西北大學研究生科研實驗資助項目申請書(新)doc1

1、年度編號研究生科研實驗資助項目申請書項 目 名 稱 用于黃曲霉毒素定量檢測的金磁 微粒標記快速層析試紙條的研制 申 請 人 姓 名 王 艷 霞 導 師 姓 名 崔 亞 麗 學 科 專 業(yè) 生物化學與分子生物學 申 請 人 單 位 生命科學學院 申 請 日 期 2010年10月9日 西 北 大 學 研 究 生 處二一年九月制一、基本情況項目名稱用于黃曲霉毒素定量檢測的金磁微粒標記快速層析試紙條的研制姓名王艷霞 學號200921017單位名稱生命科學學院專業(yè)生物化學與分子生物學指導老師崔亞麗電子信箱wangyanxia2009ok學位論文題目納米金磁微粒標記技術(shù)在快速定量

2、檢測黃曲霉毒素中的應(yīng)用申請資助金額（元）0.5萬元預計完成時間二年導師是否有配套資助資金是配套資助資金金額0.5萬元二、項目依據(jù)本項目的理論意義和實踐意義、項目創(chuàng)新點、國內(nèi)外研究狀況分析。黃曲霉毒素(Aflatoxins,簡稱AFT)是本世紀60年代初發(fā)現(xiàn)的由曲霉屬中的黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，它是一種肝臟毒素，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的毒性最強的生物毒素之一，AFT同時具有致癌作用。1993年，世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)將其劃定為一類致癌物。目前已經(jīng)在糧食、油料作物的種子、干果、調(diào)味品、發(fā)酵產(chǎn)品和飼料內(nèi)，甚至在酒類等多種農(nóng)產(chǎn)品及制品中發(fā)現(xiàn)了AFT的存在。AFT是含有雙呋喃環(huán)和氧雜萘

3、鄰酮的雜環(huán)化合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AFT有B1、B2、B2a、G1、G2、M1、M2、Q1、Q2a等17種之多，其中AFB1毒性最強。目前建立的針對AFT的檢測方法主要有：薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法、放射免疫測定法、免疫親和柱法和電化學法等。其中高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法、放射免疫測定法、免疫親和柱法等亦可很好的完成定量工作，檢測線可以達到6 ppt。然而這些方法存在操作復雜、過程煩瑣、檢測時間長、勞動強度大，儀器設(shè)備昂貴、需要專門的技術(shù)人員等缺點。快速ELISA、免疫親和柱-熒光計法，電化學等方法同樣需要配備相應(yīng)的儀器設(shè)備。尋求快速、準確且經(jīng)濟可行的檢測

4、方法已成為AFT研究中亟需解決的任務(wù)之一。膠體金層析試紙法在定性檢測方面具有簡單、快速（3-5 min）、靈敏 (4 ng/mL或更低)，無需儀器設(shè)備，可以很方便的在實驗室、農(nóng)場、飼料混合車間等多種場所進行實地測定。更重要的是，該方法檢測成本低，便于廣泛的推廣和應(yīng)用，在AFT檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但該方法依然存在不能實現(xiàn)定量檢測的缺點。 核殼型磁性納米微粒是一種金包被的Fe3O4納米粒子，該微粒中的Fe3O4具有超順磁性，表面包被的金又具有納米金的光學性質(zhì)；其表面經(jīng)過功能化修飾后，金磁微粒具有良好的分散性和在緩沖液中抗團聚能力，同時末端的功能化基團能偶聯(lián)各種生物大分子（特定的核酸片段、抗

5、體、抗原等）。這些特性使該磁性納米微?？梢院芎玫挠糜卺t(yī)學領(lǐng)域和生物分子的定性定量檢測；既方便快捷，又可實現(xiàn)可目視化。本研究正是充分利用了納米金磁微粒的這些特性，用納米金磁微粒代替膠體金，研制金磁微粒標記快速層析檢測試紙條，實現(xiàn)對黃曲霉毒素的定性以及定量測定。該方法既可克服膠體金層析試紙不能定量的缺陷，又具有試紙檢測的巨大的優(yōu)越性，具有廣闊的應(yīng)用前景。三、研究基礎(chǔ)1.近期已取得的與本項目有關(guān)的主要研究成果1.近期已取得的與本項目有關(guān)的主要研究成果在本實驗室已有工作的基礎(chǔ)上，對合成的核殼型磁性納米微粒進行表面功能化修飾，得到了具有納米光學效應(yīng)的超順磁性納米金磁微粒，以下是相關(guān)的研究結(jié)果：（1）合成

6、得到納米級金磁微粒，其TEM照片及表面Zeta電位的檢測結(jié)果如下： Zata potential：40.5mv（2）具有較高穩(wěn)定性的納米金磁微粒，具備特有的光學效應(yīng)，結(jié)果如圖所示：在經(jīng)過不同方式處理后的納米金磁微粒，具有特有的顏色，照片如下圖所示：由于納米級金磁微粒兼有超順磁性以及膠體金的光學性質(zhì)，該材料是分子檢測的良好的標記材料，通過前期的摸索實驗，已經(jīng)能夠用在檢測人絨毛膜促性腺激素(HCG)，檢測結(jié)果如下圖所示：2. 已有研究條件生物化學與分子生物學專業(yè)依托國家微檢測系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，中心以集成生物學、化學、材料學、精密機械加工、光電子檢測等領(lǐng)域的前沿技術(shù)和多學科交叉為特點，通過裝置微

7、型化，實現(xiàn)生物醫(yī)藥領(lǐng)域微量化檢測的高度集成。中心現(xiàn)有工程技術(shù)研究人員六十余人（包括9位海外專家），培養(yǎng)及共同培養(yǎng)博士、碩士近60人，微檢測領(lǐng)域技術(shù)帶頭人10人。已建成微陣列系統(tǒng)、納微米磁性材料、細胞色素酶P450藥物篩選和個體化用藥、人血液代用品等技術(shù)平臺。承擔國家“十五”“十一五”863重大專項等國家級項目十余項。開發(fā)出了多項具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新產(chǎn)品和新技術(shù)，包括四大類50余種新產(chǎn)品和新儀器設(shè)備。申請專利60余項，獲授權(quán)20項（美國專利1項）。“磁性復合微粒及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用”獲2004年陜西省科學技術(shù)進步一等獎。目前已同國內(nèi)外三十多家科研機構(gòu)與企業(yè)形成廣泛合作，建立了具有創(chuàng)新發(fā)展能

8、力的微檢測系統(tǒng)研發(fā)體系和產(chǎn)業(yè)雛形。本課題組經(jīng)過13年的努力，已研制出具有自主知識產(chǎn)權(quán)和功能獨特的新型磁性微粒，在已有的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的成果基礎(chǔ)上，項目組對原始技術(shù)不斷的進行應(yīng)用創(chuàng)新和產(chǎn)品開發(fā)，結(jié)合膠體金表面生物分子可修飾性和磁性納米粒子超順磁性雙重特質(zhì)，將單質(zhì)金還原在磁性氧化物粒子表面，發(fā)明了核殼型Fe3O4/Au磁性微粒；在修飾有功能團的氧化物粒子表面組裝納米金，發(fā)明了組裝結(jié)構(gòu)的Fe3O4/Au磁性微粒，項目組將上述兩種微粒命名為金磁微粒（GoldMag Particles）；該成果已獲授權(quán)專利11項，其中美國發(fā)明專利1項，中國發(fā)明專利9項，實用新型專利1項；針對新型磁性微粒合成和應(yīng)用產(chǎn)品

9、的拓展升級，申請了中國發(fā)明專利21項，其中已公開11項，圍繞核心技術(shù)原始創(chuàng)新和應(yīng)用產(chǎn)品集成創(chuàng)新的專利群已經(jīng)形成；在國內(nèi)外發(fā)表相關(guān)論文40余篇，納米金磁微粒的光學性質(zhì)及應(yīng)用研究還有許多值得開展研究的工作。四、研究方案項目研究內(nèi)容、研究思路、實驗方法（包括重點難點、解決途徑）等。本項目的內(nèi)容包括：1、對合成的核殼型磁性納米微粒進行表面功能化修飾1）酸處理去除納米金磁微粒未包裹的氧化物粒子（通過實驗已基本掌握了酸處理除去氧化物粒子的條件）。2）將酸處理后核殼型納米金磁的表面功能化修飾，主要原理就是 Au與SH-的反應(yīng)使納米金磁表面帶有一層功能基團使其具有很好的分散性和具納米金光學性質(zhì)，同時在PBS，

10、生理鹽水的條件下不發(fā)生團聚，能更便于偶聯(lián)生物分子而仍然具有好的分散性和光學性質(zhì)（這一部分內(nèi)容通過實驗已經(jīng)基本獲得了非常好的實驗結(jié)果。2、 AFB1完全抗原的制備1）優(yōu)化乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC）法制備AFB1完全抗原的條件。2）AFB1完全抗原的鑒定與評價：包括測定抗原濃度、純度和特異性以及蛋白偶聯(lián)率。3、金磁標記抗體層析試紙條檢測黃曲霉毒素1）金磁標記抗體的制備：優(yōu)化金磁標記抗體的條件和優(yōu)選最佳的標記抗體稀釋液，以保證標記抗體在試紙條上順利展層。2）試紙條的組裝：優(yōu)選試紙條組件材料，并以適宜的結(jié)合墊處理液處理結(jié)合墊。然后按一定的規(guī)格組裝試紙條。金磁標記試紙條檢測黃曲霉毒素的原

11、理如下：2）檢測檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色條帶，則樣品呈未出現(xiàn)條帶，試紙條檢測結(jié)果無效。3）確定試紙條的檢測限以及陰性。如果僅質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，樣品呈陽性。如果質(zhì)控線對試紙條使用效果的進行初步評價與ELISA法、HPLC法進行比較并確認同時測試試紙條的特異性、穩(wěn)定性。 4）通過磁信號對試紙條上的黃曲霉毒素進行定量檢測，這是金磁標記試紙條最突出的優(yōu)點，既定性又定量。通過以上方法進行黃曲霉毒素的檢測能夠比膠體金層析試紙的檢測方法更靈敏同時做到定量檢測。通過對核殼納米金磁微粒的表面功能化修飾能克服納米金在不同緩沖液中發(fā)生團聚而影響后續(xù)的生物分子的檢測，同時具有功能化的末端（如羧基末端）的金磁微粒能

12、夠比納米金更快速牢固的偶聯(lián)生物分子。具有磁性的Fe3O4且不需要高速離心僅需要磁性分離架就能快速方便完成偶聯(lián)不同的生物分子。并且具有金殼層的表面保持了納米金特有的光學性質(zhì)，從而實現(xiàn)了對黃曲霉毒素的快速定量檢測。為檢驗新方法的建立奠定基礎(chǔ)。參考文獻：1 Hye-Young Park, Mark J. Schadt, Lingyan Wang, I-Im Stephanie Lim, Peter N. Njoki, Soo Hong Kim, Min-Young Jang, Jin Luo, and Chuan-Jian Zhong. Fabrication of Magnetic CoreShe

13、ll Fe OxideAu Nanoparticles for Interfacial Bioactivity and Bio-separation. Langmuir 2007, 23, 9050-90562 Anand Gole, John W. Stone, William R. Gemmill, Hans-Conrad zur Loye, and Catherine J. Murphy. Iron Oxide Coated Gold Nanorods: Synthesis, Characterization, and Magnetic Manipulation3 D. Caruntu,

14、 B. L. Cushing, G. Carunt and C. J. OConnor, Attachment of Gold Nanograins onto Colloidal Magnetite Nanocrystals. Chem. Mater., 2005, 17, 33983402.4 Creighton ET. 1990. Darkfield microscopy for the detection and identification of Treponema pallidum, p.49-62. In S.A. Larsen, E.F.Hunter and S.J.Kraus

15、(ed.), A manual of tests for syphilis. American Public Health Association, Washington, D.C5Nichols HJ, Hough WH. Demonstration of Spirochaeta pallida in the cerebrospinal fluid J. JAMA. 1913, 60: 108-1106 Parker W. B.， Cheng， Y. C. Metabolism and mechanism of action of 5-fluorouracil J. Pharmacology

16、 & therapeutics， 1990， V 48(33): 381-3957 Ambrosi, A., Castaneda, M., Killard, A., Smyth, M., Alegret, S., Merkoci, A., 2007. Anal.Chem. 79, 52325240.8 Burke, A., Yilmaz, E., Hasirci, N., 2000. Turk. J. Med. Sci. 30, 341348.Cervino, C., Weber, E., Knopp, D., Niessner, R., 2008. J. Immunol. Metho

17、ds 329,184193.9 Fremy, J., Usleber, E., 2003. J. AOAC Int. 86, 868871.10 Goryacheva, I.Y., De Saeger, S., Eremin, S.A., Van Petheghem, C., 2007. Food Addit.Contam. 24, 11691183.11 Kang, Y.S., Risbud, S., Rabolt, J.F., Stroeve, P., 1996. Chem. Mater. 8, 22092211.12Kolosova, A.Y., De Saeger, S., Siban

18、da, L., Verheijen, R., Van Peteghem, C., 2007. Anal.Bioanal. Chem. 389, 21032107.13Kolosova, A.Y., Sibanda, L., Dumoulin, F., Lewis, J., Duveiller, E., Van Petheghem, C.,14De Saeger, S., 2008. Anal. Chim. Acta 616, 235244.15Kralj Cigic, I., Prosen, H., 2009. Int. J. Mol. Sci. 10, 62115.16Krska, R., Schubert-Ullrich, P., Molinelli, A., Sulyok, M., MacDonald, S., Crews, C.,2008. Food Addit. Contam