不同佐劑增強小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤細胞免疫效應的比較

1、不同佐劑增強小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤細胞免疫效應的比較 作者：周伊，齊旭，馬軍，來寶長，司履生，王一理 【摘要】 目的 評價5種不同配方佐劑在低免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗保護性免疫中的細胞免疫增強作用。方法 實驗組用5種不同配方的佐劑（FCA, FCA+IL2+GMCSF, FIA+IL2+GMCSF, FIA+SWZY, FIA+SWZY+IL2+GMCSF）和照射滅活的D5黑色素瘤細胞制成瘤苗免疫小鼠，對照組免疫用單純滅活D5黑色素瘤細胞。末次免疫后3天各組取半數(shù)動物檢測DTH反應、NK細胞活性及特異性CTL活性，剩余半數(shù)動物接種活D5黑色素瘤細胞，3周后再次檢測上述各免疫學參數(shù)。結(jié)果與對照組相

2、比，經(jīng)免疫后的各實驗組DTH反應、NK細胞活性、CTL活性均明顯升高（P<0.05），但成瘤后隨腫瘤增大，則呈下降趨勢。結(jié)論 5種佐劑配方制成的瘤苗均能誘導免疫小鼠對低免疫原性腫瘤的細胞免疫應答。其中佐劑SWZY和FCA增強免疫的效果相當，而毒副作用較小，可望成為一種人類腫瘤免疫治療的新型佐劑。 【關鍵詞】 佐劑；腫瘤疫苗；黑色素瘤0 引言 隨著對腫瘤免疫機制不斷的深入了解，腫瘤疫苗即腫瘤的特異性主動免疫治療越來越引起人們的關注 1，而應用腫瘤細胞制成瘤苗的前提是腫瘤細胞表達具有免疫原性的腫瘤相關抗原，但人體自發(fā)性腫瘤多數(shù)免疫原性較弱，很難誘發(fā)宿主有效的抗腫瘤免疫效應，而最直接的

3、且行之有效的方法就是應用有效的佐劑提高其免疫原性 2，3。本研究中，我們用FCA、FIA、IL2、GMCSF、SWZY等組成5種配方的佐劑和照射滅活的弱免疫原性D5黑色素瘤細胞制成瘤苗免疫小鼠，并對其免疫效果進行評價，試圖篩選出一種毒副作用小、能增強弱免疫原性腫瘤抗原所誘發(fā)的保護性抗瘤效應的新型佐劑。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 實驗動物和細胞株C57BL/6小鼠，雌性，810周齡，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。小鼠低免疫原性黑色素瘤細胞株D5，由美國Oregon Health Science University 胡宏明博士饋贈；人胃低分化粘液腺癌細胞MGC803，由本室保存；小鼠白

4、血病細胞YAC1，由第四軍醫(yī)大學免疫學教研室饋贈。1.1.2 主要試劑rhIL2由四川腫瘤研究所提供；rmGMCSF由美國胡宏明博士饋贈；弗氏不完全佐劑（FIA）、弗氏完全佐劑（FCA）由本室保存；佐劑SWZY由本室自制；MTT為Promega公司產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1 瘤苗制備收獲生長良好的D5細胞，經(jīng)10 000 rad的60Co照射滅活，調(diào)整細胞濃度至2×107/ml備用。按下列配方制備5種佐劑瘤苗，即瘤苗A：FCA+滅活D5細胞，瘤苗B：FCA+rhIL2+rmGMCSF+滅活D5細胞，瘤苗C：FIA+rhIL2+rmGMCSF+滅活D5細胞，瘤苗D：FIA+SWZY佐

5、劑+滅活D5細胞，瘤苗E：FIA+SWZY佐劑+rhIL2+rmGMCSF+滅活D5細胞，并制備不加佐劑的滅活D5細胞瘤苗作為對照。瘤苗中的IL2按14×104U/kg、GMCSF按14g/kg加入，各組佐劑與滅活的D5細胞的體積比為11，混合后分別制成油包水的乳劑疫苗及不含F(xiàn)IA或FCA的水劑疫苗(其余成分同上)，于4保存?zhèn)溆谩?.2.2 主動特異性免疫保護實驗將小鼠隨機分為6組，即注射瘤苗A、B、C、D、E的實驗組和對照組，每組16只。各組小鼠接種不同瘤苗的量均為100l（含1×106細胞數(shù)）。初次免疫后2、3、4周各強化免疫1次。其中前2次免疫用油包水的乳劑疫苗，后2

6、次免疫用水劑疫苗。對照組免疫用單純滅活D5細胞。末次免疫后3天，各實驗組和對照組小鼠均處死一半，進行有關免疫學參數(shù)的測定，剩余小鼠皮下接種D5細胞3×105個（50l），3周后處死存活的小鼠，再進行有關免疫學參數(shù)的檢測。1.2.3 DTH反應采用足墊腫脹試驗檢測特異性遲發(fā)型超敏反應（DTH）。每批小鼠在處死前1天，于每只小鼠的左后足墊注射1×105個（50l）D5細胞凍融液，24h后用游標卡尺測量左、右足墊的厚度（101mm），以左足墊的厚度減去右足墊的厚度計算腫脹反應。1.2.4 NK細胞活性檢測用MTT法檢測NK細胞活性，效應細胞為小鼠脾細胞，濃度1×106/

7、ml。靶細胞為YAC1細胞，濃度1×105/ml。效靶比例為101，每個樣本3個平行樣。在酶聯(lián)檢測儀于570nm波長測A值。按下述公式計算NK活性，以殺傷率（%）表示。 NK細胞活性（%）= 1（實驗孔（效+靶）A值 效應細胞對照孔A值）/靶細胞對照孔A值×100%1.2.5 特異性細胞毒性（CTL）測定用MTT法檢測，效應細胞為小鼠脾細胞，靶細胞為D5細胞，其余方法、步驟同上。同時用MGC803細胞（人胃癌細胞株）作為對照。1.3 統(tǒng)計學分析 樣本均數(shù)采用成組資料方差分析，配對資料采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 DTH反應 末

8、次免疫后3天，瘤苗A組小鼠的DTH反應最強，其余依次為瘤苗B、D、E、C組。各實驗組小鼠的DTH反應均高于對照組小鼠(P<0.01)。接種腫瘤后3周，瘤苗A、B、D組小鼠的DTH反應較強，其次為瘤苗E、C組，各實驗組均高于對照組(P<0.01），見表1。表1 小鼠足墊腫脹反應(101mm)(略)2.2 NK細胞活性 末次免疫后3天及接種腫瘤后3周，各實驗組小鼠脾NK細胞的殺傷活性均高于對照組小鼠(P<0.01)，但各實驗組之間的殺傷活性無統(tǒng)計學差異（P>0.1）。實驗組及對照組接種腫瘤后3周與末次免疫后3天的NK細胞活性比較略有降低，但無

9、統(tǒng)計學差異，見表2。表2 小鼠NK細胞活性（殺傷率%）(略)2.3 特異性細胞毒（CTL）活性 末次免疫后3天，各實驗組小鼠脾細胞對D5細胞殺傷率均高于對MGC803細胞殺傷率(P<0.05)，而對照組小鼠脾細胞對D5細胞殺傷率與對MGC803細胞殺傷率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.1）。并且各實驗組小鼠脾細胞對D5細胞殺傷率均高于對照組，其中A、B、D組較C、E組高(P<0.05)。接種腫瘤后3周，各實驗組小鼠脾細胞對D5細胞殺傷率亦高于對MGC803細胞殺傷率(P<0.05)，且各實驗組對D5細胞殺傷率均高于對照組(P<

10、0.05)，此時各實驗組間對D5細胞殺傷率基本相當（P>0.05）。各組接種腫瘤后3周對D5細胞的殺傷率與末次免疫后3天比較，總體有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而對MGC803細胞殺傷率，各實驗組均有明顯下降(P<0.05，表3)。表3 小鼠脾細胞對D5細胞和MGC803細胞的殺傷活性(%)(略)3 討論 D5細胞是小鼠自發(fā)性黑色瘤細胞株B16BL6的一個變異株，不表達或僅表達極低水平的MHC（H2Db/Kb）類分子，不表達MHC類分子 4，5。單獨用射線滅活的D5細胞免疫小鼠不能保護宿主免受1×105同種瘤細胞的攻擊，表明D5

11、是一弱免疫原性腫瘤 6。 NK細胞是重要的免疫效應細胞，其抗腫瘤作用已為眾多證據(jù)所證實 7。DTH是評價細胞免疫最直接和常用的在體試驗，免疫的效果可以通過產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應的強弱得到預測 8，特異性CTL也是目前公認的最為可靠的評價腫瘤主動免疫治療的指標 9。本實驗中成瘤前后各含佐劑的實驗組NK細胞活性均高于對照組，說明所用佐劑均可增強小鼠抗腫瘤的非特異性細胞免疫反應。并且各實驗組特異性DTH反應、CTL活性也均高于對照組，其中瘤苗A（FCA）、B（FCA+IL2+GMCSF）、D（SWZY）組作用相對較強，提示所用佐劑也可不同程度增強小鼠抗腫瘤的特異性細胞免疫反應。總之，實驗顯示單獨或聯(lián)合使

12、用FCA、IL2、GMCSF、SWZY佐劑制成的各種瘤苗免疫小鼠均可增強小鼠對弱免疫原性腫瘤的細胞免疫力。 實驗中小鼠在成瘤前后各組NK細胞活性和CTL活性盡管無統(tǒng)計學差別，但總體上均呈下降趨勢，這一事實說明隨腫瘤進展荷瘤小鼠的非特異性和特異性細胞免疫功能均有所降低，這和腫瘤患者的臨床觀察結(jié)果是一致的。 SWZY是我室自行研制的一種新型免疫佐劑，本實驗結(jié)果顯示佐劑SWZY在誘導DTH反應，增強NK細胞活性、CTL殺傷活性方面均與FCA相當，但其局部的毒副作用小。對佐劑SWZY免疫調(diào)節(jié)作用的進一步研究將推動人用腫瘤疫苗佐劑的開發(fā)和應用?！緟⒖嘉墨I】 1Schwaab T, Tretter CP,

13、 Gibson JJ, et al. Immunological effects of granulocytemacrophage colonystimulating factor and autologous tumor vaccine in patients with renal cell carcinoma J. J Urol，2004, 171(3):10361042. 2秦燕.惡性腫瘤的瘤苗免疫治療 J.國外醫(yī)學腫瘤學分冊,2002,29(1):3639. 3Huang L,Ohno T.Protective antitumor immunity induced by fixed t

14、umor cells in combination with adjuvant in a murine hepatoma model J. Cancer Lett, 2003, 202(2):153159. 4 Hu HM, Urba WJ, Fox BA. Genemodified tumor vaccine with therapeutic potential shifts tumor specific T cell response from a type 2 to a type 1 cytokine profile J. J Immunol, 1998, 161（6）:30333041

15、. 5王艷, 周樂, 耿宜萍,等. 低免疫原性腫瘤可誘導調(diào)節(jié)性T細胞增生 J. 中華病理學雜志, 2005, 34(9):583587. 6齊旭, 周伊, 王一理, 等. 同系細胞瘤苗對低免疫原性小鼠黑色素瘤治療作用的研究 J. 中國腫瘤生物治療雜志, 2002, 9(1):6061. 7Smyth MJ, Hayakawa Y, Takeda K, et al. New aspects of naturalkillercell surveillance and therapy of cancer J. Nat Rev Cancer, 2002, 2(11):850861. 8 Harris JE, Ryan L, Hoover HC Jr, et al. Adjuvant active specific immuno