高效液相色譜法原理與應(yīng)用(詳細(xì)版)

1、1高效液相色譜法原理與應(yīng)用參考書高效液相色譜及其應(yīng)用液相色譜檢測方法實用高效液相色譜法的建立2第1章 色譜基本原理一、色譜法概述一、色譜法概述1.色譜法的定義與特點色譜法的定義與特點2.色譜法的分離原理色譜法的分離原理3.色譜法的特點色譜法的特點4.色譜法的分類色譜法的分類31.色譜法的定義茨維特的實驗茨維特的實驗4 色譜分離效果圖5因此因此 色譜法是一種色譜法是一種分離分離方法。方法。 它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。兩相作相向運動。 Chromatography 將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。將色譜法用于分析中，

2、則稱為色譜分析。 色譜分析是一種分離、分析法。色譜分析是一種分離、分析法。6 2、色譜法分離原理 當(dāng)流動相中所攜帶的混合物流過固定相當(dāng)流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用力的作用)。由于混合物中各組分在由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有上有差異，與固定相發(fā)生差異，與固定相發(fā)生作用的大小作用的大小也有差也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出而按先后不同的次序從固定相中流出。73、色譜法的分類 按流動

3、相狀態(tài)的不同，可分為按流動相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法氣相色譜法 (GC)液相色譜法液相色譜法 (LC)超臨界流體色譜超臨界流體色譜 (SFC)8什么是氣相色譜法？ 以氣體為流動相的色譜法以氣體為流動相的色譜法 Gas Chromatogaphy，簡稱簡稱GC 適合分離分析適合分離分析易汽化易汽化（在（在- 190-500范圍內(nèi)有范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易穩(wěn)定、不易分解、不易反應(yīng)反應(yīng)的樣品，特別適合用于的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體同系物、同分異構(gòu)體的的分離。分離。9應(yīng)用舉例（應(yīng)用舉例（GC）10什么是液相色譜法？ 以液體為流動相的色譜法

4、以液體為流動相的色譜法 Liquid Chromatogaphy，簡稱簡稱LC 適合分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、適合分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。離子型的樣品。11按固定相使用的形式可液相色譜法又可按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為：分為：柱色譜（柱色譜（Column Chromatography） 將固定相裝在色譜柱內(nèi)將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜（紙色譜（Paper Chromatography） 用濾紙做固定相或固定相載體的色譜用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（薄層色譜（Thin Lay Chromatography） 固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上固定相均勻涂在玻璃板或

5、塑料板上 12TLC的應(yīng)用 1 2 3 4 5 6 7 8 9Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Ginsenoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1人參、西洋參和三七藥材的鑒別人參、西洋參和三七藥材的鑒別13min102030405060mAU-505101520253035 DAD1 A, Sig=280,16 Ref=550,10

6、0 (H:1DATAHUPINGDANSHEN6.D)丹參藥材有效成分的HPLC圖譜1. Danshensu; 2. Protocatechuic acid; 3. Protocatechualdehyde; 4. Caffeic acid; 5. Salvianolic acid F; 6. Salvianolic acid D; 7. Salvianolic acid J / isomer; 8. Salvianolic acid E; 9. Rosmarinic acid; 10. Lithospermic acid; 11. Salvianolic acid B; 12. Salvia

7、nolic acid B / E /isomer ; 13. Salvianolic acid A; 14. Dihydrotanshinone I; 15. Tetrahydrotanshinone / isomer; 16. Cryptotanshinone; 17. Tanshinone I; 18. Tanshinone IIA 1234568710911121615141317181415p拖尾峰拖尾峰p伸舌峰伸舌峰p鬼峰、假峰鬼峰、假峰p畸峰畸峰p峰底峰底p基線漂移基線漂移p基線噪聲基線噪聲p譜帶擴(kuò)張譜帶擴(kuò)張16p 死時間死時間( (tM):):完全不保留組分流出系統(tǒng)的時間p 保留

8、時間保留時間( (tR):):p 調(diào)整保留時間調(diào)整保留時間( (tR):):p 死體積死體積( (VM):):p 保留體積保留體積( (VR):): p 調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積( (VR):):0FtVMMMRRttt0FtVRR00)(FttFtVMRRR17R: 分離度tR: 保留時間t0：死時間W：峰底寬度2. 色譜分離基本方程色譜分離基本方程)(2121)1()2(WWttRRR18不同不同R值的峰重疊情況示意圖值的峰重疊情況示意圖R1.5可以得到基線分離分離度R反映的是相鄰兩個峰的分開程度R太小，兩個峰無法徹底分離R太大，分離時間過長，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行業(yè)特殊

9、規(guī)定19kknR114根據(jù)該公式優(yōu)化試驗條件，提高分離度R。從數(shù)學(xué)推導(dǎo)來看，分別增大n，k值，都可以提高分離度。色譜分離基本方程色譜分離基本方程20分離選擇性（分離選擇性（）對分離度（）對分離度（R）的影響）的影響 如果t0=1min=1.64/1.58=1.04 =1.15/0.85=1.35 =0.95/0.63=1.50 改變分離選擇性改變分離選擇性的方法的方法 改用不同的流動相 改變流動相的組成 并非必須大于并非必須大于1.5！ 改變流動相pH值 盡量優(yōu)化前幾種實驗條件提高a值， 改變柱溫 避免改變固定相（買新柱子），以便降低成本 應(yīng)用特殊的化學(xué)效應(yīng) 改變固定相12RRtt21柱效（柱

10、效（n）對分離度（）對分離度（R）的影響）的影響以上兩張譜圖k，, 值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。直觀的看，峰的尖銳程度代表了柱效高低，峰越尖銳，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)（n）的大小衡量柱效的高低22理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計算方法理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計算方法理論塔板數(shù)理論塔板高度HETP=L/n理論塔板數(shù)n越大，柱效越高；理論塔板數(shù)HETP越效，柱效越高22/1)(54. 5WtnR23容量因子（容量因子（k）對分離度（）對分離度（R）的影響）的影響容量因子越大，分離度越大。容量因子越大，分離度越大。 k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1

11、0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00但當(dāng)容量因子大于但當(dāng)容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，大大延長。因此，k的最佳范圍是的最佳范圍是1k20。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖內(nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖冎鶞馗淖冎荔w積，其中改變柱死體積，其中死體積死體積對對k/(k+1)的影響很大。的影響很大。改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法梯度洗提梯度洗提MRMSttVVKk容量因子容量因子24梯度洗提梯度洗脫即程序控制流動相的組成，使在整個分離過程中，溶劑強(qiáng)度按照

12、特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點：分離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。缺點：檢測器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。2526裝置裝置 低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡單、經(jīng)濟(jì)，只需一個泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。 高壓梯度（外梯度）：一般由兩臺高壓泵構(gòu)成，每臺泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。流量精密度高，溶劑的可壓縮性和熱力學(xué)體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的組成。27溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A 高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖28 實現(xiàn)方式實現(xiàn)方式 對

13、于復(fù)雜樣品，線性梯度是最好的。 正相色譜中，常用二氯甲烷加入正己烷來實現(xiàn)。 反相色譜中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的。29溫度的影響溫度的影響n，k都會受到柱溫的影響不要使用過高溫度，以保護(hù)柱子，60度算高溫溫度對平衡常數(shù)有影響，有時會影響出峰順序影響出峰順序，注意對化合物進(jìn)行定性后再定量升溫通?？梢约铀俜蛛x，縮短分析時間，但也不絕對30三、色譜定性與定量方法311. 色譜定性分析(1) 純物對照定性 各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)保留值可作為定性指標(biāo)。32實現(xiàn)方法利用保留時間和保留體積定性 33用相對保留值定性 用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法

14、定性 ,RsRiRsRisiVVttr34 應(yīng)用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。 優(yōu)點：應(yīng)用簡便，不需要其他儀器。 缺點：定性結(jié)果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性35(2) 與其它儀器或化學(xué)方法聯(lián)合定性 離線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法 在線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法36離線聯(lián)用方式收集方法：餾分收集器應(yīng)用范圍：無標(biāo)準(zhǔn)物時，可對較為復(fù)雜的混合物進(jìn)行定性分析缺點：麻煩37在線聯(lián)用方式 與其它儀器聯(lián)用定性 混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口接口導(dǎo)入其它儀器中進(jìn)行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-FTIR、LC-MS 其它儀器相當(dāng)于色譜儀的檢測器。色譜儀的檢測器。 使用

15、范圍：復(fù)雜樣品的定性。 優(yōu)點：不需要標(biāo)準(zhǔn)物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。 缺點：需要特殊儀器或設(shè)備。382 色譜定量分析(1) 色譜定量基礎(chǔ) 色譜定量分析是基于被測物質(zhì)的量與峰面色譜定量分析是基于被測物質(zhì)的量與峰面積成正比積成正比。在一定色譜條件下有：.,是峰面積是絕對質(zhì)量校正因子其中iiiiiAfAfm 39（2）定量要解決的問題）定量要解決的問題 峰面積的測量和計算 校正因子的測量與計算 色譜定量方法及其應(yīng)用40峰面積的測量與計算 積分儀或色譜工作站積分儀或色譜工作站 簡便、速度快，精度高，可達(dá)0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結(jié)果準(zhǔn)確，是色譜發(fā)展趨勢。 手動測量與計算手動測量與計算41峰高

16、乘半峰寬法：適于對稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。)2(85. 015. 0YYhA2/12065. 1YhAYhA1.0204RthA42n重疊峰的測量切線分峰垂線分峰43連線分峰計算機(jī)擬合分峰44校正因子的測量與計算 相對校正因子相對校正因子 由于絕對校正因子與儀器的靈敏度有關(guān)，又由于靈敏度與實驗條件相關(guān)，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準(zhǔn)確，亦無通用性，所以實際工作中使用相對校正因子相對校正因子。45質(zhì)量校正因子 摩爾校正因子 相對響應(yīng)值 siismsmimmAmAfff,isisisMs

17、MiMMmAMmAfff,1iifS被測組分被測組分的質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量分子量分子量46定量方法 校正歸一化法 含歸一化 內(nèi)標(biāo)法 含內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法 外標(biāo)法 含單點校正47n 校正歸一化法100100100%221121 nniiniiifAfAfAfAmmmmmmC推導(dǎo)推導(dǎo)：%100%iiiiiAfAfC48應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍：當(dāng)試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測器上均有響應(yīng)，各組分峰沒有重疊時，可用此法。優(yōu)點優(yōu)點：簡便、準(zhǔn)確，當(dāng)操作條件如進(jìn)樣量等變化時，對定量結(jié)果影響很小，該法適合于常量物質(zhì)的定量。缺點缺點：對該法的苛刻要求限制了它的使用。49面積歸一化法若各組分的定量校正因子相

18、近或相同，則上式可簡化為：%100%iiiAAC50n 內(nèi)標(biāo)法推導(dǎo)推導(dǎo) 將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中。ssiisiAfAfmm1001001100%,sississsiiiifmmAAmAfmAfmmC單點校正51適用范圍：適用范圍：當(dāng)只需測定試樣中某幾個組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時可用。優(yōu)點：優(yōu)點：受操作條件的影響較小，定量結(jié)果較準(zhǔn)確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質(zhì)的分析。缺點：缺點：每次分析必須準(zhǔn)確稱量被測物和內(nèi)標(biāo)物，不適合于快速分析。52內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法（多點校正內(nèi)標(biāo)法） fi,sms/m為常數(shù)K，此時Ci%=K(Ai/As)，以Ci%對A

19、i/As作標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)點：不必測校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡便，適合液體試樣的常規(guī)分析。53n 外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）用于常規(guī)分析用于常規(guī)分析優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單，計算方便。缺點：缺點：結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進(jìn)樣。54單點校正當(dāng)被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量十分接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，計算被測物的含量。%100%ssiiCAAC55（3）定量中的誤差問題 樣品的代表性（樣品的前處理） 進(jìn)樣系統(tǒng)的影響 柱系統(tǒng)的影響 測量誤差 定量結(jié)果的誤差分析56HPLCHPLC主要類型及其選擇主要類型及其選擇

20、 化學(xué)鍵合相色譜法 液固色譜法 離子對色譜法 離子色譜法 體積排阻色譜法57一、化學(xué)鍵合相色譜法1.分類正相鍵合相色譜法(Normal phase chromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強(qiáng)極性化合物反相鍵合相色譜法(Reversed phase chromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應(yīng)用最廣泛58正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出592. 固定相 疏水基團(tuán) 如不同鏈

21、長的烷烴（C8和C18）和苯基等 極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。SiOOHSiOOHSiOOH固定相表面C H SiCl18 373SiOOSiOOSiOO固定相表面C H18 37Si60類型類型分離方式分離方式應(yīng)用特點應(yīng)用特點C-18C-18反相、離子對反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物中等極性化合物C-8C-8反相、離子對反相、離子對與與C-18C-18類似，保留值略小類似，保留值略小C-3,C-4C-3,C-4反相反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基苯基反相反相保留適中，選擇性不

22、同。非極性、中等極性化保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物合物-CN-CN反相、正相反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH-NH2 2反相、正相、離子交換反相、正相、離子交換分離糖類、核苷酸、固醇等分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基二醇基正相正相分離有機(jī)酸、排阻分蛋白質(zhì)等分離有機(jī)酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基醚基反相、正相反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18C-18強(qiáng)強(qiáng)聚苯乙烯基聚苯乙烯基反相反相PHPH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長常用固定相6162 不同廠商固定相的比較

23、633. 流動相 溶劑具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì) 溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性 溶劑的粘度要小 溶劑的沸點不能太低 溶劑的純度要高且價格便宜正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷 反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。644. 影響保留值的因素 溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保留值的影響：溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保留值的影響： 正相：溶質(zhì)極性越強(qiáng)，官能團(tuán)越多，保留值越大正相：溶質(zhì)極性越強(qiáng)，官能團(tuán)越多，保留值越大 反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。溶反相：溶質(zhì)

24、極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。溶質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保留值大。大，保留值大。6566 烷基鍵合固定烷基鍵合固定相特性對保留相特性對保留值的影響：值的影響： 反相：鍵合相反相：鍵合相烷鏈長，烷鏈長，k大，大，選擇性好。選擇性好。67 溶劑性質(zhì)：溶劑性質(zhì)： 正相：溶劑極性越弱，保留越大正相：溶劑極性越弱，保留越大 反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強(qiáng)。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強(qiáng)，保越強(qiáng)。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強(qiáng)，保留值越大。留值越大。68 鹽的影響：鹽的

25、影響： 通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機(jī)鹽使通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機(jī)鹽使流動相表面張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使流動相表面張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使k增加，增加，對離子型溶質(zhì)，對離子型溶質(zhì)，k下降。對堿性有機(jī)物有改善峰形下降。對堿性有機(jī)物有改善峰形的作用。的作用。 pH值：值： 加入酸、堿或緩沖液，控制加入酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿?；?，改善峰形。用于分析弱酸、堿。695 應(yīng)用70二.液固色譜法 Liquid Solid Chromatography1. 固定相固定相 極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等 非極性：活性炭、

26、高分子多孔微球、碳多孔微球等2. 流動相流動相 硅膠為固定相時：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)合適的洗脫強(qiáng)度。 可用水對硅膠進(jìn)行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑713. 影響保留值的因素 樣品分子結(jié)構(gòu)樣品分子結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)分子的官能團(tuán)極性增加，保留值增加溶質(zhì)分子的官能團(tuán)極性增加，保留值增加 溶質(zhì)分子的官能團(tuán)數(shù)目增加，保留值增加溶質(zhì)分子的官能團(tuán)數(shù)目增加，保留值增加 保留值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān)保留值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān) 保留值與吸附中心的幾何分布有關(guān)保留值與吸附中心的幾何分布有關(guān) b吸附劑吸附劑 吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保留值越大吸附劑的孔徑越小，表

27、面積越大，保留值越大 吸附劑的活性越強(qiáng)，保留值越大，活性由流動相中的含水量來吸附劑的活性越強(qiáng)，保留值越大，活性由流動相中的含水量來控制控制 c流動相流動相724. 應(yīng)用應(yīng)用 中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等 不同極性取代基的化合物 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離7374三、離子對色譜法 Ion-pair chromatography 1.1.基本原理基本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A A+ +）相反的離子）相反的離子(B(B- -) )（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成

28、弱極性的離子對（中性締合使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜物）的分離方法。多為反相離子對色譜 7576772. 固定相、流動相和離子對試劑 固定相固定相多為多為C18,C8C18,C8反相鍵合相反相鍵合相 流動相流動相是以水為主的緩沖液，或水是以水為主的緩沖液，或水- -甲醇、水甲醇、水- -乙腈等混乙腈等混合溶劑合溶劑 離子對試劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，子，ClOClO4 4- -，十二烷基磺酸根等，十二烷基磺酸根等783. 影響保留值的因素pH的影響的影響：改善分離選擇性的有效方

29、法。 反相中，對于陰離子的分離，pH下降，k減小。離子對試劑的性質(zhì)與濃度離子對試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大，k越大。溶劑的極性溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強(qiáng)度增大，k下降。洗脫強(qiáng)度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關(guān)離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度：反相中，離子強(qiáng)度增加，溶質(zhì)k下降794. 應(yīng)用有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等胺類、酚類、藥物、染料等反相離子對色譜分析有機(jī)酸固定相：C18烷基鍵合相流動相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇 1. 4-氨基苯甲酸；2. 3-氨基苯甲酸

30、；3. 4-羥基苯甲酸； 4. 3-羥基苯甲酸；5. 苯磺酸； 6. 苯甲酸； 7. 甲苯-4-磺酸80色譜類型（Mode）固定相（Stationary Phase）流動相(Mobile Phase)主要適用范圍(Compound Sepatated)正相色譜（Normal-Phase）硅膠硅膠、氰基、氨基有機(jī)溶劑在水中絕對不溶解的物質(zhì)或同分異構(gòu)體反相色譜色譜(Reversed-Phase)C-18,C-8,C-4,C-2水/有機(jī)溶劑中性、弱酸性、弱堿性物質(zhì)離子對色譜(Ion-Pair)C18,C-8水/有機(jī)溶劑離子對試劑離子離子交換色譜(Ion Exchange)陰離子和陽離子交換劑水相/緩

31、沖鹽對離子離子體積排阻色譜(Size Exclusion)聚酯、硅膠水相(GPC)有機(jī)相(GPC)大分子量化合物聚合物液相色譜常用類型總結(jié)：81第3章 高效液相色譜法的建立與應(yīng)用82我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表： 83 高效液相色譜儀的分析原理 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu) 色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理高壓泵進(jìn)樣器檢測器色譜工作站色譜柱84HPLC有以下特點 高壓壓力可達(dá)150300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。 高速流速為0.110.0 ml/min。 高效可達(dá)10000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。 高靈敏度紫外檢測器靈敏度可

32、達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。85HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點： 速度快通常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。 分辨率高可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。 靈敏度高紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。 柱子可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。 86 In which materials ? In what concentration ? Which sample ? With which technique ?一一. .高效液相色譜法的建立高

33、效液相色譜法的建立1.了解樣品87 What is the sample ? Concentration of the interested component Contaminant Characteristics of the sample Structure Molecular weight pKa Solubility88 溶于水排阻色譜，水為流動相 相對分子質(zhì)量 2000 不溶于水排阻色譜，非水流動相 同系物分配色譜 不溶于水 異構(gòu)體吸附色譜樣品 分子大小差異排阻色譜 反相液一液色譜 相對分子質(zhì)量 溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動相 堿陽離子交換色譜 溶于水，可離解 酸陰

34、離子交換色譜 溶于水， 離子與非離子反相離子對色譜 892. 選擇合適的分析方法 Analytical technique Column Mobile phase Detector Sample preparation903.分析條件的優(yōu)化 流動相種類與配比 梯度 溫度 流速 檢測波長 進(jìn)樣量91二、高效液相色譜法的應(yīng)用 樣品測定樣品測定1流動相比例調(diào)整流動相比例調(diào)整：由于我國藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調(diào)整流動相（按經(jīng)驗，主峰一般應(yīng)調(diào)至保留時間為615分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質(zhì)的流動相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請注意

35、充分平衡柱。92樣品測定樣品測定 2樣品配制：溶劑；容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。 93樣品測定樣品測定 3記錄時間：第一次測定時，應(yīng)先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長時間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。 94樣品測定樣品測定 4進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10l，而目前多數(shù)HPLC系

36、統(tǒng)采用定量環(huán)（10l、20l和50l），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度） 95樣品測定樣品測定 5計算：由于有些對照品標(biāo)示含量的方式與樣品標(biāo)示量不同，有些是復(fù)合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標(biāo)示，檢驗時請注意。 96方法研究方法研究 1波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。 2流動相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動相。 971. 食品分析98991002.環(huán)境分析101102

37、3.藥物分析103104min102030405060mAU01020304050 DAD1 B, Sig=203,16 Ref=360,100 (HUPINGGSAS0224.D) 人參皂苷的分析1055. 農(nóng)藥分析106第4章 儀器使用細(xì)節(jié)1071.HPLC用水專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；去離子水重蒸；二次或三次重蒸水；采用類似家用的純水機(jī)；市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；其它途徑；1082. 樣品 溶解樣品用溶劑最好是流動性，或者用溶劑強(qiáng)度與流動相相近的溶劑。 進(jìn)樣樣品要求無微粒，樣品溶液均要用0.45m的濾膜過濾。1093.流動相的配制 流動相通常按體積比配制。 流動相在使用前一般都需要過濾，

38、尤其使用了加緩沖鹽的流動相時。 如果沒有自動脫氣裝置，流動相配好后應(yīng)該采用合適的方法脫氣，如超聲波脫氣，真空脫氣、氦氣脫氣等。110 在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途，否則過高的壓力在柱頭上引起損壞。 六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100l

39、的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。4. 六通閥的使用111 防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，。1125.泵的保養(yǎng) 使用流動相盡量要清潔； 進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗； 流動相交換時要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；113色譜柱問題及解決方法：色譜柱問題及解決方法： 保留值和分離度的重現(xiàn)性：影響方法的準(zhǔn)確度與保留值和分離度的重現(xiàn)性：影響方法的準(zhǔn)確度與精密度精密度 譜峰拖尾：分離質(zhì)量下降，

40、精密度下降譜峰拖尾：分離質(zhì)量下降，精密度下降 色譜柱壽命色譜柱壽命6. 色譜柱114115樣品溶劑對分離結(jié)果的影響樣品溶劑對分離結(jié)果的影響116 柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動； 當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈； 要注意流動相的脫氣； 避免使用高粘度的溶劑作為流動相； 進(jìn)樣樣品要提純； 嚴(yán)格控制進(jìn)樣量； 每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品； 每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；117高效液相色譜柱發(fā)展史高效液相色譜柱發(fā)展史19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10 m 的無定型硅膠顆粒

41、。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC 被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5 10 m 球形硅膠。90年代早期，粒徑為 5 m 的高純硅膠，即所謂的 B 型硅膠被發(fā)展，并成為這個行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種 B 型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于 2 m 的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。目前，市場上流行的分析用的 HPLC 硅膠基質(zhì)填料主要為 B 型硅膠。118PLC色譜柱及其填料的特征 HPLC 色

42、譜柱的基質(zhì)材料 硅膠與聚合物 現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征 色譜柱結(jié)構(gòu) 固定相 鍵合相 色譜柱接頭 鍵合相穩(wěn)定性119硅 膠基質(zhì)材料1.目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。2.高機(jī)械強(qiáng)度和高的比表面積。3.可利用直接的廣泛的表面鍵合反應(yīng)來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。4.高效。5.重現(xiàn)性好。6.pH 適用范圍為pH 28。7.具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。120聚合物基質(zhì)材料1.交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。2. pH 穩(wěn)定性好：pH 1 13。3.可以在很寬的范圍內(nèi)進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的

43、需求。4.在中等 pH 條件下對強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。5.填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。6.分離效率相對硅膠而言比較低7.重現(xiàn)性不好121硅 膠 外 形球形硅膠: 現(xiàn)代 HPLC 填料粒徑小 (5 m, 3 m, 5 m柱床穩(wěn)定性差比表面積較小價格便宜122硅 膠 純 度 硅膠純度對強(qiáng)極性化合物的分離最重要。 以前的純度較低的硅膠（稱為 A 型硅膠）, A 型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。 純度高、酸性較弱的硅膠 (稱為 B 型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電

44、離的化合物，特別是堿性化合物。 金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。123硅膠純度M+表面金屬能與螯合化合物絡(luò)合 M Si OH 內(nèi)部的金屬對表面硅羥基具有活化作用強(qiáng)酸性A 型硅膠 C18B 型硅膠C18124硅膠孔徑孔徑作用和效能 60 nm對 HPLC 分析沒有用，會引起峰形拖尾和較低的分離效率60 150 nm對小分子的分離效果理想 (MW 1,000 nm對聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子125硅 膠 粒 徑粒 徑作 用 和 效 能5 m目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3 3.5 m常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑 2 m常應(yīng)用

45、于超快速分離， high throughput, 分離度高7 10 m常用于半制備色譜柱10 20 m常用于制備色譜柱126HPLC 色譜柱結(jié)構(gòu)類 型內(nèi)徑D (cm)柱長(cm)粒徑 (m)分析柱0.3 0.463 - 253 - 10微孔柱0.1, 0.2115, 253 - 8半制備柱0.8 1.010 - 255 - 20制備柱2.0 5.010 - 255 - 20127鍵 合 相 鍵合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅膠、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 離子交換柱): 10% 反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。 C18 和 C8