青霉素發(fā)酵工藝

1、青霉素發(fā)酵工藝制作人 生化制藥30904班級(jí)李曉清青霉素 青霉素是人類最早發(fā)現(xiàn)的抗生素,其殺傷革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的神奇功效幾乎人人都 曾領(lǐng)教過(guò)。它的發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物學(xué)乃至整個(gè)人類發(fā)展的重要意義可以說(shuō)是有口皆碑,以致于 人們把青霉素的發(fā)現(xiàn)使用列入二十一世紀(jì)給人類生活帶來(lái)巨大變化的科技貢獻(xiàn)。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青 霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種 能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是 -內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。1929 年英國(guó)學(xué)者弗萊明首先在抗生素中發(fā)現(xiàn)了青霉素，英國(guó)謝菲爾德大學(xué)病理學(xué)家弗 洛里實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素的分離與

2、純化，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)傳染病的療效，與英國(guó)生物化學(xué)家錢恩共 獲 1945 年諾貝爾獎(jiǎng)。青霉素分為天然的和半合成的，天然的青霉素是通過(guò)菌種發(fā)酵得 到的。一、菌種 青霉素最初是從點(diǎn)青霉素產(chǎn)生，生產(chǎn)能力很低，后來(lái)找到適于深層培養(yǎng)的產(chǎn) 黃青霉菌，經(jīng)一系列的誘變、雜交、育種，才得到高產(chǎn)的菌種。目前國(guó)內(nèi)青霉素 的生產(chǎn)菌種按菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。絲狀菌和球狀菌對(duì)原材料和 培養(yǎng)條件的要求有一定的差別，產(chǎn)生青霉素的能力也有差異。球狀菌的發(fā)酵單位 雖高，但對(duì)原材料和設(shè)備要求較高，且提煉收率也低于絲狀菌，因此國(guó)內(nèi)青霉菌 生產(chǎn)廠大都采用綠色絲狀菌。二、 青霉素的工藝流程 絲狀菌的青霉素發(fā)酵工藝流程：沙土管斜面母

3、瓶（孢子培養(yǎng)，25，67d） 大米孢子斜面（孢子培養(yǎng)，25，67d）種子罐（種子培養(yǎng)，25，4045h） 繁殖罐（種子培養(yǎng)，25，1315h）發(fā)酵罐（發(fā)酵，26，67d）放罐 球狀菌的青霉素發(fā)酵工藝流程：冷凍管斜面母瓶（孢子培養(yǎng)，25，68d） 大米孢子斜面（孢子培養(yǎng)，25，810d）種子罐（種子培養(yǎng)，28，50 60h）發(fā)酵罐（發(fā)酵，26，67d）放罐三、 發(fā)酵工藝過(guò)程及要點(diǎn) 1.種子。絲狀菌的生產(chǎn)種子是由包藏在低溫的冷凍安管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上，25培養(yǎng)7天，真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆谩?生產(chǎn)時(shí)它按一定的接種量移種到 含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi)，26培養(yǎng)

4、56小時(shí)左右，菌絲濃度達(dá)6%-8%，菌絲形態(tài)正常，即按10%-15%接種量移入含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級(jí)種子罐內(nèi)，27培養(yǎng)24小時(shí)，菌絲體積10%-12%，形態(tài)正常，效價(jià)在700u/ml左右便可作為發(fā)酵種子。 2.培養(yǎng)基成分的控制 a.碳源 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。乳糖能被生產(chǎn)菌緩慢利用而延長(zhǎng)青霉素g的分泌期，故為最佳碳源，但因貨源少、價(jià)格高，大量使用有困難。天然油脂如玉米油、豆油也能被緩慢利用作為有效的碳源，但也不可能達(dá)規(guī)模使用。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (de 值 50% 以上) 進(jìn)行流加。 b.氮源 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補(bǔ)加無(wú)

5、機(jī)氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。在玉米漿中含有多種氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等，為菌體生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子。使用玉米漿的發(fā)酵效果最好。在發(fā)酵時(shí)，氨氮的控制在0.05%-0.08%范圍內(nèi)。 d.無(wú)機(jī)鹽加人的無(wú)機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等，且用量要適度。另外, 由于鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作用, 必須嚴(yán)格控制鐵離子的濃度, 一般控制在30 g/ml 。 c.前體 生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素 g, 需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前體對(duì)青霉素的毒害。國(guó)內(nèi)外青霉素發(fā)酵生產(chǎn)作為芐青霉素生物合成的前體有苯乙酸、苯乙

6、酰胺等。它們一部分直接結(jié)合到青霉素分子中，另一部分作養(yǎng)料和能源被利用，即被氧化為二氧化碳和水。這些前體物質(zhì)對(duì)青霉菌都有一定的毒性，特別是苯乙酰胺毒性最大。四、 發(fā)酵培養(yǎng)的控制 a. 加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過(guò)程中的 ph 值確定 , 最好是根據(jù)排氣中co2 量及 o2 量來(lái)控制, 一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右, ph 值上升時(shí)開始加糖。 b. 補(bǔ)氮及加前體 補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素, 使發(fā)酵液氨氮控制在 o. 01%-0.05%,補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 0.05%-0.08% 。 c. ph 值控制 對(duì)ph 值的要求視不同菌種而異, 一般為 ph 6.4-6

7、.8, 可以補(bǔ)加葡萄 糖來(lái)控制。目前一般采用加酸或加堿控制ph值。 d. 溫度控制 前期 2 5- 2 6 c, 后期 23 c, 以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。e. 溶解氧的控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30% 。通風(fēng)比一般為1 : 0. 8l/(l ? min), 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。 f. 泡沫的控制 在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 泡敵 來(lái)消泡, 應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入, 尤其在發(fā)酵前期不宜多用, 否則會(huì)影響菌體的呼吸代謝 g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣 , 用顯微鏡

8、觀察菌絲形態(tài)變化來(lái)控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 ,根據(jù) 鏡檢 中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度, 通過(guò)追加糖或補(bǔ)加前體等各種措施來(lái)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間, 以獲得最多青霉素。當(dāng)菌絲中空泡擴(kuò)大、增多及延伸, 并出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞, 這表示菌絲趨向衰老, 青霉素分泌逐漸停止, 菌絲形態(tài)上即將進(jìn)入自溶期, 在此時(shí)期由于茵絲自溶, 游離氨釋放, ph 值上升, 導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降, 使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多, 并使發(fā)酵液變蒙古稠, 增加下一步提純時(shí)過(guò)濾的困難。因此, 生產(chǎn)上根據(jù) 鏡檢 判斷, 在自溶期即將來(lái)臨之際, 迅速停止發(fā)酵, 立刻放罐, 將發(fā)酵液迅速送往提煉工段五、影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素 （1）基質(zhì)

9、濃度 在分批發(fā)酵中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過(guò)高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生長(zhǎng)抑制）, 而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成 , 為了避免這一現(xiàn)象 , 在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 , 即對(duì)容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 , 因?yàn)榧词故浅鲎钸m濃度范圍較小的波動(dòng) , 都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制 , 使生物合成速度減慢或停止。目前 , 糖濃度的檢測(cè)尚難在線進(jìn) 行 , 故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 , 而是間接根據(jù)ph 值、溶氧或 c02 釋放率予以

10、調(diào)節(jié)。 （2）溫度 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 , 但一般認(rèn)為應(yīng)在25 c 左右。溫度過(guò)高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 , 同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長(zhǎng)和青霉素合成來(lái)說(shuō) , 最適溫度不是一樣的, 一般前者略高于后者, 故有的發(fā)酵過(guò)程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間, 到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 , 以利于青霉素的合成。 （3） ph 值 青霉素發(fā)酵的最適 ph 值一般認(rèn)為在 6. 5 左右 , 有時(shí)也可以略高或略低一些 , 但應(yīng)盡量避免 ph 值超過(guò)7.0, 因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定, 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基

11、中, ph 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過(guò)高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使 ph 值降低； 過(guò)低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 ph 值上升。 （4）溶氧 對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來(lái)說(shuō) , 溶氧濃度是影響發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到 30% 飽和度以下時(shí), 青霉素產(chǎn)率急劇下降, 低于 10% 飽和度時(shí), 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過(guò)高 , 說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過(guò)低, 造成呼吸強(qiáng)度下降, 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn), 而氧消耗與碳能源消耗成正比, 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一

12、個(gè)參考指標(biāo)。 （5）菌絲濃度 發(fā)酵過(guò)程中必須控制菌絲濃度不超過(guò)臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強(qiáng)度 (取決于維持因數(shù)的大小, 維持因數(shù)越大,呼吸強(qiáng)度越高) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強(qiáng)度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強(qiáng)的發(fā)酵罐及黏低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。 （6）菌絲生長(zhǎng)速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)證明，在葡萄糖限制生長(zhǎng)的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長(zhǎng)速率之間呈一定關(guān)系。當(dāng)比生長(zhǎng)速率低于0.015h-1時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長(zhǎng)速率成正比,

13、 當(dāng)比生長(zhǎng)速率高于 o. 015h-1時(shí), 比生產(chǎn)速率與比生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān) d 因此, 要在發(fā)酵過(guò)程中達(dá)到并維持最大比生產(chǎn)速率, 必須使比生長(zhǎng)速率不低0.015h-1 。這一比生長(zhǎng)速率稱為 臨界比生長(zhǎng)速率。對(duì)于分批補(bǔ)料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來(lái)說(shuō), 維持0.015h斗的臨界比生長(zhǎng)速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍, 這在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實(shí)現(xiàn)的。事實(shí)上 , 青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長(zhǎng)速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能達(dá)到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程不斷有部分菌絲自溶, 抵消了一部分生長(zhǎng), 故雖然表觀比生長(zhǎng)速率低, 但真比生長(zhǎng)速率卻要高一些。 （7）

14、菌絲形態(tài) 在長(zhǎng)期的菌株改良中 , 青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長(zhǎng)和結(jié)球生長(zhǎng)兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸, 故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低, 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而允許更多的菌絲生長(zhǎng) (即臨界菌體濃度較高), 發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。 在絲狀菌發(fā)酵中, 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L(zhǎng)度, 并避免結(jié)球 , 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 , 并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強(qiáng)度及

15、比生長(zhǎng)速率六、工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程(1)青霉素工業(yè)鉀鹽工藝流程工業(yè)鉀鹽工藝流程圖 醋酸丁酯萃取 活性炭脫色 青霉素濾液一次ba提取液 無(wú)鹽水水洗 碳酸鉀溶液抽提 壓濾ba 水洗ba 共沸結(jié)晶 雙錐干燥 鉀鹽抽提液青霉素鉀鹽工業(yè)鉀鹽工業(yè)鉀鹽 (2)青霉素鈉鹽流程圖 醋酸丁酯萃取 活性炭脫色 青霉素濾液一次ba提取液 無(wú)鹽水水洗 碳酸鉀溶液抽提 壓濾ba 水洗ba 共沸結(jié)晶 樹脂交換 鉀鹽抽提液青霉素鉀鹽青霉素鈉鹽 無(wú)菌過(guò)濾、共沸結(jié)晶 過(guò)濾、洗滌、干燥 溶液鈉鹽結(jié)晶液青霉素鈉鹽成品七、發(fā)酵液預(yù)處理和過(guò)濾 發(fā)酵液預(yù)處理是抗生素分離純化的第一道工序。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中抗生 素的濃度通常很低，而雜質(zhì)的

16、含量通常很高，包括有大量的菌體細(xì)胞、未用完的 培養(yǎng)基、各種蛋白質(zhì)膠狀物以及其他代謝產(chǎn)物等。發(fā)酵液預(yù)處理主要去除兩大類 物質(zhì)：一類是可溶性物質(zhì)，包括核酸、雜蛋白質(zhì)、不溶性多糖等，這些雜質(zhì)不僅 使發(fā)酵液粘度提高，影響液固分離速率，而且還會(huì)影響提取操作；另一類是某些 無(wú)機(jī)鹽，它們不僅影響成品質(zhì)量，而且在采用離子交換法提取時(shí)，由于樹脂大量 吸附無(wú)機(jī)離子而減少對(duì)抗生素的交換，因此，應(yīng)將這些無(wú)機(jī)離子，特別是高價(jià)金 屬離子除去。 發(fā)酵液放罐后，首先要冷卻，因?yàn)榍嗝顾卦诘蜏貢r(shí)比較穩(wěn)定，細(xì)菌繁殖也比 較慢，可避免青霉素迅速被破壞。青霉素菌絲教粗，一般過(guò)濾較容易，通常采用 鼓式過(guò)濾及板框過(guò)濾；蛋白質(zhì)的處理方法包括

17、等電點(diǎn)沉淀、變性沉淀、沉淀劑沉 淀、凝聚劑沉淀、絮凝劑沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高價(jià)金屬離子 的去除方法有離子交換法和沉淀法等。八、青霉素的提取 青霉素的提取方法包括離子交換法、吸附法、沉淀法和溶劑萃取法等。離子 交換法利用離子交換樹脂作為吸附劑，將青霉素從發(fā)酵液中吸著在樹脂上，然后 在適宜的條件下洗脫下來(lái)，達(dá)到分離、濃縮、提純的目的。由于離子交換法具有 成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、不用或少用有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，已成為提取抗生素的重要方法 之一。 隨著大網(wǎng)格聚合物吸附劑的合成和發(fā)展，吸附法重新為抗生素工業(yè)所重視而 獲得應(yīng)用。吸附法具有操作簡(jiǎn)便、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單、不用或少用有機(jī)溶劑、生產(chǎn) 過(guò)程中 ph

18、 變化小等優(yōu)點(diǎn)。但吸附法選擇性差，收率不高。常規(guī)吸附劑按其化學(xué)結(jié) 構(gòu)可分為兩大類;一類是有機(jī)吸附劑，如活性炭、纖維素、大孔樹脂等；另一類是 無(wú)機(jī)吸劑，如氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鈣等。 沉淀法是利用抗生素在一定的 ph 條件下，與某些金屬離子或其他化合物的整 個(gè)分子結(jié)合成難易溶解的鹽或復(fù)鹽沉淀出來(lái)，以達(dá)到濃縮和提純的目的。利用某 些抗生素具有兩極化合物的性質(zhì)，使其在等電點(diǎn)時(shí)從水溶液中游離而沉淀出來(lái)， 直接得到成品。根據(jù)抗生素的理化性質(zhì)、提取工藝條件和所得沉淀物的情況，沉 淀法一般可分為間接沉淀法和直接沉淀法兩種類型。 溶劑萃取法按操作方式可以分為單級(jí)萃取和多級(jí)萃取，后者又可以分為錯(cuò)流 萃取和逆

19、流萃取。單級(jí)萃取只包括一個(gè)混合器和一個(gè)分離器。 取液再用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取稱為多級(jí)錯(cuò)流萃取。溶劑萃取法提取青霉素的效果 除了已選定已選定適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑、破乳化劑和離心分離設(shè)備外，還與 ph、溫度 和萃取方式及濃縮比等因素有關(guān)。青霉素在酸性條件下極易被水解破壞，生成青 霉素酸， 但根據(jù) pk 值的要求， 又一定要在酸性時(shí)才能將青霉素轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中， 因此合適的 ph 很重要。在中性 ph 下青霉素以成鹽的形式溶于水中，轉(zhuǎn)移也較完 全。如果堿性過(guò)強(qiáng)，則已發(fā)生堿性水解，而且雜質(zhì)也易轉(zhuǎn)到水相中，質(zhì)量也較差。 在低溫條件下提取青霉素較為有利，并且提取過(guò)程中停留的時(shí)間越短越好。青霉 素在丁酯中于 015

20、放置 24h 不致?lián)p失效價(jià)，但在溫室下效價(jià)損失可達(dá) 5.32。 萃取方式和濃縮比也有很大影響，根據(jù)萃取方式和理論收得率的計(jì)算得知，多級(jí) 逆流萃取較理想，目前生產(chǎn)上采用二級(jí)逆流萃取方式。濃縮比的選擇也很重要， 因?yàn)槎□サ挠昧颗c收率和質(zhì)量都有關(guān)系。若丁酯用量太多，雖然萃取較完全、收 率高，但達(dá)不到結(jié)晶濃度要求，反而增加溶劑的耗用量；若丁酯用量太少，則萃 取不完全，影響收率。1 、 濃縮 在抗生素提取和精制的過(guò)程中，常需要通過(guò)蒸發(fā)將發(fā)酵濾液或提取液進(jìn)一步濃 縮，以利于后序操作?？股厣a(chǎn)中有真空濃縮和薄膜蒸發(fā)濃縮。 2 、 干燥 干燥的目的是除去抗生素中所含的水分，以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品的 加工、儲(chǔ)存和