶劑后，prpr析出越多。析出越多。 此時(shí)溶液的此時(shí)溶液的介電常數(shù)介電常數(shù)也相應(yīng)提高，可以減少也相應(yīng)提高，可以減少prpr的變性。的變性。 prpr越高越高,pr,pr分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著 增強(qiáng)，這樣分離效果差，不利于分級(jí)沉淀。增強(qiáng)，這樣分離效果差，不利于分級(jí)沉淀。 只有選擇恰當(dāng)?shù)闹挥羞x擇恰當(dāng)?shù)膒rpr才有可能獲得良好的分高效果才有可能獲得良好的分高效果。44（3 3）離子強(qiáng)度）離子強(qiáng)度 中性鹽的加入能

27、促使中性鹽的加入能促使prpr在有機(jī)溶劑中溶解，在有機(jī)溶劑中溶解， 并且能防止并且能防止prpr的變性。但含鹽過(guò)多，卻會(huì)使的變性。但含鹽過(guò)多，卻會(huì)使prpr 過(guò)度析出，不利于分級(jí)沉淀。過(guò)度析出，不利于分級(jí)沉淀。 一般一般0.05m0.05m的稀鹽溶液。的稀鹽溶液。（4 4）多價(jià)陽(yáng)離子）多價(jià)陽(yáng)離子 prpr與多價(jià)的陽(yáng)離子如（與多價(jià)的陽(yáng)離子如（ znzn2+2+、 cucu2+2+等）能結(jié)等）能結(jié) 合成復(fù)合物。這種復(fù)合物在有機(jī)溶劑中往往使合成復(fù)合物。這種復(fù)合物在有機(jī)溶劑中往往使prpr 溶解度變小。溶解度變小。 45v常溫下有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)變性，低溫條件下可減慢變性速度。因此用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)

28、時(shí)應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。v如利用丙酮沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，必須在04低溫下進(jìn)行，丙酮用量-般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會(huì)變性。v缺點(diǎn)： 易使酶和具有活性的蛋白質(zhì)變性。故操作時(shí)要求條件比鹽析嚴(yán)格。對(duì)于某些敏感的酶和蛋白質(zhì)，使用有機(jī)溶劑沉淀尤其要小心。 46 ( (二）二）蛋白質(zhì)的層析分離法蛋白質(zhì)的層析分離法 （色譜法）（色譜法）最基本的特征：最基本的特征： 固定相固定相 流動(dòng)相流動(dòng)相47 原理原理 各種物質(zhì)得以分離的最基本原因：就在于它們?cè)谶@各種物質(zhì)得以分離的最基本原因：就在于它們?cè)谶@ 兩個(gè)相之間具有不同的分配系數(shù)兩個(gè)相之間具有不同的分配系數(shù). .兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，

29、兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)， 這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次的分配，即使它們的分這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次的分配，即使它們的分 配系數(shù)只有微小的差異，通過(guò)這個(gè)過(guò)程也能得到最配系數(shù)只有微小的差異，通過(guò)這個(gè)過(guò)程也能得到最 大的分離效果。大的分離效果。48 層析分離能力的實(shí)質(zhì)層析分離能力的實(shí)質(zhì)物質(zhì)的分配問(wèn)題物質(zhì)的分配問(wèn)題 *分配系數(shù)：分配系數(shù)： 當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和移動(dòng)相兩相內(nèi)的固定相和移動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比濃度之比是一個(gè)常數(shù)，這稱(chēng)是一個(gè)常數(shù)，這稱(chēng)為分配系數(shù)。為分配系數(shù)。 c1 k = c2 *質(zhì)量分配系數(shù)：質(zhì)量分配系數(shù)：若不用濃度而用若不用

30、濃度而用物質(zhì)的絕對(duì)量的比值物質(zhì)的絕對(duì)量的比值來(lái)表示，則稱(chēng)為來(lái)表示，則稱(chēng)為質(zhì)量分配系數(shù)即：質(zhì)量分配系數(shù)即： vs d= k vm vs : 固定相的體積固定相的體積 vm : 流動(dòng)相的體積流動(dòng)相的體積 49 種類(lèi)：種類(lèi)： 氣相層析氣相層析 按按兩相狀態(tài)兩相狀態(tài)來(lái)分來(lái)分 液相層析液相層析 吸附層析吸附層析 分配層析分配層析 按按層析機(jī)理層析機(jī)理來(lái)分來(lái)分 離子交換層析離子交換層析 凝膠排阻層析凝膠排阻層析 親和層析親和層析 柱層析柱層析 按按操作方式操作方式來(lái)分來(lái)分 薄層層析薄層層析 紙層析紙層析層析法分離、純化：層析法分離、純化：pr、多肽和多肽和aa50 離子交換層析法離子交換層析法*原理：原理

31、：陰陰（陽(yáng)）離子交換樹(shù)脂顆粒（作為固定相）（陽(yáng)）離子交換樹(shù)脂顆粒（作為固定相） 填充在層析柱內(nèi)，由于填充在層析柱內(nèi)，由于陰陰（陽(yáng)）離子交換樹(shù)（陽(yáng)）離子交換樹(shù) 脂顆粒上帶脂顆粒上帶正正（負(fù)）電荷，能吸引溶液中的（負(fù)）電荷，能吸引溶液中的 陰陰（陽(yáng)）離子。然后再用含陰（陽(yáng)）離子的（陽(yáng)）離子。然后再用含陰（陽(yáng)）離子的 溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫 下來(lái)，增加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白下來(lái)，增加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白 質(zhì)也被洗脫下來(lái)，于是兩種蛋白質(zhì)被分開(kāi)。質(zhì)也被洗脫下來(lái)，于是兩種蛋白質(zhì)被分開(kāi)。5152固定相固定相：1.1.纖維素纖維素- - de

32、aedeae纖維素、纖維素、 cmcm纖維素纖維素2.2.葡聚糖葡聚糖53u纖維素纖維素 : : 骨架為柔性長(zhǎng)鏈骨架為柔性長(zhǎng)鏈1.1. 加入量加入量 ： 加入層析柱的蛋白質(zhì)量通常纖維素量的加入層析柱的蛋白質(zhì)量通常纖維素量的 十分之一。十分之一。2.2. 提高分辨率，樣品體積應(yīng)盡可能地少。提高分辨率，樣品體積應(yīng)盡可能地少。3.3. 在洗脫時(shí)，可以通過(guò)在洗脫時(shí)，可以通過(guò)改變洗脫緩沖液的改變洗脫緩沖液的phph， 而使蛋白質(zhì)分子電荷減少而被解吸下來(lái)，也而使蛋白質(zhì)分子電荷減少而被解吸下來(lái)，也 可以通過(guò)可以通過(guò)提高洗脫緩沖液中離子強(qiáng)度提高洗脫緩沖液中離子強(qiáng)度，減弱，減弱 蛋白質(zhì)分子與載體親和力的辦法，將

33、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子與載體親和力的辦法，將蛋白質(zhì) 組分逐一洗脫下來(lái)。組分逐一洗脫下來(lái)。54u葡聚糖的離子交換樹(shù)脂葡聚糖的離子交換樹(shù)脂 : :骨架為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.1.同時(shí)具有分子篩的作用同時(shí)具有分子篩的作用2. 2. 因其高度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所帶有的交換基團(tuán)也比纖維因其高度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所帶有的交換基團(tuán)也比纖維 素多得多。交換容量為離子交換纖維素的素多得多。交換容量為離子交換纖維素的3 35 5倍。倍。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 它的床體積常受它的床體積常受phph或鹽濃度影響而變化，對(duì)分離或鹽濃度影響而變化，對(duì)分離效果有一定程度的干擾。效果有一定程度的干擾。 55凝膠（排阻）層析凝膠

34、（排阻）層析又稱(chēng)又稱(chēng)分子篩或凝膠過(guò)濾分子篩或凝膠過(guò)濾（gel filtrationgel filtration）原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。 當(dāng)分子大小不同的混合物通過(guò)這種凝膠柱時(shí)，當(dāng)分子大小不同的混合物通過(guò)這種凝膠柱時(shí)， 直徑大于孔徑的分子將不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，直徑大于孔徑的分子將不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部， 便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的 分子進(jìn)入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱分子進(jìn)入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱 內(nèi)保留時(shí)間就比較長(zhǎng)。這樣，較大的分子被先內(nèi)保留時(shí)間就比較長(zhǎng)。這樣，較大的分子被先 洗脫

35、下來(lái)，而較小的分子后被洗脫下來(lái)，從而洗脫下來(lái)，而較小的分子后被洗脫下來(lái)，從而 達(dá)到相互分離的目的達(dá)到相互分離的目的. .# #56用作凝膠的載體物質(zhì)有三類(lèi)用作凝膠的載體物質(zhì)有三類(lèi)： u 交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠 商品名為商品名為 sephadex gsephadex gu 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 商品名為商品名為bio-gel pbio-gel p ( (丙烯酰胺丙烯酰胺 + n+ n，n-n-次甲基二丙烯酰胺聚合而成次甲基二丙烯酰胺聚合而成 p p值表示不同的交聯(lián)度值表示不同的交聯(lián)度) )u 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 商品名為商品名為 sepharosesepharose或或 bio-

36、gel abio-gel a （從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級(jí)成分從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級(jí)成分 是是d-d-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脫水脫水-l-l-半乳糖相間重復(fù)結(jié)半乳糖相間重復(fù)結(jié) 合而成的鏈狀化合物）合而成的鏈狀化合物）57常用過(guò)濾層析凝膠的截留分子量范圍58瓊脂糖凝膠優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖凝膠優(yōu)點(diǎn)：1.1.其機(jī)械強(qiáng)度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝其機(jī)械強(qiáng)度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝 膠好得多。膠好得多。2.2.對(duì)蛋白質(zhì)等高分子的吸附作用也小得多對(duì)蛋白質(zhì)等高分子的吸附作用也小得多3.3.適用分子量的范圍寬，最大可以到適用分子量的范圍寬，最大可以到10108 8。59凝膠排阻層析

37、的應(yīng)用：凝膠排阻層析的應(yīng)用：1.1.作為分析工具作為分析工具 ( (分子量差別大的物質(zhì)分子量差別大的物質(zhì)) ) 2.2.作為脫鹽工具作為脫鹽工具(sephadex g-25)(sephadex g-25)3.3.高分子溶液的濃縮高分子溶液的濃縮 ( (不穩(wěn)定的高分子不穩(wěn)定的高分子) )4.4.去除熱原物質(zhì)去除熱原物質(zhì)(deae-a-25)(deae-a-25)5.5.物質(zhì)的分離提純物質(zhì)的分離提純6.6.用于測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量用于測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量60吸附層析法吸附層析法原理：原理：柱層析中，含有柱層析中，含有pr分子的混合物隨流動(dòng)相通分子的混合物隨流動(dòng)相通 過(guò)由過(guò)由吸附劑吸附劑組成的固

38、定相時(shí)，組成的固定相時(shí)，pr分子通過(guò)各分子通過(guò)各 種次級(jí)作用能夠吸附在吸附劑上種次級(jí)作用能夠吸附在吸附劑上,由于不同分由于不同分 子的吸附能力不同，可以通過(guò)洗脫使它們逐子的吸附能力不同，可以通過(guò)洗脫使它們逐 一解脫出來(lái)，而使混合物得以分離。一解脫出來(lái)，而使混合物得以分離。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.1. 物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。2.2.操作簡(jiǎn)便，吸附劑容易獲得，價(jià)格較低廉操作簡(jiǎn)便，吸附劑容易獲得，價(jià)格較低廉 61固定相固定相：吸附劑吸附劑磷酸鈣凝膠磷酸鈣凝膠磷酸鈣膠磷酸鈣膠caca3 3（popo4 4）2 2磷酸氫鈣膠磷酸氫鈣膠cahpocah

39、po4 42h2h2 2o o羥基磷酸鈣膠羥基磷酸鈣膠caca5 5（popo4 4）3 3oh oh 羥基磷灰石羥基磷灰石 磷酸鈣膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用原理磷酸鈣膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用原理: :主要是由于主要是由于 . ca. ca2+2+與與prpr負(fù)電荷性基團(tuán)負(fù)電荷性基團(tuán) 結(jié)合。結(jié)合。 . . 磷酸基團(tuán)與磷酸基團(tuán)與prpr正電荷基團(tuán)正電荷基團(tuán)62 流動(dòng)相流動(dòng)相： 洗脫劑洗脫劑-檸檬酸鹽檸檬酸鹽作用：檸檬酸離子因與作用：檸檬酸離子因與caca2+2+有更強(qiáng)的相互作用，有更強(qiáng)的相互作用， 它能大大它能大大降低降低蛋白質(zhì)和凝膠的吸附能力。蛋白質(zhì)和凝膠的吸附能力。 naclnacl，kcikci甚至

40、濃度高達(dá)甚至濃度高達(dá)3m3m時(shí)，也不影響時(shí)，也不影響prpr負(fù)電荷負(fù)電荷的吸附，相反這些鹽可以大大降低的吸附，相反這些鹽可以大大降低prpr正電荷正電荷的吸附。因的吸附。因此在高濃度的這些鹽溶液中應(yīng)用羥基磷灰石進(jìn)行層析時(shí)，此在高濃度的這些鹽溶液中應(yīng)用羥基磷灰石進(jìn)行層析時(shí)，可以專(zhuān)門(mén)吸附酸性蛋白質(zhì)及中性蛋白質(zhì)而排除堿性蛋白可以專(zhuān)門(mén)吸附酸性蛋白質(zhì)及中性蛋白質(zhì)而排除堿性蛋白質(zhì)。質(zhì)。63親和層析法親和層析法1.1.原理原理：利用生物高分子具有能和某些相對(duì)應(yīng)的專(zhuān)一：利用生物高分子具有能和某些相對(duì)應(yīng)的專(zhuān)一 分子可逆結(jié)合的特性。分子可逆結(jié)合的特性。 如，如，酶的活性部位能和底物酶的活性部位能和底物 抑制劑抑制

41、劑 輔助因子專(zhuān)輔助因子專(zhuān) 一性地結(jié)合一性地結(jié)合, ,改變條件又能使這種結(jié)合解除改變條件又能使這種結(jié)合解除. . 酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子（或稱(chēng)效應(yīng)物）之酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子（或稱(chēng)效應(yīng)物）之 間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié)間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié) 合蛋白與結(jié)合物之間合蛋白與結(jié)合物之間 。 這些被作用的對(duì)象物質(zhì)稱(chēng)之為這些被作用的對(duì)象物質(zhì)稱(chēng)之為配基（配基（ligand) ligand) 。 64固定相固定相-配基配基固定在固定在固相載體固相載體上上65662.2.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：具有高度的吸附專(zhuān)一性：具有高度的吸附專(zhuān)一性 層析過(guò)程簡(jiǎn)便、快速層析過(guò)程簡(jiǎn)便、快速3.3.載體的選擇載體的選

42、擇：(1)(1)必須具有高度親水性，使必須具有高度親水性，使prpr分子容易與它接近分子容易與它接近. .(2)(2)非專(zhuān)一性吸附要十分小。非專(zhuān)一性吸附要十分小。(3)(3)必須具有大量可供活化而能與配基結(jié)合的基團(tuán)。必須具有大量可供活化而能與配基結(jié)合的基團(tuán)。 常用載體常用載體：纖維素、纖維素、 葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、 聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃等等。 67高效液相層析法（高效液相層析法（high performance liquid chromatography ，hplchplc）又稱(chēng)又稱(chēng)“高壓液相色譜高壓液相色譜，是，是色譜法色譜法的一個(gè)重要

43、分支，以的一個(gè)重要分支，以液體液體為為流動(dòng)相流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性極性的單一的單一溶溶劑劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的定相的色譜柱色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。 68hplc包括： 輸液系統(tǒng)：輸液系統(tǒng)：驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過(guò)色譜分離驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過(guò)色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng)柱和檢測(cè)系統(tǒng) 層析柱：層析柱：分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)分離樣品中的各個(gè)物質(zhì) 進(jìn)樣器：進(jìn)樣器：將待分析樣品引入

44、色譜系統(tǒng)將待分析樣品引入色譜系統(tǒng) 檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)系統(tǒng)：將被分析組在柱流出液中濃度的將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào)變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào) ，并分析顯示出來(lái)697071分分 類(lèi)類(lèi)(1)(1)液一固吸附層析液一固吸附層析 (2)(2)液一液分配層析液一液分配層析： 是應(yīng)用最多的方法之一。是應(yīng)用最多的方法之一。(3)(3)離子交換層析離子交換層析(4)(4)凝膠滲透層析凝膠滲透層析72液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動(dòng)相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類(lèi)，底劑起決定基本色譜的分離作用，

45、洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時(shí)間長(zhǎng)短，并對(duì)試樣中某幾個(gè)組份具有選擇性作用。73液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團(tuán)結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱(chēng)為化學(xué)鍵合相層析。另一種利用離子對(duì)原理的液-液分配層析為離子對(duì)層析。 74離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換hplc中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱(chēng)離子性鍵合相層析。流動(dòng)相主要是水溶液，ph值最好在被分離酸、堿的pk值附近。 75 蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定76 一般可通過(guò)以下幾個(gè)方面進(jìn)行：一般可通過(guò)以下幾個(gè)方面進(jìn)行： 光譜

46、學(xué)特性光譜學(xué)特性 電泳行為電泳行為 特異抗體反應(yīng)特異抗體反應(yīng) 特異生物學(xué)活性特異生物學(xué)活性 n n一末端氨基酸序列測(cè)定一末端氨基酸序列測(cè)定 質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜檢測(cè) 排阻層析排阻層析 77 一、光譜學(xué)特性一、光譜學(xué)特性 光譜特性的總原則是光譜特性的總原則是： 當(dāng)一定波長(zhǎng)的光（即電磁波）與當(dāng)一定波長(zhǎng)的光（即電磁波）與prpr分子接觸時(shí)，分子接觸時(shí)，所吸收的或反射的輻射能量與所吸收的或反射的輻射能量與prpr分子結(jié)構(gòu)特征和濃分子結(jié)構(gòu)特征和濃度是密切相關(guān)的。度是密切相關(guān)的。 78 不同波長(zhǎng)范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反不同波長(zhǎng)范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反映的是蛋白質(zhì)分子的不同特征映的是蛋白質(zhì)分

47、子的不同特征: :190 -200nm190 -200nm波長(zhǎng)范圍的光吸收反映的是波長(zhǎng)范圍的光吸收反映的是蛋白質(zhì)主鏈蛋白質(zhì)主鏈上的酞胺鍵中電子的被激發(fā)；上的酞胺鍵中電子的被激發(fā)；230 - 300nm230 - 300nm波長(zhǎng)范圍的光吸收譜（最大吸收值在波長(zhǎng)范圍的光吸收譜（最大吸收值在280nm280nm波長(zhǎng)處）反映的是波長(zhǎng)處）反映的是蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。所以一般情況下，溶液在所以一般情況下，溶液在280nm280nm波長(zhǎng)處（屬紫外波長(zhǎng)處（屬紫外光范圍）的光吸收能力被當(dāng)做是光范圍）的光吸收能力被當(dāng)做是存在存在蛋白質(zhì)的證據(jù)。蛋白

48、質(zhì)的證據(jù)。79二、電泳檢測(cè)二、電泳檢測(cè) 蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)，在不同蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)，在不同phph的溶液中的溶液中帶有不同的電荷，從而在直流電場(chǎng)中能夠泳動(dòng)，這帶有不同的電荷，從而在直流電場(chǎng)中能夠泳動(dòng)，這就是就是電泳現(xiàn)象電泳現(xiàn)象。按按介質(zhì)狀態(tài)介質(zhì)狀態(tài)來(lái)分來(lái)分: :自由電泳自由電泳 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳按按操作原理操作原理可分為可分為: : 一般電泳一般電泳 等電電泳等電電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 免疫電泳等免疫電泳等 80自由電泳自由電泳-以以溶液溶液為介質(zhì)，在溶液中將蛋白質(zhì)分離為介質(zhì)，在溶液中將蛋白質(zhì)分離 缺點(diǎn)缺點(diǎn): :自由電泳過(guò)程中擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率有限自由電泳過(guò)程中擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率

49、有限區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳-在固體支持物上所進(jìn)行的電泳在固體支持物上所進(jìn)行的電泳 固體支持物有固體支持物有: :濾紙、濾紙、 醋酸纖維薄膜、醋酸纖維薄膜、 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :分辨率很高。分辨率很高。81sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 sdssds ( (十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉) )是陰離子型去污劑是陰離子型去污劑(sodium dodecyl sulfate, sds)(sodium dodecyl sulfate, sds) q q u = u = （遷移率）（遷移率）6r 6r u u 與與 q q、 r r有關(guān)有關(guān) 若

50、蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在若蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在sds-pagesds-page中進(jìn)中進(jìn)行電泳，由于分子篩效應(yīng)，行電泳，由于分子篩效應(yīng)， u u 僅取決于分子的大小。僅取決于分子的大小。因此因此 sdssds一凝膠電泳可以按一凝膠電泳可以按蛋白質(zhì)分子大小的不同蛋白質(zhì)分子大小的不同將其將其分開(kāi)。分開(kāi)。 這時(shí)，若以分子量的對(duì)數(shù)（這時(shí)，若以分子量的對(duì)數(shù)（logmlogm）對(duì)相對(duì)于染料前沿）對(duì)相對(duì)于染料前沿的遷移率（的遷移率（rfrf）作圖，呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系。）作圖，呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系。 8283 這種關(guān)系，對(duì)一種膠濃度時(shí)，只適用于一定的這種關(guān)系，對(duì)一種膠濃度時(shí)，只適用于一定的分子量范圍：分子量范圍：

51、 5 5膠濃度時(shí)，適用于分子量膠濃度時(shí)，適用于分子量6 6200200萬(wàn)的區(qū)間；萬(wàn)的區(qū)間； 1010膠濃度時(shí)，適用于分子量膠濃度時(shí)，適用于分子量1.61.67 7萬(wàn)的區(qū)間；萬(wàn)的區(qū)間； 1515膠濃度時(shí)，適用于分子量膠濃度時(shí)，適用于分子量1.21.24.54.5萬(wàn)的區(qū)間。萬(wàn)的區(qū)間。 84聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜等電聚焦電泳等電聚焦電泳（isoelectric focusing, ief） 是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)谑且环N根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)趐h梯度梯度中相中相互分離的一種電泳技術(shù)?；シ蛛x的一種電泳技術(shù)。 利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用利用特

52、殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)phph梯度。梯度。 ph梯度制作利用的兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類(lèi)的同系物，他們具有相近但不同的pka和pi值。在外電場(chǎng)作用下，自然形成ph梯度。凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等86prpr分子有一定的分子有一定的pipi，它處在一個(gè)由，它處在一個(gè)由陽(yáng)極到陰極陽(yáng)極到陰極梯度逐漸增加的介質(zhì)中，并通過(guò)以直流電時(shí)，梯度逐漸增加的介質(zhì)中，并通過(guò)以直流電時(shí)，它便它便“聚焦聚焦”在與在與其其pipi相同的相同的phph位置上。位置上。pipi

53、不同的蛋白質(zhì)泳動(dòng)不同的蛋白質(zhì)泳動(dòng)后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。87優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.可以區(qū)分等電點(diǎn)只有可以區(qū)分等電點(diǎn)只有 0.01 ph0.01 ph單位差異的蛋白質(zhì)；單位差異的蛋白質(zhì)；3.3.根據(jù)其所在位置還能夠測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量；根據(jù)其所在位置還能夠測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量；4.4.對(duì)很稀的樣品，最后達(dá)到高度的濃縮。對(duì)很稀的樣品，最后達(dá)到高度的濃縮。88雙向電泳雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis） 第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳-pi

54、pi第二向采用第二向采用sdssds一凝膠電泳一凝膠電泳-分子量分子量 由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量?jī)煞N完全不由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量?jī)煞N完全不同的特一性來(lái)進(jìn)行分離，因此具有非常高的分辨率同的特一性來(lái)進(jìn)行分離，因此具有非常高的分辨率可同時(shí)分析幾千上萬(wàn)個(gè)蛋白，分辨率高，分離度好。可同時(shí)分析幾千上萬(wàn)個(gè)蛋白，分辨率高，分離度好。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。89雙向page90 雙向電泳技術(shù)缺點(diǎn)，具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維雙向電泳技術(shù)缺點(diǎn)，具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維電泳中還很難被檢測(cè)到：電泳中還很難被檢測(cè)到：等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pl)pl)值很大或很小的，比如大于值

55、很大或很小的，比如大于8 8和小于和小于4 4的那些蛋白質(zhì)；的那些蛋白質(zhì)；分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于l00kdal00kda的蛋白的蛋白質(zhì)就比實(shí)際的少了，而大于質(zhì)就比實(shí)際的少了，而大于150kda150kda的蛋白質(zhì)就幾的蛋白質(zhì)就幾乎完全探測(cè)不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些乎完全探測(cè)不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質(zhì)都能清楚地被觀(guān)察到；大蛋白質(zhì)都能清楚地被觀(guān)察到；疏水性蛋白質(zhì)。疏水性蛋白質(zhì)。 免疫電泳免疫電泳 將將電泳分離電泳分離和和專(zhuān)一性免疫沉淀專(zhuān)一性免疫沉淀相結(jié)合的分析方法：相結(jié)合的分析方法： 免疫電泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫擴(kuò)散兩種技術(shù)結(jié)免疫電

56、泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫擴(kuò)散兩種技術(shù)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法。在電場(chǎng)作用下標(biāo)本中各組分因電泳遷移率不同而合的實(shí)驗(yàn)方法。在電場(chǎng)作用下標(biāo)本中各組分因電泳遷移率不同而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向?qū)⒛z挖一溝槽，將抗體加入溝分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向?qū)⒛z挖一溝槽，將抗體加入溝槽內(nèi)，使抗原與抗體相互擴(kuò)散而形成沉淀線(xiàn)。根據(jù)沉淀線(xiàn)的數(shù)量、槽內(nèi)，使抗原與抗體相互擴(kuò)散而形成沉淀線(xiàn)。根據(jù)沉淀線(xiàn)的數(shù)量、位置及形狀，以分析標(biāo)本中所含組分的性質(zhì)。位置及形狀，以分析標(biāo)本中所含組分的性質(zhì)。由于免疫反應(yīng)有由于免疫反應(yīng)有很高的專(zhuān)一性，很高的專(zhuān)一性，可用于可用于鑒定鑒定prpr的的純度，分析樣品純度，分析樣品中蛋白質(zhì)的組分中蛋白

57、質(zhì)的組分。ph 8.6本實(shí)驗(yàn)常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。本實(shí)驗(yàn)常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。9293三、測(cè)定純化蛋白質(zhì)的分子大小三、測(cè)定純化蛋白質(zhì)的分子大小 測(cè)定蛋白處于非變性條件下的大小一般可通過(guò)：測(cè)定蛋白處于非變性條件下的大小一般可通過(guò)：u凝膠層析凝膠層析u沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation) u動(dòng)態(tài)光散射（動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering)dynamic light scattering)u孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（pore gradi

58、ent polyacrylamide gel electrophoresis）u 94凝膠層析 1.凝膠是一類(lèi)多孔性高分子聚合物,每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子.當(dāng)樣品溶液通過(guò)凝膠柱時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著溶劑流動(dòng),因此流程較短,向前移動(dòng)速度快而首先流出層析柱; 2. 反之,相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下移動(dòng)過(guò)程中,它們從凝膠內(nèi)擴(kuò)散到膠?？紫逗笤龠M(jìn)入另一凝膠顆粒,如此不斷地進(jìn)入與逸出,使流量增長(zhǎng),移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱.953. 而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布,部分進(jìn)入顆粒,從而在大分

59、子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫.這樣,經(jīng)過(guò)層析柱,使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離 。 veblogmw c其中b,c為常數(shù)。即ve為洗脫體積，與logmw也成線(xiàn)性關(guān)系。我們可以通過(guò)在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質(zhì)后，并根據(jù)上述的線(xiàn)性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后用同一凝膠柱測(cè)出其它未知蛋白的分子量。96沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用該技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的時(shí)候，測(cè)定的用該技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的時(shí)候，測(cè)定的是幾個(gè)絕對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。是幾個(gè)絕對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 原理：原理：當(dāng)當(dāng)prpr樣品在相對(duì)較

60、低的離心速度（但還是處于超速樣品在相對(duì)較低的離心速度（但還是處于超速范圍）下離心時(shí)，在一個(gè)從離心管頂部指向底部的、范圍）下離心時(shí)，在一個(gè)從離心管頂部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，越往底部越大的沉降力作用下，prpr分子很快形成一分子很快形成一個(gè)從離心管頂部往下逐漸增加的連續(xù)個(gè)從離心管頂部往下逐漸增加的連續(xù)r r濃度梯度；濃度梯度；與此同時(shí)，將有一個(gè)方向與離心力相反的擴(kuò)散力作與此同時(shí)，將有一個(gè)方向與離心力相反的擴(kuò)散力作用于用于prpr上；當(dāng)沉降離心進(jìn)行一定時(shí)間之后，作用于上；當(dāng)沉降離心進(jìn)行一定時(shí)間之后，作用于prpr上的離心力和擴(kuò)散力（前者與蛋白在離心管中所上的離心力和擴(kuò)散力（前者與蛋