王沛-微流控芯片檢測

1、微流控芯片檢測器微流控芯片檢測器主講人 ：王沛 微流控芯片檢測器的作用是將測定被分析樣品經(jīng)微流控芯片系統(tǒng)分離或處理后有關(guān)組成的組成及含量。是分析系統(tǒng)中必不可少的部分。檢測器的總體性能將影響整個微流控分析系統(tǒng)的檢出限、檢測速度、適用范圍、體積等指標(biāo)，是微流控分析系統(tǒng)的關(guān)鍵部位之一。2、微流控芯片檢測器分類、微流控芯片檢測器分類, LIF檢測器是應(yīng)用最早、最多的光學(xué)檢測器，也是目前唯一被檢測器是應(yīng)用最早、最多的光學(xué)檢測器，也是目前唯一被商品化的檢測器，多應(yīng)用于毛細(xì)管電泳芯片中。商品化的檢測器，多應(yīng)用于毛細(xì)管電泳芯片中。特點：特點：n檢測限低：一般可達檢測限低：一般可達10-9mol/L10-12m

2、ol/L，最高可達單分子，最高可達單分子檢測；檢測；n選擇性好；選擇性好；n線性范圍寬。線性范圍寬。不足：不足：n通用性差，體積較大，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，成本高。通用性差，體積較大，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，成本高。2.1.1 激光誘導(dǎo)熒光檢測器激光誘導(dǎo)熒光檢測器(Laser induced fluorescence, LIF)2.1.1 激光誘導(dǎo)熒光檢測器激光誘導(dǎo)熒光檢測器 激發(fā)光源 單色激光 激光器 氬離子激光器 半導(dǎo)體激光器 2.1.1 激光誘導(dǎo)熒光檢測器激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測元件：n 光電倍增管（PMT ）n 單光子雪崩型光電二級管（SPAD） n 電荷耦合器件CCD非共聚焦型非共聚焦型LIF檢測器基本光路

3、結(jié)構(gòu)示意圖檢測器基本光路結(jié)構(gòu)示意圖Analytical Chemistry, Vol. 68, No. 5, March 1, 1996正交型正交型LIF檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)共聚焦型共聚焦型LIF檢測器基本光路結(jié)構(gòu)示意圖檢測器基本光路結(jié)構(gòu)示意圖LED是一種可發(fā)射準(zhǔn)單色光、體積小、壽命長和價廉的發(fā)光器件。雖然在發(fā)光強度、光譜純度、聚光性等方面不及半導(dǎo)體二極管激光器，靈敏度也有所下降，但可以簡化檢測器的結(jié)構(gòu)，大大降低成本。Science 1998，282, 484490. 集成化的集成化的DNA分析芯片分析芯片集成化的集成化的DNA分析芯片分析芯片Science 1998，282, 484490Ana

4、lytical Chemistry, Vol. 73, No. 18, September 15, 2001液芯波導(dǎo)通道微芯片結(jié)構(gòu)和液芯波導(dǎo)通道微芯片結(jié)構(gòu)和LED熒光誘導(dǎo)檢測示意圖熒光誘導(dǎo)檢測示意圖2.1.3 集成一次性微流控芯片的便攜式熒光檢集成一次性微流控芯片的便攜式熒光檢測系統(tǒng)測系統(tǒng)CHEN Xing et al.Nanotechnology and Precisio Engineering,2009,7(2):127-131特點：n可測定的物質(zhì)種類多；n結(jié)構(gòu)簡單。不足：n相對靈敏度低。n當(dāng)前微流控芯片紫外吸收光度檢測存在的主要問題是檢測靈敏度較低，難以滿足以低濃度生化樣品為主要對象的檢

5、測要求。解決的辦法除了優(yōu)化檢測器光路結(jié)構(gòu)外，更多的應(yīng)該從微流控芯片本身來考慮。芯片材質(zhì)必須選用石英等紫外吸收小的材料，還應(yīng)鼓勵通過增加光程或集成樣品預(yù)濃縮單元如等速電泳、樣品堆積等來提高檢測的靈敏度。n普通光程吸收光度檢測芯片常用的玻璃，塑料等芯片材料對紫外線都有較大吸收，不適宜用于紫外檢測，石英或PDMS等紫外吸收小的芯片材料是較為合適的選擇。紫外吸收光度檢測器紫外吸收光度檢測器n固定波長n可變變長n多波長快速掃描2.2.1 短光程吸收檢測池吸收光度檢測器短光程吸收檢測池吸收光度檢測器檢測偶氮砷-U（）金屬配合物，檢出限達23ug/L2.2.1 短光程吸收檢測池吸收光度檢測器短光程吸收檢測池

6、吸收光度檢測器2.2.2 長光程吸收光度檢測長光程吸收光度檢測2.2.2 長光程吸收光度檢測長光程吸收光度檢測n增加芯片吸收光程能將檢測靈敏度提高l2個數(shù)量級。n然而過度增加光程使峰展寬，柱效降低。n選擇通過增加光程長度來提高靈敏度，要考慮其對柱效的影響，最終找到一個既能提高靈敏度而又不會顯著降低柱效的合適光程。2.3 化學(xué)發(fā)光檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器 基態(tài)的分子吸收化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量，躍遷至激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回基態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。2.3.1 普通化學(xué)發(fā)光普通化學(xué)發(fā)光2.3.1 普通化學(xué)發(fā)光普通化學(xué)發(fā)光2.3.2 電致化學(xué)發(fā)光檢測器電致化學(xué)發(fā)光檢測器脯氨酸的LOD為 1

7、.2molL，線性范圍5600molL 2.4 電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器2.4.1 安培檢測器安培檢測器2.4.1 安培檢測器安培檢測器 安培檢測法具有操作簡便、背景噪聲電流小等優(yōu)點，1998年由Woolley等首次在芯片電泳上實現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)展成為微流控芯片中應(yīng)用最多的一種電化學(xué)檢測方式。 安培法不是通用型檢測方法，它要求被檢測物質(zhì)具有電化學(xué)活性，如果沒有則應(yīng)通過衍生反應(yīng)產(chǎn)生具有電化學(xué)活性的基團或者在溶液中加入具有電化學(xué)活性的物質(zhì)以實現(xiàn)對被測物如DNA、蛋白質(zhì)和氨基酸的間接檢測。 安培檢測法的類型芯片分離通道中的電流一般在幾到幾十個微安，而安培檢測的工作電極上產(chǎn)生的電流一般在納安級甚至更小，所以

8、在安培檢測法中如何減小甚至隔離分離電壓對檢測的影響是一個至關(guān)重要的問題。根據(jù)隔離分離電壓的方式，安培檢測器可分為離柱式（off -colunmn）和端柱式（end-column）。2.4.1 安培檢測器安培檢測器n工作電極的材料 碳電極 金屬電極 化學(xué)修飾電極 Four configurations for aligning the working electrode in amperometric detection that facilitate isolation of the EC detector from the separation voltageSusan M. Lunte，e

9、t al. Electrophoresis 2004, 25, 352835492.4.1 安培檢測器安培檢測器-陣列工作電極陣列工作電極芯片毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管電泳-陣列工作電極安培檢測系統(tǒng)陣列工作電極安培檢測系統(tǒng)2.4.2 電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器 根據(jù)組分帶電組分對溶液電導(dǎo)率的貢獻而進行檢測的。是一種通用型的檢測器，尤其適用于檢測無機離子、氨基酸等小分子離子的檢測。 易于微型化和集成化2.4.2 電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器n接觸式電導(dǎo)檢測器n非接觸式電導(dǎo)檢測器接觸式電導(dǎo)檢測器接觸式電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測芯片結(jié)構(gòu)及電導(dǎo)電極示意圖電導(dǎo)檢測芯片結(jié)構(gòu)及電導(dǎo)電極示意圖 接觸式電導(dǎo)檢測器由于工作電極和通道里的溶液

10、直接接觸，可能會有以下問題：n檢測系統(tǒng)難以與電泳分離電壓有效隔離，由于共地產(chǎn)生漏電干擾，使基線噪聲大。n反應(yīng)產(chǎn)生的氣泡或電極表面的污染均會影響檢測n通道流體中的某些成分會吸附在傳感電極表面，改變電極的性質(zhì)。2.4.3 電位檢測法電位檢測法2.4.3 電位檢測法電位檢測法電位檢測示意圖電位檢測示意圖復(fù)合式電化學(xué)檢測法復(fù)合式電化學(xué)檢測法 復(fù)合式電化學(xué)檢測法是將多種電化學(xué)檢測方式聯(lián)用使用可以充分發(fā)揮每種檢測方式的優(yōu)點，相互補充，實現(xiàn)更多被分析物的同時分離和檢測，因而也得到了廣泛的關(guān)注。 Wang和Pumera發(fā)展了一種新型的可以實現(xiàn)非接觸電導(dǎo)和安培法同時檢測系統(tǒng)。CE microchip syste

11、m with a dual amperometric/conductivity detection system: (a) glass microchip, (b) run buffer reservoir, (c) sample reservoir, (d) unused reservoir, (e) aluminum electrodes for contactless conductivity detection, (f) channel outlet,(g) thick-film working electrode for amperometric detection.Erkang W

12、ang,et al.Electrophoresis 2005, 26, 687693n雙通道檢測器是指將兩種檢測器同時集成在芯片上，以實現(xiàn)對管道內(nèi)信號變化的同時檢測。雙通道檢測可獲得更多分析物質(zhì)的信息，更能真正體現(xiàn)微全分析的概念。n近年來，在玻璃電泳芯片上集電導(dǎo)和熒光雙通道檢測器，實現(xiàn)了對無機離子、熒光素和氨基酸等物質(zhì)的同時在線檢測，其將接觸式電導(dǎo)(CCD)檢測器與LED檢測器同集一芯片上時檢測帶具有光學(xué)活性和非具有光學(xué)活性的物質(zhì)，拓寬了檢測對象的范圍。Fig. 1 A scheme of the dual detector. (A) Box for circuitboard; (B) bot

13、tom board; (C) contactless electrode plate; (D)thin microchip. (1) LED; (2, 3) the electrodes of contactlessconductivity detection; (4) pinhole; (5, 6) wires connectingthe electrodes of contactless conductivity detection withthe circuit board; (7) cut off filter; (8) photodiode; (9, 10)cables connec

14、ting the photodiode with the circuit board.Zuan-guang Chen,et al.analytica chimica acta 621 (2008) 171177 集成電導(dǎo)檢測器應(yīng)用于實際樣品是其發(fā)展的必然趨勢，而如何有效排除實際樣品中的干擾組分對檢測的影響是電導(dǎo)檢測在實際樣品應(yīng)用中的關(guān)鍵所在。 實現(xiàn)高通量是微流控芯片研究中提高分析效率的重要研究目標(biāo)之一，因此，多通道陣列式檢測器的研究也成為了熱點，而電導(dǎo)檢測器易于微型化的優(yōu)勢特別適于與高通量芯片集成。 微流控芯片集成電導(dǎo)檢測器具有操作方便、使用壽命長等特點，尤其適合離子化合物的分離分析。其加工工

15、藝與MEMS技術(shù)兼容，使其在微流控的集成化、微型化方面顯示出強大的發(fā)展?jié)摿?。檢測電極在微流控芯片上可采用不同的布置方式，并結(jié)合芯片微管道網(wǎng)絡(luò)本身靈活多樣的特點，設(shè)計出多種多樣具有各自特點與功能的微流控芯片集成電導(dǎo)檢測器。其可應(yīng)用于生化樣品和實際樣品的檢測，顯示出芯片集成電導(dǎo)檢測器具有巨大的潛在商業(yè)價值。n質(zhì)譜（MS）技術(shù)能夠提供試樣組分中分子的結(jié)構(gòu)和定量信息。電噴霧離子化（ESI）和基質(zhì)輔助激光解析離子化(MALDI)技術(shù)使其在特定的條件下電離時依然可以保持生物大分子的非共價相互作用，使得質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽的研究中必不可少。nMS檢測的高效率、高靈敏度和高通量迎合了芯片微小樣品量及微流控系統(tǒng)的

16、目標(biāo)，兩者聯(lián)用可滿足基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)等生物分析的需要。n芯片與ESI-MS接口n芯片與MAIDL-MS接口2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS接口接口n外接毛細(xì)管的引入雖然簡化了接口裝置，卻也帶來了一定的死體積。這種死體積的存在在一定程度上稀釋了待測物、延長了組分的遷移時間，使質(zhì)譜分析的分辨率和靈敏度下降。小死體積甚至零死體積接口的研制是這個領(lǐng)域研究的一個熱點，其中以Harrison和Thibault實驗室的工作較為突出。他們在芯片末端鉆一個平面的孔對準(zhǔn)通道，將一根毛細(xì)管插入孔中用環(huán)氧膠固定，使毛細(xì)管和通道連接的死體積大大降低。n由于傳統(tǒng)的鞘流液輔助的電噴霧接口對樣品的稀釋作用明顯，造成檢

17、測靈敏度低，因此一般采用無鞘流液輔助的納米電噴霧接口。較為普遍方法是將連接在芯片上的毛細(xì)管的末端拉細(xì)至220nm形成“納米”噴頭，或者通過一個套管與制備好的納米噴頭連接，不僅節(jié)省一整套輔流或液接部件，還簡化了接口的復(fù)雜性。但是此結(jié)構(gòu)的接口需要在納米噴頭的末端鍍上金屬或?qū)щ姼叻肿訉樱蛘咴诩{米噴頭中插人電極絲用于施加ESI的電壓。不同死體積的芯片不同死體積的芯片毛細(xì)毛細(xì)管連接管連接2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS接口接口Analytical Chemistry, Vol. 71, No. 15, August 1, 1999微流控芯片通過鞘和霧化器微流控芯片通過鞘和霧化器-ESI聯(lián)用示意圖聯(lián)

18、用示意圖2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS接口接口-2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS質(zhì)譜實時檢測酯化反應(yīng)2.5.2 芯片與MALDI-MS接口 與ESIMS相比MALDIMS更適于用作微流控分析系統(tǒng)的檢測器。因為它具有下述特點：n對樣品組成要求低，能耐高濃度鹽和非揮發(fā)性緩沖劑(包括芯片電泳體系中常用的硫酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽等)。n靈敏度高。樣品量只需1pmol甚至更低。n譜圖中單電荷、雙電荷的分子離子峰很強，便于峰信號重組和解析。 由于MALDI離子化過程中通常要求樣品與基質(zhì)共結(jié)晶，要實現(xiàn)微流控芯片微液中流體系與MALDI離子源的直接聯(lián)用仍行在很大的困難。就目前的發(fā)展來看微流控芯片與MA

19、LDIMS的聯(lián)用仍處于起步階段。2.6 其他檢測其他檢測激光熱透鏡檢測器機構(gòu)示意圖激光熱透鏡檢測器機構(gòu)示意圖優(yōu)點：其檢測靈敏度很高，可接優(yōu)點：其檢測靈敏度很高，可接近熒光檢測方法的水平。近熒光檢測方法的水平。不足：但裝置較為精密和復(fù)雜，不足：但裝置較為精密和復(fù)雜，很難微型化，由此其應(yīng)用尚不廣很難微型化，由此其應(yīng)用尚不廣泛。泛。2.6.2 折光率檢測器折光率檢測器2.6.2 折光率檢測器折光率檢測器2.6.3 分子發(fā)射光譜檢測器分子發(fā)射光譜檢測器離子體發(fā)射光譜檢測芯片結(jié)構(gòu)示意圖離子體發(fā)射光譜檢測芯片結(jié)構(gòu)示意圖發(fā)射光譜檢測裝置示意圖發(fā)射光譜檢測裝置示意圖1.氣體進口 2.氣體出口3.壓力傳感器接口

20、4.電極 5.等離子腔6.電極連接端7.進口通道 8.出口通道對鈉離子的檢測為對鈉離子的檢測為1ug/L2.7 紙質(zhì)微流控芯片與商用電化學(xué)檢測器聯(lián)用紙質(zhì)微流控芯片與商用電化學(xué)檢測器聯(lián)用n紙質(zhì)微流控芯片與電化學(xué)檢測器聯(lián)用為開發(fā)簡易、 便攜化的診斷平臺提供了一種新的手段。近期， 美國哈佛大學(xué)的Nie等研制了一種新型紙質(zhì)微流控芯片， 可替代商品化的血糖試紙條， 并與血糖檢測儀配合使用， 實現(xiàn)了對血液樣本內(nèi)葡萄糖的定量檢測。該芯片化試紙條具有降低檢測成本、 擴展檢測范圍的潛力。 George M. Whitesides et al.Lab Chip, 2010, 10, 3163-3169 該芯片化試紙條具有降低檢測成本、 擴展檢測范圍的潛力。利用這種新型芯片試紙條進行血糖檢測， 檢出限可達26mg/dL ， 最小樣品消耗量約為50L， 與商用試紙條相當(dāng)。此外，它還可以檢測體液中的膽固醇和乳酸 （檢出限分別為