真核表達(dá)系統(tǒng)PPT課件

1、酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn) 遺傳背景清楚（基因組是大腸桿菌的3.5倍） 增殖快（90min/代），培養(yǎng)容易，產(chǎn)量較高 易于研究突變與基因功能，如構(gòu)建酵母人工染色體等 可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾加工 提純工藝復(fù)雜，成本高，制品純度達(dá)不到要求，制品免疫原性差，接種劑量大第1頁(yè)/共51頁(yè)酵母載體的基本結(jié)構(gòu) DNA復(fù)制起始區(qū)：2質(zhì)粒和自主復(fù)制序列 選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型和顯性選擇（抗藥） 整合介導(dǎo)區(qū)：同源重組，決定整合位置和拷貝數(shù) 有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：幫助載體平均分配 表達(dá)盒 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 終止子 分泌信號(hào)序列第2頁(yè)/共51頁(yè)酵母表達(dá)系統(tǒng)中載體的種類 按載體在酵母中的復(fù)制形式分為： YIp：酵母整合型載體 YRp：酵

2、母自主復(fù)制型載體 YCp：酵母含著絲粒片段載體 YEp：酵母附加體型載體 YAC：酵母人工染色體第3頁(yè)/共51頁(yè)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb啟動(dòng)子：桿狀病毒科核多角體病毒的多角蛋白強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染同源重組空斑篩選純化重組病毒第4頁(yè)/共51頁(yè)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn) 容量大：能插入12kb的外源基因 高表達(dá)：polh基因啟動(dòng)子是目前所知的最強(qiáng)的真核啟動(dòng)子；產(chǎn)物對(duì)宿主影響??；產(chǎn)物可結(jié)晶 高效：可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基

3、因 安全：桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)病原性 具加工修飾功能：昆蟲細(xì)胞較高等 家蠶易飼養(yǎng)第5頁(yè)/共51頁(yè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)常用宿主細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用載體真核細(xì)胞表達(dá)元件哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的遺傳標(biāo)記基因表達(dá)的檢測(cè)方法第6頁(yè)/共51頁(yè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) 重組DNA易轉(zhuǎn)染，遺傳穩(wěn)定，可重復(fù) 識(shí)別和去除內(nèi)含子 進(jìn)行翻譯后修飾 磷酸化、糖基化、二硫鍵、寡聚體等的形成、高級(jí)結(jié)構(gòu)的正確折疊 產(chǎn)品的構(gòu)型正確率高，可被改造成類人體源性，免疫源性好 可分泌至培養(yǎng)基，提純工藝簡(jiǎn)單，成本低 可用于基因治療第7頁(yè)/共51頁(yè)常用宿主細(xì)胞第8頁(yè)/共51頁(yè)真核細(xì)胞表達(dá)元件 原核DNA序列 啟動(dòng)子 增強(qiáng)子 拼接信號(hào) 終止子和

4、多聚腺苷化信號(hào) 篩選標(biāo)記 動(dòng)物病毒基因序列第9頁(yè)/共51頁(yè)原核DNA序列 原核復(fù)制子 抗生素抗性基因 多克隆位點(diǎn)第10頁(yè)/共51頁(yè)啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子：RNA聚合酶（）結(jié)合并起動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列一般包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游約100-200bp序列，包含有若干具有獨(dú)立功能的DNA序列元件，每個(gè)元件約長(zhǎng)7-30bp 核心啟動(dòng)子元件：RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游-25/-30bp處的TATA盒。單獨(dú)起作用時(shí)只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄上游啟動(dòng)子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件。與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合改變轉(zhuǎn)錄效

5、率。不同基因具有不同的上游啟動(dòng)子元件組成，其位置也不相同，即不同的基因表達(dá)分別有不同的調(diào)控 第11頁(yè)/共51頁(yè)哺乳類RNA聚合酶啟動(dòng)子中常見的元件 元件名稱元件名稱共同序列共同序列結(jié)合的蛋白因子結(jié)合的蛋白因子名稱名稱 分子量分子量 結(jié)合結(jié)合DNA長(zhǎng)度長(zhǎng)度 TATA boxTATAAAATBP 30,000 10bpGC box GGGCGGSP-1 105,000 20bpCAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 22bpOctamer ATTTGCAT Oct-1 76,000 20bpOct-2 53,000 23bpk k BGGGACTTTCCNFk k B

6、44,000 10bpATFGTGACGTAFT ? 20bp第12頁(yè)/共51頁(yè)常用啟動(dòng)子 Rous肉瘤啟動(dòng)子（RSV） 巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（CMV） SV40啟動(dòng)子第13頁(yè)/共51頁(yè)增強(qiáng)子 增強(qiáng)子：是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子 增強(qiáng)子通常占100-200bp長(zhǎng)度，也和啟動(dòng)子一樣由若干組件構(gòu)成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在 第14頁(yè)/共51頁(yè)增強(qiáng)子的作用特點(diǎn) 提高同一鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可遠(yuǎn)距離起作用，通常距離1-4kb

7、、但遠(yuǎn)至30kb仍能發(fā)揮作用，在基因的上游或下游都能起作用與其序列的正反方向無(wú)關(guān)要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用。但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的作用機(jī)理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的 第15頁(yè)/共51頁(yè)常用增強(qiáng)子 LTR：Rous肉瘤病毒基因長(zhǎng)末端重復(fù)序列 人類巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子 SV40病毒增強(qiáng)子第16頁(yè)/共51頁(yè)終止信號(hào)和poly A信號(hào) 真核基因轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)與機(jī)制還不明確

8、 poly A增加mRNA的的穩(wěn)定性 多聚腺苷化所需的兩種序列 位于poly A下游GU豐富區(qū)或U豐富區(qū) 位于poly A上游11-30bp處的5-AAUAAA SV40 poly A信號(hào)第17頁(yè)/共51頁(yè)遺傳性標(biāo)記 胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng) 二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng) 新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng) 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)第18頁(yè)/共51頁(yè)胸苷激酶（TK）基因選擇系統(tǒng) TK是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶 內(nèi)源性缺陷tk的宿主細(xì)胞小鼠LMTK細(xì)胞 HAT選擇法 H：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成三種核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 T：胸苷；補(bǔ)救合成dTTP

9、的原料 tk細(xì)胞的鑒別與獲得：5-溴脫氧核糖尿苷（BUdR）篩選第19頁(yè)/共51頁(yè)二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng) DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸 篩選劑：葉酸類似物氨基喋呤或氨甲喋呤 dhfr缺陷型細(xì)胞CHO細(xì)胞 正常細(xì)胞可通過提高氨甲喋呤濃度篩選 突變型dhfr基因的導(dǎo)入擴(kuò)大篩選宿主細(xì)胞的范圍第20頁(yè)/共51頁(yè)新霉素抗性基因選擇系統(tǒng) 新霉素（neo）：即G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成 新霉素抗性基因編碼3-磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418 適用于所有的真核細(xì)胞第21頁(yè)/共51頁(yè)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)

10、 CAT：大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素乙酰化反應(yīng)的蛋白質(zhì) 真核細(xì)胞缺乏CAT 導(dǎo)入CAT可作為報(bào)告基因 常用于瞬時(shí)表達(dá)研究第22頁(yè)/共51頁(yè)表位標(biāo)記 表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，一般由少至幾個(gè)氨基酸的多肽組成 用于重組DNA技術(shù)的示蹤、分析、純化（親和） 優(yōu)點(diǎn) 用一種抗體可鑒別不同重組蛋白 不影響蛋白功能 有利于研究蛋白功能 常用表位：6His；FLAG；LZ等第23頁(yè)/共51頁(yè)構(gòu)建含表位的重組體 使用常用密碼子 注意克隆位點(diǎn)（限制性酶切位點(diǎn)）相符 5端加上起始密碼子ATG 3端加上終止密碼子 可插入蛋白酶切位點(diǎn)基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白 其他常規(guī)構(gòu)建載體的注意

11、點(diǎn)第24頁(yè)/共51頁(yè)真核表達(dá)載體 質(zhì)粒：真核表達(dá)元件、真核抗性 病毒載體：改建后 SV40病毒 腺病毒 反轉(zhuǎn)錄病毒 痘苗病毒第25頁(yè)/共51頁(yè)病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)病毒基因組大小相差較大,與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小 病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成 多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成 基因重疊即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子 病毒基因組的大部分是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的 病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位,形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元 除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基

12、因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次 噬菌體（細(xì)胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的 第26頁(yè)/共51頁(yè)病毒載體優(yōu)點(diǎn) 真核細(xì)胞可識(shí)別的啟動(dòng)子 報(bào)告基因 可持續(xù)復(fù)制（感染周期） 部分載體可整合入基因組 部分載體本身帶有完整的復(fù)制及表達(dá)元件 部分載體具有宿主細(xì)胞特異性 識(shí)別受體 假病毒顆粒第27頁(yè)/共51頁(yè)猿猴空泡病毒（SV40）種屬分類：乳多空病毒科多瘤病毒屬雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），5243bp20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑45nm以EcoRl內(nèi)切酶切點(diǎn)作為0點(diǎn)分成100等分，Ori點(diǎn)是DNA雙向復(fù)制的起紿點(diǎn)早期編碼進(jìn)程是逆時(shí)鐘方向，在病毒DNA自制前，編碼的蛋白質(zhì)(大T、小T

13、抗原)與誘發(fā)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)晚期編碼區(qū)進(jìn)程為順時(shí)鐘方向，是在病毒DNA復(fù)制開始以后，編碼的蛋白質(zhì)為三種病毒殼體蛋白VP1、VP2和VP3，這些蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，不參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程第28頁(yè)/共51頁(yè)第29頁(yè)/共51頁(yè)SV40感染細(xì)胞模式 感染形式：隨宿主的不同產(chǎn)生的效應(yīng)不同 許可性細(xì)胞裂解性感染（猿猴細(xì)胞） 非許可性細(xì)胞整合入染色體（嚙齒動(dòng)物細(xì)胞） 半許可性細(xì)胞既不整合也不裂解（人細(xì)胞）第30頁(yè)/共51頁(yè)SV40載體類型 取代型重組病毒 去掉晚期區(qū)一段DNA，外源基因可插入 需輔助病毒感染 可形成病毒顆粒 重組病毒-質(zhì)粒載體 保留病毒復(fù)制相關(guān)序列 插入細(xì)菌質(zhì)粒序列，可在大腸桿菌種復(fù)制增殖

14、 不形成病毒顆粒第31頁(yè)/共51頁(yè)SV40及衍生載體的優(yōu)點(diǎn) 可在多種細(xì)胞中表達(dá) 基因組DNA、cDNA均可表達(dá) SV40的復(fù)制起始點(diǎn) 廣泛宿主范圍的啟動(dòng)子 多聚A信號(hào) DNA拼接供體和信號(hào)（剪接內(nèi)含子） 部分載體含有報(bào)告基因第32頁(yè)/共51頁(yè) 感染宿主范圍有限 復(fù)制只能在猿猴細(xì)胞中 載體DNA分子量小，容量小 在用輔助病毒混合感染時(shí)，有野生化危險(xiǎn)SV40及衍生載體的缺點(diǎn)第33頁(yè)/共51頁(yè)第34頁(yè)/共51頁(yè)痘苗病毒 雙鏈DNA病毒 180kb，編碼200種左右的蛋白 可獨(dú)立的在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制轉(zhuǎn)錄第35頁(yè)/共51頁(yè)痘苗病毒載體優(yōu)越性 宿主范圍廣泛 容量大插入的外源基因可達(dá)25kb 瞬時(shí)表達(dá) 無(wú)致癌性

15、本身即需接種 可作為重組活疫苗的載體第36頁(yè)/共51頁(yè)痘苗病毒載體的缺點(diǎn) 分子量大，操作較困難 無(wú)剪接功能不能插入含內(nèi)含子的基因 外源基因必須插入非必需區(qū)第37頁(yè)/共51頁(yè)構(gòu)建重組痘苗病毒流程 tk基因插入質(zhì)粒 tk基因內(nèi)插入痘病毒早期啟動(dòng)子 接上多克隆位點(diǎn) 接上外源基因 野毒株感染細(xì)胞 導(dǎo)入重組載體 同源重組含外源基因的tk基因取代 篩選含外源基因的重組病毒 感染敏感宿主細(xì)胞表達(dá)外源基因第38頁(yè)/共51頁(yè)腺病毒Ad病毒顆粒的直徑為70-90nm，呈20面體立體對(duì)稱型，核心外層的殼體由252個(gè)殼粒亞單位組成雙股線型DNA，DNA約占病毒重量的11-14%不同亞型Ad病毒的DNA的G+C%含量不

16、同，與其致瘤性能強(qiáng)弱有關(guān)Ad2基因組的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)有6個(gè)獨(dú)立的區(qū)域: IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4Ad2基因組約長(zhǎng)36kb，EIA和EIB與Ad2的啟動(dòng)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞密切有關(guān)腺病毒雖然分布廣泛，其中某些亞型對(duì)動(dòng)物具強(qiáng)致瘤性，但是從A組到E組，迄今尚未證明與人類腫瘤有病因?qū)W上的聯(lián)系 第39頁(yè)/共51頁(yè)腺病毒載體 容量較大：可插入7kb 易培養(yǎng)、純化 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴與宿主聚合酶 不整合 釋放殼體蛋白，引起免疫反應(yīng)第40頁(yè)/共51頁(yè)基因的導(dǎo)入方法光穿孔法：激光；懸浮細(xì)胞沖擊波：活體局部的基因轉(zhuǎn)移基因槍法：即微粒轟擊；動(dòng)物細(xì)胞，更適用于植物細(xì)胞穿孔法：脈沖電場(chǎng)；Cytomix緩

17、沖液；70%細(xì)胞死亡時(shí)效率最高磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體法：Lipofectin；陽(yáng)離子抗體轉(zhuǎn)染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白其他：超聲波法；微注射法原生質(zhì)體融合法；反轉(zhuǎn)錄病毒感染法第41頁(yè)/共51頁(yè)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù) Western印跡法免疫學(xué)方法抗原-抗體反應(yīng) 熒光顯微鏡法表位標(biāo)記的抗體與直接抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記免疫學(xué)方法第42頁(yè)/共51頁(yè)Western印跡法 蛋白樣品制備 SDS-PAGE（按分子量大?。╇娹D(zhuǎn)移一抗（特異性）二抗顯色 敏感度：1-5ng1-5ng第43頁(yè)/共51頁(yè)樣品的制備裂解細(xì)胞電泳加樣緩沖液裂解細(xì)胞（煮沸5-10min）抽提細(xì)胞蛋白（超聲）第44頁(yè)/共51頁(yè)SDS-PA

18、GE 丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)，形成一定孔徑的分離介質(zhì)，孔徑大小由濃度決定，具有分子篩效應(yīng) 在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，具有濃縮效應(yīng) 蛋白質(zhì)本身的電荷效應(yīng) SDS：陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合 SDS濃度大于0.05%時(shí)，使樣品中的蛋白質(zhì)帶同樣密度的電荷 電泳時(shí)使蛋白遷移只與分子量有關(guān)，且呈線性（對(duì)數(shù)分子量與遷移率），可測(cè)定分子量第45頁(yè)/共51頁(yè)電轉(zhuǎn)移 支持介質(zhì)：重氮芐氧甲基紙（DBP紙）、陰離子化尼龍膜、硝酸纖維素膜（NC） 蛋白質(zhì)帶負(fù)電，向正極遷移 凝膠考馬斯亮蘭染色，檢查轉(zhuǎn)移是否完全 膜麗春紅染色 標(biāo)記分子量位置第46頁(yè)/共51頁(yè)靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè) 封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，脫脂奶粉或血清白蛋白 第一抗體：具有特異性，最好氏多抗或抗血清 標(biāo)記的第二抗體：同位素標(biāo)記；堿性磷酸酶（AKP）標(biāo)記；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記 注意封閉非特異性位點(diǎn) 注意抗體濃度：尤其是一抗?jié)舛鹊?7頁(yè)/共51頁(yè)顯色反應(yīng) AKP催化5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸與氮藍(lán)四唑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生深藍(lán)色 HRP催化3,3-二氨基聯(lián)苯胺與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生棕色條帶，易褪色，注意保存結(jié)果第48頁(yè)