LAMP檢測(cè)綜述-戴婷婷

1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展戴婷婷1，陸辰晨2，鄭小波2（1南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京210037；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇南京210095；）摘要：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）采用特異識(shí)別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件（6065）下60 min左右進(jìn)行核酸擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)到1091010個(gè)數(shù)量級(jí)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、等溫、操作簡單和檢測(cè)結(jié)果快速等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲、菌物等病原物的檢測(cè)中。本文對(duì)LAMP技術(shù)原理

2、及其在病原物檢測(cè)中的應(yīng)用做了簡要綜述。關(guān)鍵詞： 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；應(yīng)用；檢測(cè)；病原物中圖分類號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： 文章編號(hào)：Application Research Progress Of Loop-Mediated Isothermal AmplificationDAI Ting-ting1; LU Chen-chen2; ZHENG Xiao-bo2(1Southern China Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry, College of Forestry, Nanjing Forestry University

3、, Nanjing, Jiangsu 210037, China；2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract：A new method of gene amplification called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed in recent years. LAMP assay possess characteristic of simpleness,

4、fleetness and high specificity. The whole procedure is very simple and rapid which can be completed in less than 80 min under isothermal conditions employing a set of six specially designed primers of a target gene, by incubating all the reagents in a single tube. LAMP does not require a thermal cyc

5、ler and can be performed simply with a heating block or water bath. Considering the advantags of rapid amplication, simple operation and easy detection, LAMP has potential applications for diagnosis as well as surveillance of infectious diseases in developing countries without requiring sophisticate

6、d equipment or skilled personnel. LAMP has been widely applied to the detection of such pathogens as virus，bacteria, parasite, fungi etc. This article summarized the principle of LAMP，and the application in detection of pathogenic microorganisms.KEY WORDS：Loop-mediated isothermal amplification; appl

7、ication; detection; pathogenic microorganisms核酸擴(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要的研究手段，核酸擴(kuò)增技術(shù)主要包括常規(guī)PCR 為基礎(chǔ)的變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩大類。目前，變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括普通PCR、巢式PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，這些技術(shù)在病原微生物的檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。由于核酸的變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要精密變溫設(shè)備和高級(jí)復(fù)雜的分析儀器，或者對(duì)操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求比較高，且反應(yīng)時(shí)間長，不利于在基層推廣；而病原菌的防控關(guān)鍵在于對(duì)病原微生物的快速、準(zhǔn)確、及早的檢測(cè)并確診。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)于植物

8、病原物的檢測(cè)顯得尤為重要。等溫?cái)U(kuò)增成為核酸擴(kuò)增技術(shù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)就是其中的一種。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是日本學(xué)者Notomi1 等建立了一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。自LAMP檢測(cè)技術(shù)建立14年以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對(duì)病毒、細(xì)菌、寄生蟲、菌物等病原菌的檢測(cè)研究。隨著該技術(shù)體系的完善與發(fā)展，其在分子檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也必將越來越廣泛與深入。本文就該技術(shù)的原理、方法及研究進(jìn)展綜述如下。1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡介1.1 LAMP技術(shù)特點(diǎn)及原理環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是Notomi1等報(bào)道的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該法依賴于識(shí)別保守序列DNA的6個(gè)特異性片段的4條引物（2條外引物和2條內(nèi)引物）和一

9、種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）。反應(yīng)體系一般包括4條引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜堿、Mg2SO4等。LAMP檢測(cè)體系中基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成，擴(kuò)增效率高，可在3060min擴(kuò)增1091010倍，特異性較高，同時(shí)反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂-乳白色沉淀。LAMP技術(shù)的主要原理是DNA在65左右可以處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)1。1.2 LAMP技

10、術(shù)的引物設(shè)計(jì)LAMP技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求非常高，LAMP的2 對(duì)引物分別稱為 FIP、BIP、F3和B3，可識(shí)別靶基因的6個(gè)不同的區(qū)域。F3：正向外引物，F(xiàn)3區(qū)與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)；B3：反向外引物，B3區(qū)域與靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)；FIP：正向內(nèi)引物，由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3'端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5'端的Flc區(qū)域序列相同；BIP：反向內(nèi)引物，由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3'端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1c區(qū)域與靶基因5'端Blc區(qū)域序列相同。內(nèi)引物的兩段DNA短片段可通過TTTT序列連接，也有研究結(jié)果認(rèn)為在內(nèi)部引物之

11、間不加TTTT序列也并不影響等溫?cái)U(kuò)增的結(jié)果，說明TTTT序列在內(nèi)部引物上的連接上并不是必需的。Nagamine2等的研究發(fā)現(xiàn)在LAMP反應(yīng)中加入環(huán)引物（正向環(huán)引物FLB、反向環(huán)引物BLP）能夠明顯加快等溫?cái)U(kuò)增的速度，大大提高了檢測(cè)效率，檢測(cè)效率相對(duì)于沒有加入環(huán)引物時(shí)高出7個(gè)數(shù)量級(jí)。LAMP技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)是用于設(shè)計(jì)引物靶標(biāo)基因的選擇與引物的篩選。靶標(biāo)基因的選擇要確保其在種內(nèi)的不同菌株間高度保守，而在種間變異性較高。選取靶基因一段約130200bp（最長300bp，不可超過500bp）的保守序列，同時(shí)要注重引物之間的距離、引物退火溫度值的高低、引物長度和GC/AT含量等綜合因素。整個(gè)LAMP擴(kuò)增過程

12、是等溫的不需要變性的，為鏈置換和延伸的過程，因此擴(kuò)增產(chǎn)物大小也隨著鏈置換反應(yīng)的進(jìn)行而改變，從而在電泳圖上表現(xiàn)為大小不一的階梯狀的條帶。引物設(shè)計(jì)需要遵循以下原則：要保持引物的退火溫度約5566間，其中F3和B3退火溫度最低（5560間）；F2和B2的退火溫度次之（5961間）；F1c和B1c的退火溫度最高（6466間）。GC含量高者或者GC含量正常時(shí)，取退火溫度范圍的較高值；而AT含量高者取退火溫度范圍的較低值。F2的前端與F3及B2的前端與B3相距在020bp之間，F(xiàn)2的前端與F1c及B2的前端與B1c相距在4060bp之間，F(xiàn)2的前端與B2相距在120180bp之間。設(shè)計(jì)引物時(shí)要防止引物二聚

13、體的產(chǎn)生，特別是引物的3端不應(yīng)存在富AT區(qū)，不能與其它引物互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)可采用軟件PrimerExplorer V4（- Premier5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)與篩選。對(duì)于引物的特異性的驗(yàn)證可通過GenBank中的BLAST進(jìn)行序列比對(duì)（/Blast.cgi），將設(shè)計(jì)好的4條引物分別在GenBank中的BLAST進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，同時(shí)設(shè)計(jì)的引物針對(duì)同種不同地域、寄主來源菌株、同屬不同種的疫霉菌和其它真菌菌株進(jìn)行特異性試驗(yàn)，從而保證LAMP引物的特異性。1.3 LAMP技術(shù)的檢測(cè)方法1.3.1 肉眼觀察法 在 LAMP 反應(yīng)過程中，由于在反應(yīng)過程中能夠產(chǎn)

14、生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，所以可以通過用肉眼直接進(jìn)行觀察來判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行（圖1）。圖1 LAMP反應(yīng)的肉眼觀察試驗(yàn)。左邊-：無白色沉淀；右邊+：白色沉淀Fig.1 Visual turbidity in the form of white precipitate as observed in positive control due to accumulation of magnesium pyrophosphate in proportion to the accumulated amplified products. Left, without template (-); right

15、, with template DNA (+)1.3.2熒光檢測(cè)法 通過肉眼直接觀察白色沉淀來檢測(cè)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果有時(shí)會(huì)存在一定的誤差，所以可采用顏色變化目測(cè)的方式來判斷檢測(cè)結(jié)果，主要通過添加染料和金屬離子指示劑來實(shí)現(xiàn)。目前使用的染料包括PicoGreen、SYBR Green I、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)（HNB）。其中以SYBR Green I和HNB的檢測(cè)靈敏性最高，是鈣黃綠素的10倍3。SYBR Green I在LAMP反應(yīng)結(jié)束后加入，其LAMP反應(yīng)溶液顏色在白光下由橙色變成黃綠色，在紫外光下陽性熒光量明顯增強(qiáng)（圖2），但由于SYBR Green I染料在反應(yīng)結(jié)束開管后加入，反應(yīng)產(chǎn)物

16、形成的氣溶膠可能會(huì)增加LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。相對(duì)于SYBR Green I染料，HNB于擴(kuò)增反應(yīng)前加入，減少LAMP反應(yīng)的污染，其溶液顏色由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色（圖3），陽性結(jié)果和陰性結(jié)果顏色差別明顯，易于判斷。圖2 LAMP反應(yīng)加入SYBR Green I顯色反應(yīng)試驗(yàn)。-：陰性反應(yīng)；+：陽性反應(yīng)Fig. 2 When the tube containing the amplified products incorporating a fluorescent intercalating dye is illuminated with a UV lamp, the fluorescence inte

17、nsity increases圖3 LAMP反應(yīng)加入HNB顯色反應(yīng)試驗(yàn)。-：陰性反應(yīng)呈現(xiàn)紫色；+：陽性反應(yīng)呈現(xiàn)天藍(lán)色Fig.3 When the tube containing the amplified products incorporating HNB is illuminated with naked eyes, the negative reaction remains purple and the positive reaction appears sky blue1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳法 LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰

18、菜的結(jié)構(gòu)。因此，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在經(jīng)過2%的瓊脂糖凝膠糖和EB染色觀察后呈現(xiàn)的是典型的梯型狀條帶（圖4）。圖4 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)LAMP反應(yīng)的靈敏度，以10倍遞度稀釋的大豆疫霉基因組DNA作為反應(yīng)模板（從100 ng uL-1到10 fg uL-1）。LAMP反應(yīng)靈敏度能達(dá)到10 pg L-1 (摘自Dai et al.,2012)Fig.4 Sensitivity of A3aPro-LAMP method using serially diluted genomic DNA (100 ng uL-1-10 fg uL-1) from P. sojae as template (from

19、Dai et al., 2012)1.3.4 實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè) 日本榮研株式會(huì)社利用LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀，專門研制出用于LAMP 檢測(cè)的實(shí)時(shí)終點(diǎn)濁度儀LA-320C，以實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，濁度儀通過每隔 6 s 測(cè)定反應(yīng)管的濁度并繪制成曲線來判斷反應(yīng)結(jié)果。Dai4等對(duì)大豆疫霉進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增，為了驗(yàn)證LAMP反應(yīng)所設(shè)計(jì)的引物的種內(nèi)通用性，采用疫霉菌的不同生理小種作為對(duì)照，并用以水作為陰性對(duì)照以檢測(cè)LAMP反應(yīng)的特異性。當(dāng)發(fā)生 LAMP擴(kuò)增反應(yīng), 產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂白色沉淀，反應(yīng)液的濁度上升，在圖中表現(xiàn)為曲線上升，大豆疫霉的生理小種都產(chǎn)生了濁度曲線，陰性對(duì)照的曲

20、線均沒有變化，表明設(shè)計(jì)的引物具有種特異性。1.4 LAMP技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)LAMP檢測(cè)技術(shù)最主要的優(yōu)勢(shì)在于等溫?cái)U(kuò)增條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，相對(duì)于普通PCR技術(shù)相比其有很多優(yōu)點(diǎn)：（1）在等溫條件下(60°C-65°C)就能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間短，僅需60min左右；（2）因沒有變性的過程所以不需要熱循環(huán)儀器，一個(gè)普通水浴鍋或者等溫保溫瓶即可進(jìn)行LAMP反應(yīng)；（3）特異性較高，4條內(nèi)外引物與靶序列的6個(gè)結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下才能夠進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；（4）鑒定簡便。但作為一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)其不可能是完美的，LAMP檢測(cè)技術(shù)也有些缺點(diǎn)歸納如下：（1）擴(kuò)增片段過小，靶序列長度要控制在 300

21、bp以下；（2）LAMP體系靶標(biāo)選擇和引物篩選較為繁瑣；（3）LAMP反應(yīng)體系容易產(chǎn)生非特異性條帶的擴(kuò)增；（4）操作時(shí)要求比較嚴(yán)格，氣溶膠的污染容易導(dǎo)致結(jié)果的假陽性出現(xiàn)；（5）利用 LAMP技術(shù)的同一套特異性引物未必能檢測(cè)具有單核苷酸差異的不同菌株型或同一株型的病原菌，對(duì)于單堿基核苷酸位點(diǎn)的鑒定適用性較差；（6）相對(duì)于Real-time PCR技術(shù)，LAMP反應(yīng)體系不能對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行定量分析。 2 LAMP 技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用2.1病毒的檢測(cè)2.1.1 流感病毒的檢測(cè) 流感病毒是引起人類流感的病原體之一，屬于正黏病毒科，其分甲型、乙型和丙型流感病毒。流感病毒感染可導(dǎo)致一系列呼吸道疾病

22、，臨床癥狀從輕微的上呼吸道癥狀至急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭，甚至死亡。近年來已建立了針對(duì)季節(jié)性流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒LAMP技術(shù)。Poon5等建立了基于流感病毒基質(zhì)蛋白基因的LAMP方法，可同時(shí)特異性檢測(cè)季節(jié)性 H1、H2和H3亞型，其檢測(cè)靈敏性也較高。聶凱6等針對(duì)人甲型H1N1流感病毒HA序列中8個(gè)基因區(qū)段設(shè)計(jì)了6條特異引物，在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)1.5h，通過HNB的顏色變化做為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于人甲型H1N1流感病毒的檢測(cè)。Imai7等利用RT-LAMP技術(shù)建立了針對(duì)H5亞型高致病性禽流感病毒的檢測(cè)方法，該

23、方法簡便快速、成本低、不需要特殊試劑，靈敏度比普通RT-PCR技術(shù)高100倍，而且可以從15個(gè)血凝素亞型HA中檢測(cè)出H5亞型，具有很高的特異性，在對(duì)高致病性禽流感的病原監(jiān)測(cè)應(yīng)用中具有很高的實(shí)用價(jià)值。李啟明8等建立了RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)用于H5N1亞型禽流感病毒的檢測(cè)，該技術(shù)對(duì)51份感染標(biāo)本的H5N1亞型的HA和NA基因區(qū)進(jìn)行了RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)，并以SYBR Green作為反應(yīng)指示劑，同時(shí)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)濁度監(jiān)控，證明RT-LAMP技術(shù)具有較高的特異性；靈敏結(jié)果也顯示RT-LAMP技術(shù)與Real-time PCR技術(shù)靈敏度一致。2.1.2 SARS冠狀病毒的檢測(cè) 導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸綜合征（S

24、ARS）世界性爆發(fā)流行的病原體是一種新型的冠狀病毒SARS冠狀病毒（SARS-CoV），這是一種RNA單鏈正鏈病毒，可以導(dǎo)致人體以呼吸系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的全身疾病。LAMP技術(shù)針對(duì)急性呼吸道綜合征冠狀病毒（SARS-冠狀病毒）已經(jīng)開發(fā)了檢測(cè)試劑盒。Poon9等對(duì)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)的評(píng)估，評(píng)估結(jié)果顯示LAMP技術(shù)在疾病發(fā)生的前三天檢測(cè)料率稍遜于RT-PCR檢測(cè)，但是LAMP技術(shù)的簡單化、可視化、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)使其具有臨床診斷領(lǐng)域的潛在能力。Thai10等也報(bào)道了SARS冠狀病毒的LAMP檢測(cè)技術(shù)，其設(shè)計(jì)的LAMP特異性引物具有較好的特異性，同時(shí)靈敏度是普通RT-PCR靈敏度的100倍。2.

25、1.3 豬類病毒的檢測(cè) Anne-Lie B11等應(yīng)用RT-LAMP法可在30min60min檢測(cè)出豬水皰病毒（SVDV），通過對(duì)收集的28株SVDV檢測(cè)呈陽性，而其它病毒仍然是陰性；同時(shí)利用血清學(xué)的臨床樣本進(jìn)行靈敏度的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-LAMP檢測(cè)法的靈敏度與Real-time PCR相同；利用糞便樣本進(jìn)行靈敏度的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-LAMP檢測(cè)法的靈敏度比普通PCR技術(shù)更加靈敏。Chen12等基于豬細(xì)小病毒（PPV）非結(jié)構(gòu)蛋白1的4條特異性引物建立了PPV的LAMP檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)證明LAMP是一種簡便、敏感、快速、可靠的PPV檢測(cè)方法。何逸民13等對(duì)LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，LA

26、MP技術(shù)能在63、60 min內(nèi)能夠成功的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型基因。Chen HT14等利用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），研究選用10個(gè)參考株、122個(gè)陽性標(biāo)本和臨床分離株進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明這種檢測(cè)技術(shù)較普通RT-PCR技術(shù)更可靠、更方便、更快速靈敏地診斷出高致病性PRRSV感染。除此之外，LAMP技術(shù)還成功應(yīng)用于非洲豬瘟病毒（ASFV）15、豬瘟病毒（CSFV）16等豬類病毒。2.1.4 偽狂犬病毒的檢測(cè) 偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的家畜和多種野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的急性傳染。偽狂犬病毒（PRV）是一種RNA彈狀病毒，偽狂犬病的臨床

27、癥狀和呼吸、腸道疾病很類似，因此臨床診斷偽狂犬病很困難。En F X17等建立了一種快速、簡便和可靠的偽狂犬病毒（PRV）檢測(cè)系統(tǒng)，針對(duì)PRV DNA結(jié)合蛋白基因利用RT-LAMP技術(shù)成功設(shè)計(jì)了特異性引物檢測(cè)PRV。2.1.5 其它病毒的檢測(cè) 口蹄疫病毒（FMDV）屬于小RNA病毒科，單股正鏈RNA病毒。Dukes J P18等建立了檢測(cè)FMDV的RT-LAMP方法，針對(duì)病毒的3D蛋白聚合酶區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，其能在22 min內(nèi)檢測(cè)出10個(gè)拷貝的FMDV。傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）是一種棒狀RNA病毒，感染一些特異性的魚種，侵染野生和飼養(yǎng)的蛙魚時(shí)能夠引起其大量死亡。Gu

28、nimaladevi等19利用RT-LAMP也建立了IHNV的快速檢測(cè)體系，通過和巢式PCR技術(shù)進(jìn)行靈敏度的比較，發(fā)現(xiàn)RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度是巢式PCR檢測(cè)技術(shù)的10倍，并且操作簡便、成本低，比其他分子檢測(cè)方法更適合用于檢測(cè)IHNV，對(duì)控制和防止魚類傳染病具有重要意義。此外，LAMP技術(shù)也成功應(yīng)用于流行性乙型腦炎病毒20、對(duì)蝦白斑綜合征病毒21、牛病毒性腹瀉病毒22、丙型肝炎病毒23、腮腺炎病毒24、新城疫病毒25等檢測(cè)中。2.2 細(xì)菌的檢測(cè)2.2.1 沙門菌屬的檢測(cè) 沙門菌屬（Salmonella）廣泛分布于自然界中，是包括人類在內(nèi)的所有脊椎動(dòng)物腸道中的常見寄生菌26。人只要經(jīng)口攝入

29、足夠量的細(xì)菌克服胃酸等機(jī)體保護(hù)屏障，定位于小腸即能引起沙門氏菌感染性疾??；沙門菌亦被列入化妝品中微生物的控制指標(biāo)。因此，沙門菌病的防治備受畜牧獸醫(yī)、公共衛(wèi)生和檢驗(yàn)檢疫等有關(guān)部門的關(guān)注，均將沙門菌列為重要的檢測(cè)和控制對(duì)象。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是采用沙門氏菌的分離培養(yǎng)與鑒定，其使用的是腸道鑒別培養(yǎng)基或者選擇性培養(yǎng)基的方法，傳統(tǒng)分離方法所需時(shí)間較長，通常需要5-6天。用 PCR檢測(cè)沙門菌需要設(shè)計(jì)特異性的引物，使用最多的引物則來源于沙門菌屬侵襲性抗原保守基因invA，通過普通PCR的快速檢測(cè)，其具有較好的特異性與靈敏度，但PCR技術(shù)需要瓊脂糖凝膠電泳和熱循環(huán)儀器。Hara-Kudo27等采用LAMP檢測(cè)技術(shù)

30、建立了腸炎沙門氏菌的檢測(cè)體系，同時(shí)比較了LAMP檢測(cè)體系與普通PCR檢測(cè)系的靈敏度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LAMP方法檢測(cè)靈敏度與 PCR方法檢測(cè)靈敏度相比有所提高，且具有良好的特異性。張宏偉28等針對(duì)沙門菌特異性基因invA，設(shè)計(jì)了4條沙門菌屬的 LAMP 檢測(cè)特異性引物，建立了食品中沙門菌的LAMP 檢測(cè)方法；其建立的LAMP技術(shù)特異性好、靈敏度高、與傳統(tǒng)方法相比可節(jié)省大量時(shí)間且對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和操作人員的要求低，非常適于在實(shí)際工作中推廣。2.2.2 副溶血弧菌的快速檢測(cè) 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是我國一種重要的食源性病原菌，可引起急性腸胃炎，少數(shù)情況還能引發(fā)敗血病，危

31、及生命。副溶血弧菌引發(fā)食物中毒的規(guī)模呈明顯的上升趨勢(shì)，目前已超過沙門氏菌食物中毒，躍居首位。因此需要從多方面加強(qiáng)檢測(cè)，以防止該菌對(duì)食品造成的大面積污染,保證人的身體健康。傳統(tǒng)鑒定副溶血性弧菌的方法是分離培養(yǎng)、鏡檢、觀察、生化鑒定等，這些檢測(cè)手段不僅需要專業(yè)技術(shù)人員，同時(shí)鑒定過程耗時(shí)、靈敏度低、操作復(fù)雜；隨著核酸分子檢測(cè)技術(shù)的不斷的發(fā)展，基于PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)副溶血性弧菌29-31，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測(cè)時(shí)間仍然比較長需要45 h，不能滿足快速檢測(cè)的需求；同時(shí)PCR方法依賴精密的溫度循環(huán)裝置。目前針對(duì)副溶血弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的國內(nèi)外的報(bào)道是非常多

32、的，足以證明這一技術(shù)在副溶血弧菌的檢測(cè)中起到非常重要的作用。王虹玲32等以副溶血弧菌具有種特異性的gyrB基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了LAMP引物，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)貝肉中的副溶血弧菌，結(jié)果表明LAMP體系具有很高的特異性和敏感性；應(yīng)用于61份貝類海產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，陽性率為100%，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的檢測(cè)結(jié)果相符，陽性率高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法。徐芊33等針對(duì)副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因（tlh）設(shè)計(jì)4條特異性引物（兩條內(nèi)引物和兩條外引物）建立了LAMP擴(kuò)增技術(shù)。劉威34等也針對(duì)副溶血性弧菌特異基因tlh基因設(shè)計(jì)并篩選出了4條特異性的LAMP引物，通過識(shí)別tlh基因上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域來快速

33、檢測(cè)副溶血性弧菌，具有較好的特異性，且LAMP檢測(cè)法靈敏度是普通PCR法的10倍。LAMP 方法用于快速檢測(cè)副溶血性弧菌檢測(cè)過程簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、鑒定方便，所以LAMP法檢測(cè)副溶血性弧菌特別適合用于現(xiàn)場(chǎng)和基層檢疫及醫(yī)療單位的快速診斷。2.2.3 志賀菌屬的檢測(cè) 志賀菌屬（Shigella）的細(xì)菌是最為常見的導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾的病原菌，是引起食物中毒的常見致病菌之一，引起食物中毒的食品多為肉類、乳制品等蛋白質(zhì)含量較多的食物。與沙門菌屬和副溶血弧菌相同，最初也采用傳統(tǒng)的方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長，通常需要35 d。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，志賀菌屬也建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。易海華35等基于志

34、賀菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因（ipaH）的保守序列設(shè)計(jì)并篩選出1套LAMP引物，對(duì)21株志賀菌和非志賀菌進(jìn)行特異性檢測(cè)以確定其特異性，并使用LAMP和普通PCR技術(shù)對(duì)ipaH基因重組質(zhì)粒倍比稀釋液進(jìn)行檢測(cè)以確定其靈敏度，結(jié)果顯示LAMP技術(shù)可以在1 h內(nèi)完成擴(kuò)增技術(shù)，特異性也較好，靈敏度是普通PCR的10倍以上。2.2.4 分支桿菌屬的檢測(cè) 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。其可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病，估計(jì)世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分支桿菌生長比較緩慢，所以臨床上一直在尋找快

35、速準(zhǔn)確的鑒別方法診斷分支桿菌。Iwamodo36等根據(jù)16S核糖體DNA保守序列和gyrB基因序列設(shè)計(jì)了LAMP反應(yīng)的特異性的引物，采用LAMP體系成功的從痰標(biāo)本中鑒定出結(jié)核分支桿菌、禽分支桿菌和胞內(nèi)分支桿菌。黃帆37等也以結(jié)核分支桿菌作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)了4種LAMP引物以特異地識(shí)別結(jié)核分支桿菌中g(shù)yrB基因的六個(gè)特殊區(qū)域，通過LAMP檢測(cè)技術(shù)可以在幾種常見的致病分支桿菌中能快速、特異地檢測(cè)出結(jié)核分支桿菌。2.2.5 大腸桿菌O157：H7的檢測(cè) 大腸桿菌O157：H7是腸出血型大腸桿菌（enterohemorrhagic E.coli, EHEC）的一個(gè)主要血清型，是最為常見的食源性致病菌，

36、被污染的食品是其主要的傳染源，而豬、雞、牛、羊等家禽是次要的傳染源。Maruyama38等將LAMP技術(shù)和原位雜交技術(shù)相結(jié)合，用于檢測(cè)攜帶stx2基因的大腸埃希菌O157:H7。易海華39等利用LAMP核酸擴(kuò)增基因技術(shù)針對(duì)編碼O157:H7脂多糖的rfbE基因和編碼H7鞭毛抗原的fliC基因設(shè)計(jì)了LAMP檢測(cè)的特異性引物。2.2.6 其它細(xì)菌的檢測(cè) LAMP 技術(shù)還成功用于特異性的檢測(cè)單增李斯特菌的肌動(dòng)蛋白誘導(dǎo)蛋白聚集因子基因（actA）和空腸彎曲茵的促旋酶基因（gyrA）、超級(jí)細(xì)菌的-內(nèi)酰胺酶-新德里金屬-內(nèi)酰胺酶-1基因（NDM-1）、肺炎鏈球菌的lytA基因（lytA）、假結(jié)核耶爾森菌基

37、因（inv）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因（mecA）和特異性基因（femA）基因以及小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌等40-43細(xì)菌病原物。2.3 寄生蟲的檢測(cè)非洲錐蟲?。ˋfrican Trypanosomiasis）亦稱睡眠病，系由羅得西亞錐蟲或?qū)葋嗗F蟲所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，借舌蠅傳播，流行于非洲南北緯20°之間。早期臨床表現(xiàn)為長期不規(guī)則發(fā)熱，全身淋巴結(jié)腫大、皮疹、晚期以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，有嚴(yán)重頭痛、肌肉震顫、反應(yīng)遲鈍、昏睡以至昏迷死亡。Kuboki44等采用LAMP法建立了非洲錐蟲病的檢測(cè)技術(shù)。尾蚴是日本血吸蟲的感染期，因此檢測(cè)水體尾蚴的有無可為安全用水提供好的依

38、據(jù)，楊秋林45等采用LAMP法建立一種檢測(cè)日本血吸蟲尾蚴的方法；LAMP檢測(cè)尾蚴電泳后陽性呈典型的特征性梯狀條帶，其靈敏度能達(dá)到1條尾蚴。2.4 菌物的檢測(cè)LAMP已廣泛應(yīng)用于對(duì)病毒、細(xì)菌及寄生蟲這些病原微生物的檢疫檢測(cè)中，但是對(duì)菌物檢測(cè)的研究相對(duì)較少。已有多篇論文發(fā)表證明LAMP同樣適用于病原菌物的檢測(cè)中。南美芽生菌病由巴西類球孢子菌引起的皮膚黏膜、淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官的真菌性疾病，高發(fā)于拉丁美洲國家，而在非流行地區(qū)，南美芽生菌病的診斷是比較困難。傳統(tǒng)檢測(cè)需經(jīng)過真菌培養(yǎng)才能確診；采用PCR技術(shù)從真菌細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出巴西類球孢子菌的特異性基因gp43和gp27需要56 h，如果是血液或組織標(biāo)本則需要1

39、2 h以上才能檢測(cè)出來；Endo46等和Tatibana47等用 LAMP 檢測(cè)gp43基因只需要3h即可特異性的檢出巴西類球孢子菌。Lucas48等基于CAP59靶標(biāo)序列建立了隱球菌的LAMP 檢測(cè)技術(shù)，用于鑒定隱球菌復(fù)合種的不同血清分型。大豆枯萎病又稱萎蔫病、黃葉病、根腐病，是一種分布較廣、危害較重、防治困難的世界性土傳病害。近年來，隨著大豆種植面積不斷擴(kuò)大，大豆枯萎病的發(fā)生呈擴(kuò)大蔓延、加重危害的趨勢(shì)，對(duì)大豆生產(chǎn)造成很大威脅。為了阻止大豆枯萎病傳播范圍的不斷擴(kuò)大，使大豆枯萎病得到控制；Lu49等分析了大豆尖鐮孢CYP51C基因和其他鐮孢菌在序列上的差異，設(shè)計(jì)了四條特異性的LAMP引物和兩條

40、環(huán)引物，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)大豆尖鐮孢的LAMP體系。Niessen50等基于半乳糖氧化酶基因（gaoA）建立了禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）的LAMP檢測(cè)體系；同時(shí)Abd-Elsalam51等采用Niessen建立的LAMP檢測(cè)體系將其應(yīng)用中谷物類感染鐮刀菌的檢測(cè)，從而為鐮刀菌的檢測(cè)提供了采用快速、靈敏的檢測(cè)方法。Duan52-53等將LAMP 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于禾谷鐮刀菌 2-微管蛋白的點(diǎn)突變檢測(cè)中，同時(shí)還建立了葡萄灰霉菌（Botry cinerea）的快速LAMP檢測(cè)技術(shù)體系。Ohori54等建立了奔馬赭霉菌（Ochroconis gallopava）的LA

41、MP檢測(cè)方法，有助于肺部暗色絲孢霉病的診斷。Sun55等也建立了馬爾尼菲青霉病菌（penicillium marneffei）的LAMP檢測(cè)技術(shù)。在卵菌的應(yīng)用中，Dai4等分析了大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）和其他疫霉菌在A3aPro序列上的差異，設(shè)計(jì)了LAMP的特異性引物，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)大豆疫霉菌的LAMP體系，結(jié)果表明整個(gè)檢測(cè)過程僅需 1 h，即可通過肉眼直接目測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)，Dai56等應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)建立了一種基于顏色判定的簡單、快速和靈敏的橡樹疫霉菌的檢測(cè)方法。因此，LAMP 在菌物檢測(cè)中具有代替?zhèn)鹘y(tǒng) PCR的潛能。3 展望LAMP技術(shù)作為一種等

42、溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)速度快、特異性高、設(shè)備簡單、結(jié)果易于鑒定，適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)。目前，已有幾十種LAMP試劑盒已經(jīng)國產(chǎn)化和商業(yè)化，檢測(cè)成本大大降低，促進(jìn)了 LAMP 技術(shù)的推廣和普及。但在病原菌的檢測(cè)中的應(yīng)用還是非常有限的，常規(guī)的LAMP技術(shù)只能檢測(cè)1-2種病原菌。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來新發(fā)展起來的LAMP與芯片的整合技術(shù)，如L-LAMP、mL-LAMP技術(shù)等可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因、多個(gè)樣本，實(shí)現(xiàn)病原菌高通量的檢測(cè)，在基層實(shí)驗(yàn)室和口岸檢疫等具有廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)References：1 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H,

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