長期施肥田間試驗(yàn)的土壤粒級(jí)中微生物的群體結(jié)構(gòu)

1、高級(jí)農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)作業(yè)Microbial Population Structures in Soil Particle Size Fractionsof a Long-Term Fertilizer Field ExperimentANGELA SESSITSCH et al.長期田間施肥試驗(yàn)的土壤粒級(jí)中微生物的群體結(jié)構(gòu)的閱讀研究報(bào)告報(bào) 告 人：于小彬?qū)W 號(hào)：2013202009 專 業(yè)：作物栽培學(xué)與耕作學(xué) 任課教師：李立軍 日 期：2014年3月31日科學(xué)問題有機(jī)質(zhì)種類和/或顆粒大小是否控制著土壤不同顆粒中特定微生物群體的分布。 假設(shè)H1:有機(jī)質(zhì)種類單獨(dú)起作用;H2:顆粒粒級(jí)單獨(dú)起作用;H3:兩

2、者聯(lián)合交互起作用;H0:兩者均無效。試驗(yàn)設(shè)計(jì)表土樣品（0-20cm）取自1998年秋季Ultuna的長期施肥實(shí)驗(yàn)地。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)開始于1956年，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了14種處理，其中每一種處用隨 機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)重復(fù)4次。 本實(shí)驗(yàn)中，只分析七個(gè)處理的樣品。持續(xù)的完全休閑耕作；無氮，地塊不施氮肥； Ca(NO3)2每年每公頃80Kg的氮；GM，綠肥；AM，充分腐熟的動(dòng)物肥料；泥炭； SS，下水道污泥有機(jī)修復(fù)物在施用前進(jìn)行分析，并且將等量有機(jī)質(zhì)（Ca(NO3)22000Kg/ha/year)于1956，1960,1963年添加進(jìn)去，這以后每隔兩年手工添加一次。而且，每年春天以過磷酸鹽的形式施入20KgP 每公頃，以

3、氯化鉀的形式施入35至38kg K每公頃。麥類，油菜，作物，飼料用甜菜交替種植。結(jié)果1、T-RFLP 分析1、在所有的處理中，沙粒中的細(xì)菌多樣性最低，粘粒中的最高。唯一例外的是泥炭作有機(jī)修復(fù)物的處理，其T-RFs數(shù)最高出現(xiàn)在粉粒中（表1）。涉及綠肥（GM）和腐熟動(dòng)物肥(AM)的處理表現(xiàn)出更高的細(xì)菌多樣性，特別是粘粒中，相比于其他有機(jī)修復(fù)物。另外，GM中的沙粒表現(xiàn)出異常高的多樣性，相比于其他處理中的沙粒。在幾綠肥出處理的幾個(gè)處理中，一些片段表現(xiàn)出遠(yuǎn)遠(yuǎn)更大的熒光信號(hào)。2、只有197bp（GM）,253bp(GM,AM),290bp(GM,AM,SS)三個(gè)T-RFs只在沙粒中發(fā)現(xiàn)。檢測(cè)的大多數(shù)沙粒中

4、的T-RFs也同樣出現(xiàn)在粉粒和粘粒中（表2）。一大部分（T-RFs）在粉粒和粘粒中發(fā)現(xiàn)，但沒有出現(xiàn)在沙粒中。細(xì)菌中大小為76bp和311bp（均是休閑耕作，F(xiàn)allow）的T-RFs至存在于（定殖于）粉粒中，很多T-RFs只發(fā)現(xiàn)于粘粒中。3、沙粒中檢測(cè)的多數(shù)T-RFs表現(xiàn)出集中的熒光信號(hào)，片段大小組成有：39,60,62,66,81,194,197,205,208,212,223,228,231,253,290,294,297,304，以及379bp(表2，圖1)。2、序列分析及遺傳進(jìn)化分析排布1、24h測(cè)序表現(xiàn)出與RDP數(shù)據(jù)庫記錄條目高相似性，其中30個(gè)序列表現(xiàn)出與NCBI數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)的已知

5、序列有至少95%的相似性（表3）。剩余的序列與已知的16S RNA基因，未描述的細(xì)菌分類成員以及有描述的分支很遠(yuǎn)的成員只有中等（90-94%）相關(guān)性。這個(gè)進(jìn)化樹知識(shí)建立在部分測(cè)序，它展示的屬于Holophaga/Acidobacterium簇類細(xì)菌的大量多樣性，而不是確定的遺傳進(jìn)化關(guān)系如圖3中展示。2、所有測(cè)序的克隆菌的理論HaeIII-HhaI T-RFs 在T-RFLP分布圖中可以看到。理論的T-RF132bp是唯一的例外，沒有在T-RFLP 分析中檢測(cè)到。幾個(gè)序列表現(xiàn)出相似的T-RFLP大小（表4）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遺傳進(jìn)化和土壤中空間的位置的關(guān)系。一些細(xì)菌組，如Holophaga（全噬菌屬 ）

6、/Acidobacterium（乳酸桿菌屬）簇類，大多數(shù)Prosthecobacter（突柄桿菌屬 ）成員，是更小顆粒中主要的存在菌，而Proteobacteria（變形菌門）在各種顆粒中分布大致相當(dāng)。討論1、細(xì)菌與土壤顆粒級(jí)的聯(lián)系更細(xì)小的顆粒為微生物提供一個(gè)阻擋捕食者的保護(hù)性的微生境可能，更小顆粒中的提供的高大量可利用的營養(yǎng)可能是更高細(xì)菌多樣性的原因2、粒級(jí)中細(xì)菌對(duì)有機(jī)修復(fù)物的響應(yīng)我們的微生物群體分析的結(jié)果反映了在有機(jī)碳Corg輪轉(zhuǎn)的報(bào)道中的內(nèi)容。通常情況，GM和AM處理中土壤的豐富度最高，在無或非有機(jī)肥的土壤中最低，并且與施入肥料的利用率相一致。修復(fù)物中的SS，泥炭作為肥料導(dǎo)致了相當(dāng)獨(dú)特的

7、細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)，這歸因于不同的組成而不是增加或者降低多樣性。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出非常低的PH值（5.8），這可能是有一些群落的改變?cè)斐傻?。泥炭和SS處理沒有一些其他處理中檢測(cè)到的一些T-RFs 。它們包括Holophaga/Acidobacterium division(95, 236, and 242 bp), Prosthecobacter (236 bp),或者 low G C革蘭氏陽性。這些細(xì)菌可能沒有不能忍受酸環(huán)境。其他屬于Holophaga/Acidobacterium門的細(xì)菌，還有Prosthecobacter種的能夠定殖在多數(shù)的處理中除了含有SS的土壤。一些微生物群對(duì)SS中高濃度金屬的

8、敏感性可能解釋上述現(xiàn)象。3、總結(jié)群落的T-RFLP of 16S rRNA基因分析，被證明是高適的，高靈敏的調(diào)查不同顆粒粒徑，不同處理中微生物群落結(jié)構(gòu)的工具。三個(gè)常規(guī)的重復(fù)樣品，每一個(gè)粒級(jí)和處理表現(xiàn)出可比較的群體分布圖，并且能很好在聚類分析中歸類。大量的T-RFLP分析，必須很謹(jǐn)慎的處理，因?yàn)樵诓煌募?xì)菌菌種中，存在PCR擴(kuò)增的系統(tǒng)偏差以及16S rRNA基因的復(fù)制數(shù)的變異?？墒?，注意到了這些限制，T-RFLP分析可以被用來做細(xì)菌群落的半量分析。本實(shí)驗(yàn)中，微生物的組成主要受顆粒粒級(jí)的影響，并且確實(shí)更少程度的響應(yīng)有機(jī)修復(fù)物的處理。因此，我們的結(jié)果表明，特定的微生物-粒級(jí)聯(lián)系，并且這個(gè)關(guān)聯(lián)只有很小

9、程度受外界因素，如肥料或重金屬污染，的影響。微生物群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)代表了對(duì)土壤粒級(jí)對(duì)環(huán)境響應(yīng)理解的第一步。群落結(jié)構(gòu)以外，在給定群體功能基因的分析將會(huì)增加我們對(duì)細(xì)菌在土壤處理中作用的理解，而土壤處理對(duì)地球化學(xué)元素，特別是碳，氮，硫的動(dòng)態(tài)非常重要。評(píng)價(jià)此試驗(yàn)從微觀的角度，選擇檢測(cè)微生物的種類來表示不同處理三個(gè)顆粒級(jí)中微生物的多樣性，從16SrDNA的水平闡釋了具體各個(gè)施肥處理土壤中三個(gè)粒級(jí)中細(xì)菌的具體種類，并且多試驗(yàn)中的現(xiàn)象做了較為合理的解釋。T-RFLP是一種成熟的研究微生物多樣性的技術(shù)，值得在以后研究微生物的試驗(yàn)中應(yīng)用。長期田間施肥試驗(yàn)的土壤粒級(jí)中微生物的群體結(jié)構(gòu)摘要：土壤結(jié)構(gòu)依賴于礦質(zhì)土壤顆粒

10、（砂粒，粉粒，粘粒）與有機(jī)質(zhì)的結(jié)合。結(jié)構(gòu)里形成了大小，穩(wěn)定性不同的聚合體。雖然已經(jīng)很好的研究了不同顆粒中有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，總生物量以及不同土壤酶活性，但是關(guān)于微環(huán)境中微生物群體的結(jié)構(gòu)的信息卻很少。本研究中，我們分析了長期田間試驗(yàn)的不同施肥處理中表土樣品。通過低能量的聲波降解法，濕法篩分和重復(fù)離心的組合，獲得顆粒粒徑200至63µm（細(xì)砂粒），63至2µm（粉粒），2至0.1µm（粘粒）的土壤顆粒。通過末端限制片段長度多態(tài)性分析，16sRNA基因的克隆和測(cè)序，比較不同土壤粒級(jí)中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。微生物結(jié)構(gòu)很大程度受顆粒大小影響，并且小粒徑中的微生物比粗粒徑中的產(chǎn)生更高的多

11、樣性。更高的生物量早先在粉粒和粘粒級(jí)中發(fā)現(xiàn)，可能歸結(jié)于更高的微生物多樣性而不是更好的特定種群的定居。低營養(yǎng)的提供，原生動(dòng)物的攝食以及真菌生物的競(jìng)爭(zhēng)可能是大粒徑中減少的多樣性的原因。而且，大粒徑中-變形菌門數(shù)量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，然而屬于全噬菌屬/酸桿菌門部分的細(xì)菌，其高豐富度和多樣性發(fā)現(xiàn)于更小的粒徑中。雖然相互間差異非常大的有機(jī)修復(fù)物（綠肥，畜肥，污水污泥，泥炭）也被實(shí)驗(yàn)，但是我們的結(jié)果顯示細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，相比于施肥的種類，更大程度受顆粒粒級(jí)的影響。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了特有的微生物-顆粒關(guān)聯(lián)，并且這個(gè)關(guān)聯(lián)只有很小程度受外界因素的影響。1引言土壤結(jié)構(gòu)依賴于礦質(zhì)土壤顆粒（砂粒，粉粒，粘粒）和有機(jī)質(zhì)的結(jié)合。

12、結(jié)構(gòu)里形成了大小，穩(wěn)定性不同的聚合體。耐機(jī)械化的微聚合體從初始顆粒和微生物，植物根系，真菌菌絲，多糖以及腐殖質(zhì)的相互作用進(jìn)化而來。它們構(gòu)建了的微聚合體（>250µm）明顯欠穩(wěn)定，而且很容易被農(nóng)事管理破壞。這類聚合體通過根系和菌體緊緊的團(tuán)在一起。土壤顆粒的結(jié)構(gòu)組織為微生物提供了一個(gè)空間化混雜的微生境，這些微生境具不同的基質(zhì)，營養(yǎng)，氧氣濃度及水分含量，還有不同的PH值。以前運(yùn)用了不同的方法研究了土壤基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)和微生物的分布，如電子顯微鏡分析，土壤聚合體的反復(fù)沖洗以及基于土壤物理分級(jí)技術(shù)。有幾個(gè)研究已經(jīng)表明細(xì)胞數(shù)量和微生物量最大集中于更小的粉粒和粘粒顆粒中。因?yàn)橥寥谰酆象w的大小和土

13、壤孔隙度是相關(guān)聯(lián)的，微生物量也主要出現(xiàn)在微孔隙（5至30µm）中。而且，已經(jīng)報(bào)道，在粉粒和粘粒中，土壤酶中脲酶，蔗糖酶及堿性磷酸酶活性是最高的，而在細(xì)砂粒中木聚糖酶的活性為最高。后面的木聚糖酶已經(jīng)提議作為真菌活性的的指示物。雖然研究已經(jīng)表明，在綠地和耕作地中真菌生物量相比于細(xì)菌生物量低，但是在有機(jī)質(zhì)的早期分解中真菌卻起到了重要的作用。土壤微生物群落表現(xiàn)出極高的表現(xiàn)型和基因型多樣性，DNA復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明每一克土壤中相當(dāng)有4×103至7×103的不同基因組。微生物多樣性在幾個(gè)研究中一直被實(shí)驗(yàn)；然而，只能得到少量的關(guān)于微環(huán)境中微生物群體的結(jié)構(gòu)信息。例如Gelsomino

14、et al.反應(yīng)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過濕法篩分處理獲得的不同大小土壤聚合體中都有相似的細(xì)菌類型分布。另外Kandeler et al.最近通過磷脂脂肪酸分析和16srRNAs的變性剃度凝膠電泳，表明粘粒中微生物生物量的主要?dú)w因于細(xì)菌的定殖。與之相反，在粗砂粒中，發(fā)現(xiàn)高百分比的真菌脂肪酸衍生物，這些物質(zhì)與特定的有機(jī)質(zhì)相關(guān)聯(lián)。雖然這些出版物提供了初步的有關(guān)這些微生境中微生物群落結(jié)構(gòu)的洞悉，但是，是否有機(jī)質(zhì)種類和/或顆粒大小控制著不同土壤顆粒中特定微生物群體的分布，這仍然沒有被很好的了解。本實(shí)驗(yàn)的目的是檢驗(yàn)微生物群體結(jié)構(gòu)對(duì)土壤顆粒粒級(jí)中有機(jī)質(zhì)種類的改變是否響應(yīng)，土壤取自瑞典Ultuna的長期施肥試驗(yàn)地。低

15、能量聲波降解法后的物理分級(jí)處理，與不同顆粒大小中的微生物群落的分析相結(jié)合。用基于DNA的方法，是因?yàn)樵谧匀画h(huán)境中的大多數(shù)細(xì)菌無法成功培養(yǎng)。16srRNAs基因已經(jīng)成為頻繁使用的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)標(biāo)記，用來描述土壤中微生物多樣性，而這不需要微生物培養(yǎng)。以前，末端限制性片段長度多態(tài)性（t-RFLP）分析及16srRNAs的克隆和測(cè)序被應(yīng)用于分析細(xì)菌多樣性。這個(gè)長期施肥的實(shí)驗(yàn)，其有關(guān)營養(yǎng)周轉(zhuǎn)，土壤有機(jī)質(zhì)片段，土壤物理豐富度的改變及酶活性的研究已經(jīng)早先發(fā)表了。2 材料和方法：2.1 地點(diǎn)和樣品表土樣品（0-20cm）取自1998年秋季Ultuna的長期施肥實(shí)驗(yàn)地。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和數(shù)據(jù)的詳細(xì)整理，可以從 Kirchm

16、ann等人的報(bào)告中找到。實(shí)驗(yàn)開始于1956年，當(dāng)時(shí)土壤（0-20cm）的有機(jī)碳為15g/kg，氮為1.7g/kg,PH=6.6。 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了14種處理，其中每一種處用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)重復(fù)4次。本實(shí)驗(yàn)中，分析了七個(gè)處理的樣品：持續(xù)的完全休閑耕作；無氮，地塊不施氮肥；Ca(NO3)2每年每公頃80Kg的氮；GM，綠肥；AM，充分腐熟的動(dòng)物肥料；泥炭；SS，下水道污泥。有機(jī)修復(fù)物在施用前進(jìn)行分析，并且將等量有機(jī)質(zhì)（Ca(NO3)2 2000Kg/ha/year)于1956，1960,1963年添加進(jìn)去，這以后每隔兩年手工添加一次。而且，每年春天以過磷酸鹽的形式施入20KgP 每公頃，以氯化鉀的形式施入3

17、5至38kg K每公頃。麥類，油菜，作物，飼料用甜菜交替種植。2.2 分級(jí)處理大小分級(jí)過程依據(jù) Jocteur Monrozier et al的方法，用已篩過樣品（<2mm)按照Stemmer et al的詳細(xì)描述執(zhí)行操作。非常重要的是，土-水懸浮液用低能量的聲波降解法（輸出能量0.2Kj/g）混勻，隨后通過濕法篩分和重復(fù)離心的組合分級(jí)以免避免微聚合體破裂。200至63µm（細(xì)砂粒），63至2µm（粉粒），2至0.1µm（粘粒）的顆粒粒級(jí)的獲取中無凝聚劑的添加。分級(jí)的樣品冷凍干燥。2.3 DNA提取對(duì)DNA的提取，我們對(duì)van Elsas和malla描述的方

18、案做了稍微修改。冷凍干燥的土壤（0.3至1.0g）和0.38g的溶菌酶再次懸浮在0.75mld的0.12mol磷酸鈉緩沖液（PH=8.0）中，混合物在37培養(yǎng)15分鐘。樣品一直放在冰上冷卻，加入750mg酸洗的玻璃微珠，微珠搏動(dòng)在混合磨機(jī)（type MM2000; 220 V, 50 Hz; Retsch GmbH & Co. KG, Haam,Germany)）中以最高速度運(yùn)行90s，進(jìn)行三遍，間隔30s。加入SDS(45 l of a 20% solution)后混合物在室溫下培養(yǎng)15min。接著，加入一體積的苯酚，混合物混勻后在10000g下離心5min。有機(jī)段層用0.12MSD

19、S再次提取，水層用1體積的氯仿混成一體提取，再在10000g下離心5min后，向水層加入 1體積5M醋酸鉀，室溫下沉淀腐殖酸15min。樣品在10000g下離心5min，上清液加入0.1 體積5M NaCl and 0.7體積異丙醇校訂，并在-80下培養(yǎng)30min以沉淀DNA。DNA在10000g下離心10min獲得，產(chǎn)生的球粒用70%的乙醇洗滌，在80µLTE10（mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA）中干燥，再懸浮。為了進(jìn)一步純化，準(zhǔn)備了含瓊脂糖凝膠 CL-6B 和聚乙烯吡咯烷酮 的純化柱。在多數(shù)情況下，通過兩個(gè)柱的通道需要去除所有抑制PCR的物質(zhì)。2.4 T-

20、RFLP 分析真細(xì)菌的引物8f，用羧基熒光素標(biāo)記5末端，518r被用來擴(kuò)增大約530bp的16srRNA基因。反應(yīng)在PTC-100熱循環(huán)儀中進(jìn)行，先5min 95初步變性，接著95下35次30s的循環(huán)，1min54的退火2min72下的延伸。PCR混合物（50µl）包含1×反應(yīng)緩沖液，200µM （每一個(gè)）dATP,dCTP,dGTP,dTTP,0.15µM引物，3nM MgCl2;2.5 U Taq聚合酶；20ng模板DNA。PCR產(chǎn)物放進(jìn)20µl HhaI and HaeIII 10U 的組合限制性酶液中消化2h。用幾個(gè)在4-bp識(shí)別位點(diǎn)限

21、制酶的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明 HhaI and HaeIII 10U 的組合產(chǎn)出的末端限制性片段（T-RFs）較多相比于其他酶。整分（1µl）中混入0.16µl甲酰胺，0.83µl加樣緩沖液，0.3µlDNA標(biāo)準(zhǔn)片段長度液。反應(yīng)混合物在92下變性2min，電泳前放在冰上冷卻。樣品在5%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用ABI373ADNA自動(dòng)測(cè)序儀，分析熒光標(biāo)記的限制末端大小。標(biāo)記片段的長度通過與內(nèi)標(biāo)物的比較測(cè)出。2.5 T-RF分布圖的分析分析中考慮T-RF 在35至500 bp段波峰并且依據(jù)大小標(biāo)記物的范圍包括了峰高 50熒光單位。通常情況，用DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定片段

22、大小的錯(cuò)誤小于1bp，可是，在一些情況下，會(huì)出現(xiàn)較高的變異度。因此，只要小于1.5bp 差異的T-RFs都被歸為一類，除非能重復(fù)的檢測(cè)出一些個(gè)體的波峰。每個(gè)處理的三個(gè)重復(fù)樣品和顆粒大小要么被單獨(dú)的分析，要么樣品分別用相同的方法檢測(cè)，方法參照Dunbar et al。重要的是，在每一個(gè)重復(fù)分布圖計(jì)算出峰高的總和，表示為總的DNA 量?？偟奈盏臒晒馔ㄟ^計(jì)算校正因子調(diào)整到中DNA的量。例如三個(gè)重復(fù)分布圖的總的熒光吸收值，4500，4700，4900，每一個(gè)波峰在后者的分布圖, 在后一個(gè)圖中的每一個(gè)波峰乘以因子0.96，第一個(gè)圖中的波峰乘以因子1.04。調(diào)整后的只考慮50熒光單位的波峰。而且，T-R

23、Fs在至少2/3的重復(fù)中，得分是積極的。為了測(cè)定T-RFP分布圖的相似性，創(chuàng)建了記錄綁定片段缺失和存在的二元矩陣?；蜷L度的估計(jì)參考Nei和Li，并且結(jié)合 UPGMA (數(shù)學(xué)平均值未加權(quán)兩組) 的方法，用來比較T-RFP酶解圖譜。用TREECON軟件包做分析和建進(jìn)化樹形圖。2.6 小亞基 rDNA 克隆文庫從AM處理中粘粒中DNA提取用于創(chuàng)建16S rDNA克隆文庫。16S rRNA基因用引物8f通過PCR在上述PCR條件下擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增物大約1500bp長，與綁定到噬菌體質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli DH5 活性細(xì)胞中。經(jīng)過一夜的轉(zhuǎn)化后，單細(xì)胞克隆菌落被轉(zhuǎn)移至含有1.5

24、mlEppendor管中，管內(nèi)80µlTE緩沖液。Eppendor管加熱至9510min以溶解細(xì)胞，于冰上冷卻，在13000rpm下離心2min，上清液用于后續(xù)PCR。2.7 克隆嵌入物PCR產(chǎn)物測(cè)序插入序列通過PCR擴(kuò)增，先5min 95初步變性，接著95下30次30s的循環(huán)，1min50的退火，2min72下的延伸。PCR混合物（50µl）包含1×反應(yīng)緩沖液，200µM （每一個(gè)）dATP,dCTP,dGTP,dTTP,0.15µM引物M13和M13rev；2.5 U Taq聚合酶；1µl來自轉(zhuǎn)化株細(xì)胞溶解的上清液。PCR產(chǎn)物通過

25、參照NucleoTraPCR kit廠家的介紹說明純化，純化產(chǎn)物用作測(cè)序反應(yīng)的模板。DNA用ABI373ADNA自動(dòng)測(cè)序儀和 ABI PRISM Big Dye 終止循環(huán)測(cè)序工具(Perkin-Elmer)測(cè)序。2.8 遺傳進(jìn)化分析測(cè)序是利用NCBI數(shù)據(jù)庫依照BLAST分析并和可測(cè)序的RDP做了比較。相關(guān)測(cè)序的校準(zhǔn)利用了 Multalin校準(zhǔn)工具做的，工具在網(wǎng)上（http:/www.toulouse.inra.fr/multalin.html)可以得到。用TREECON軟件包計(jì)算了距離矩陣，并依據(jù)最近相鄰原則建了進(jìn)化樹形圖。2.9 核苷酸序列檢索號(hào)本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的核苷酸序列存儲(chǔ)于NCBI數(shù)據(jù)庫序列

26、號(hào)為no. AF388312 to AF388362.3 結(jié)果3.1 T-RFLP 分析在不同施肥處理的長期施肥試驗(yàn)的不同顆粒片段中細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)用T-RFLP分析來檢測(cè)（圖1）。重復(fù)表現(xiàn)出一定程度的變異，可是，當(dāng)比較所有分布圖時(shí)，它們會(huì)被分到一組。因?yàn)橐恍┢沃怀霈F(xiàn)在個(gè)別重復(fù)中，所以檢測(cè)了總的55T-RFs，具有代表性樣品分布圖中總的T-RFs數(shù)減至43。在單個(gè)樣品的分布圖中T-RFs數(shù)范圍從7（休閑耕作和泥炭，沙粒）至26（腐熟動(dòng)物肥，粘粒）（表1）。在所有的處理中，沙粒中的細(xì)菌多樣性最低，粘粒中的最高。唯一例外的是泥炭作有機(jī)修復(fù)物的處理，其T-RFs數(shù)最高出現(xiàn)在粉粒中（表1）。涉及綠肥（G

27、M）和腐熟動(dòng)物肥(AM)的處理表現(xiàn)出更高的細(xì)菌多樣性，特別是粘粒中，相比于其他有機(jī)修復(fù)物。另外，GM中的沙粒表現(xiàn)出異常高的多樣性，相比于其他處理中的沙粒。在幾綠肥出處理的幾個(gè)處理中，一些片段表現(xiàn)出遠(yuǎn)遠(yuǎn)更大的熒光信號(hào)。沙粒中檢測(cè)的多數(shù)T-RFs表現(xiàn)出集中的熒光信號(hào)，片段大小組成有：39,60,62,66,81,194,197,205,208,212,223,228,231,253,290,294,297,304，以及379bp(表2，圖1)。只有197bp（GM）,253bp(GM,AM),290bp(GM,AM,SS)三個(gè)T-RFs只在沙粒中發(fā)現(xiàn)。檢測(cè)的大多數(shù)沙粒中的T-RFs也同樣出現(xiàn)在粉粒

28、和粘粒中（表2）。一大部分（T-RFs）在粉粒和粘粒中發(fā)現(xiàn)，但沒有出現(xiàn)在沙粒中。細(xì)菌中大小為76bp和311bp（均是休閑耕作，F(xiàn)allow）的T-RFs至存在于（定殖于）粉粒中，很多T-RFs只發(fā)現(xiàn)于粘粒中。這里面有：140 bp (GM, AM, 和 SS), 233 bp (fallow, NoN), 242 bpfallow, NoN, Ca(NO3)2, GM, and AM, 284 bp (GM 和 AM), 332 bp (NoN,GM, AM, 及 peat), 404 bp (peat), 409 bp(SS), 以及 476 bp (SS).沒有發(fā)現(xiàn)具體特定處理的T-RF

29、s。SS作為肥料的處理表現(xiàn)出很強(qiáng)的205bp的波峰在所有的顆粒級(jí)中，但是缺少在其他肥料處理中發(fā)現(xiàn)的101,220, 262, and 329 bp片段 。而且， 95, 236, and 242 bp的T-RFs在泥炭處理和SS處理中都沒發(fā)現(xiàn)，盡管這些片段在其他處理中很豐富（表2）。在其他幾個(gè)處理中發(fā)現(xiàn)的228, 231, and 294 bp的T-RFs在GM作為肥料處理中非常豐富。聚類分析反應(yīng)了所有處理沙粒中的細(xì)菌群體的高相似性，只有SS處理的群落結(jié)構(gòu)在聚類中沒有體現(xiàn)出。包含沙粒微生物群落的聚類也包括了無氮處理中粘粒發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌。第二簇類包含棲息于粉粒和粘粒中的細(xì)菌群落。SS處理相比于其他處

30、理，其細(xì)菌群落相當(dāng)不同，在粉粒和粘粒中表現(xiàn)出高度相似性。3.2 序列分析及遺傳進(jìn)化分析排布我們獲得了部分測(cè)序信息從AM處理的粘粒中得到的涵蓋大約500bp的51 16S rRNA基因，在T-RFLP 分析中表現(xiàn)出最高的多樣性。24h測(cè)序表現(xiàn)出與RDP數(shù)據(jù)庫記錄條目高相似性，其中30個(gè)序列表現(xiàn)出與NCBI數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)的已知序列有至少95%的相似性（表3）。剩余的序列與已知的16S RNA基因，未描述的細(xì)菌分類成員以及有描述的分支很遠(yuǎn)的成員只有中等（90-94%）相關(guān)性。遺傳進(jìn)化分析反應(yīng)出克隆物沒有均等的干擾不同細(xì)菌分類。 屬于Holophaga/Acidobacterium 分類的細(xì)菌占實(shí)驗(yàn)中克

31、隆的菌37%，27%可以分到高GC或者低GC革蘭氏陽性菌。剩菌余的克隆菌屬于 -,-, and -Proteobacteria（18%），Verrucomi-crobiales (12%), Flexibacter/Cytophaga/Bacteroides （4%），Planctomycetales（2%）。一個(gè)遺傳進(jìn)化樹包含三個(gè)Holophaga/Acidobacterium簇類中人工培養(yǎng)的成員，本實(shí)驗(yàn)得到的序列，其他環(huán)境克隆菌如圖3中展示的。因?yàn)檫@個(gè)進(jìn)化樹知識(shí)建立在部分測(cè)序，它展示的屬于Holophaga/Acidobacterium簇類細(xì)菌的大量多樣性，而不是確定的遺傳進(jìn)化關(guān)系。所有測(cè)

32、序的克隆菌的理論HaeIII-HhaI T-RFs 在T-RFLP分布圖中可以看到。理論的T-RF132bp是唯一的例外，沒有在T-RFLP 分析中檢測(cè)到。幾個(gè)序列表現(xiàn)出相似的T-RFLP大?。ū?）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遺傳進(jìn)化和土壤中空間的位置的關(guān)系。一些細(xì)菌組，如Holophaga（全噬菌屬 ）/Acidobacterium（乳酸桿菌屬）簇類，大多數(shù)Prosthecobacter（突柄桿菌屬 ）成員，是更小顆粒中主要的存在菌，而Proteobacteria（變形菌門）在各種顆粒中分布大致相當(dāng)。4 討論4.1 細(xì)菌與土壤顆粒級(jí)的聯(lián)系幾項(xiàng)研究報(bào)道，在更小的顆粒中的微生物生物量更高。我們的結(jié)果清楚了表明了

33、不僅生物量，還有細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，深刻的被土壤顆粒大小影響，即更小顆粒比更大顆粒擁有更高的微生物多樣性。粉粒和粘粒中更高的生物量可以歸結(jié)于更高的微生物多樣性，而不是特定物種的定殖。這一點(diǎn)通過在所有粒級(jí)中的幾個(gè)T-RF波峰的相似的熒光密度表明。更細(xì)小的顆粒為微生物提供一個(gè)阻擋捕食者的保護(hù)性的微生境。近期，研究表明在水生環(huán)境中，捕食者的攝食規(guī)則可能是細(xì)菌群落組成的主要構(gòu)建外力。本研究中，屬于Proteobacteria亞門的-,-,的細(xì)菌被證明是耐攝食的菌群，主要?dú)w因是3- to 6-µm的棒體的構(gòu)造，這個(gè)構(gòu)造可能是超過了原聲動(dòng)物能攝食的細(xì)菌大小。另外，屬于-Pro-teobacteria

34、及Cytophaga-Flavobacterium 簇類的絲狀細(xì)菌被證明是抗攝食。而且，觀察到Rhizobium leguminosarum免受土壤中原生動(dòng)物攝食，這部分保護(hù)來自皂土粘粒的添加。在我們的試驗(yàn)中，微生動(dòng)物的攝食可能表現(xiàn)出對(duì)沙粒中群落結(jié)構(gòu)的的有選擇性的壓力。最豐富的T-RFs主要是從-Proteobacteria中得到的 ，我們假定，可能耐攝食性是沙粒中一些細(xì)菌群擁有高豐富度的原因?？赡埽☆w粒中的提供的大量可利用的營養(yǎng)可能是更高細(xì)菌多樣性的原因。根據(jù)van Gestel et al，微生物，有機(jī)質(zhì)，粘粒的相互臨近對(duì)微生物的生存來說是必要的，這個(gè)空間里的有機(jī)質(zhì)，粘粒提供基質(zhì)和營養(yǎng)

35、。更細(xì)小粒級(jí)中有機(jī)質(zhì)和微生物的豐富度，似乎是聚合體形成的后果。聚合體伴隨著特定有機(jī)質(zhì)的分解形成。因此，沙粒中發(fā)現(xiàn)的T-RFs可能代表了那些更好適應(yīng)有限營養(yǎng)條件，或者能利用更大范圍基質(zhì)的細(xì)菌菌種。他們可能能夠降解來自植物材料初步降解的高分子，大分子有機(jī)分子。16S rRNA基因序列的遺傳進(jìn)化排布表明有非常豐富的-Proteobacteria，如 Sphingomonas (T-RF of 81 bp)及Rhizobium-Agrobacterium群的細(xì)菌。-Proteobacteria的一些成員利用大范圍的基質(zhì)，菌種Sphingomonas因?yàn)槟軌蚪到夥枷阕鍙?fù)合物而被特別認(rèn)識(shí)。因?yàn)樯沉Ｋ坪醺鼉A

36、向于被真菌定殖，沙粒里一些細(xì)菌可能競(jìng)爭(zhēng)不過真核生物。更進(jìn)一步的認(rèn)為群落組成由氧氣濃度決定，序列分析表明粘粒中有好氧細(xì)菌存在，還有嚴(yán)格厭氧細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌的存在，這表明大小小于2µm的顆粒為好氧和厭氧菌提供了小生境，然而更大的顆粒級(jí)被好氧微生物占據(jù)。最近，觀察到土壤中由密集菌苔平板的粘粒聚合體構(gòu)成的生物膜的顯影,這些粘粒聚合體包含一種或多中細(xì)菌，層狀硅酸以鹽及鐵氧化物顆粒。粘粒被細(xì)胞外的多糖基質(zhì)聚在一起，排成窩狀，被用作微生物的住所。這些粘粒窩曾經(jīng)被提議作為土著細(xì)菌的最小限度的營養(yǎng)球，可能至少部分解釋了更高微生物多樣性在粘粒中的現(xiàn)象。Holophaga/Acidobacterium

37、門在來自AM處理粘粒里被分析的克隆菌中是最豐富的最多樣性的群組。這種細(xì)菌組在其他土壤中也是優(yōu)勢(shì)菌種，本研究，Holophaga/Acidobacterium門主要定殖在粉粒和粘粒中。因?yàn)檫@菌門中包含Holophaga foetida, Geothrix fermetans, 以及作為至今唯一培養(yǎng)菌種的Acidobacterium capsulatum，自然中這些微生物的作用的信息還很少。另外，Verrucomicrobiales的菌種，表現(xiàn)出與Prosthecobacter很高的相似性，主要在粉粒和粘粒中發(fā)現(xiàn)。此菌種的一個(gè)特點(diǎn)是菌柄的構(gòu)成，由窄的，細(xì)胞質(zhì)含有的細(xì)胞壁延伸物組成。他們有了幾個(gè)好氧異養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)點(diǎn)，如加強(qiáng)的呼吸和營養(yǎng)的攝入，同樣提高的固體基質(zhì)附著力。而且，已知的Prosthecobacter門菌種只利用很窄范圍的糖類作為他們唯一的碳源，這可以解釋為什么它們?cè)诟〉牧＜?jí)中生存。4.2 粒級(jí)中細(xì)菌對(duì)有機(jī)修復(fù)物的響應(yīng)在以前的研究中，在Ultuna 長期田間施肥實(shí)驗(yàn)的不同處理的效果表現(xiàn)出了關(guān)于有機(jī)質(zhì)循環(huán)非常