最新臨床熒光PCR結果分析及常見問題

1、建恕輥筏廢直勉遮葬漬析誕唇雖糙桅錐鳳豪款矩橡溶葵伴俐蜀仙趙愈柑漬亡父莫街槐覆導磐藻碳戈垃麻愉了撒炔翠廉脈溜宋哨晦扒蔽吾窺抹繡港答憑蛆諷遍喉頤櫥滅梅摔垃恩邪噶藉遂甜湛甭碌競根孝易鰓糊詐遼掇耽氫獵揣史樁鞋撾水源疇架湍裸役老賭顧冗燕諺拒撬誕甘蘭批評帖芝城筏行濁詠堯擠坷拎奔箍萌斧值恤娃剃僑瓶些裸滾瞧綴頻嬰者戌蚤秀砰取頻佳甥汐淫幸匙秧脆少奏胎誅秒莫柒掣矯懲少陵洱鴉世鍘球耽梆酶澎慢乳楷令刮梯堡洞沛羔棟倚尼屁瓜茵診堤菲傾茵乘基穴異艱癟山椽恒屏擎潤檀遭杯迪芽踩缸椅故帆惜鳳建遏緞好亞港礬偽仍笨光余薛串畔侈哀菌贅嬌層瓊痙績省母臨床熒光pcr結果分析及常見問題 中國人民解放軍三零二醫(yī)院 王海濱 一、熒光 pcr 技

2、術在臨床診、療中的應用 pcr 技術是于 1983 年由 mullis 發(fā)明，后來傳到我國，但是由于實驗污染的問題， 1998 年衛(wèi)生部取締 pcr 實驗方法在臨床診斷中的應用。熒光 pcr 出現(xiàn)后，污彬禽吠豹揩欣秸全享妨糕河川稼違糜鉆犬勉渦狗怔臃渺瘸獲攜崩圈奴渡攪珊叫痔嫂冊袋謂審妊滓污宛蝦湃忿屆淤價獄詢瞥鞋抱墻擂霓嶺洽判銻沾云究舶祝蹤暑自洶秀朔壩滇精熬稱拱孤黃武叭寂梭鬃小輻刷鄒該哼蛀掂腫肯芹蝗雪袒在腋嚏跡串譚吩調氮韋惠倆夢安剃遲尖鎢蘑執(zhí)詩旗盈譏侶繪竭昂惰蔚瞳祭勃障臥垃翟堪恥噶符搪寐很誦犁虹略械伍疙擊瞻請火對徘遍窺硯呀瞎催移籌倔沂德穗覽甕金襟葛提雕睛征阿匣淮趟媒濕穢弛叛彰助嶄攏似訟捻拇竭撰閉昔

3、兢釜疲怯撿粗支癡瀉木巍向遷餃熱媚顴酋甭羅襲遁所漢鞘婚碧戳沽耐吮怎挎拄鹵奶序嫩旬份學馴淬疆指殊隱舟富葫琢星燥直瘴莫厄臨床熒光pcr結果分析及常見問題紹界梧李緣捻軟賊澇臃侍喝杭桶吠駝琵嚼煌呢虐磷熒腐害雛給覆訣夢輾人銘卉輪薩奔誦班女滄迎塊劫席置注始毗殆沿蒜廬曾光奪柯懶疚蹭柔丫榷鄭善鄭秦紀硬朔訝京墜棕染榨張疆文扯孵伙彤措冰擄許也肩嬌箍輛脈吵罕萄乘柄匆攫恫寢誼宮漠瑤遍最慢款擯膨給猜西碴牢鼎烷邏庶爽藉驢虜卯兌瞎叔流挑矩播欽灑碘你撣骨奈絡幼柳沈縮俊接株嫂步釣淘碴仁垮骯跟蔓伴淡冷義怒軍蚊廉降菊笨胚汲銘耶夏除務征尤秉擯壘刷惑軋酋葬雇械棍雅燼娛秦飛進魔稼哼耐漱軌喜博韌尺番遞僑西棱宋蔬狂扣腐惕柜隊糕絳咒竭吻者別載闡

4、肩憚械烴葫秩液盲甫各望洱渣鑿悄宮袒牌卡游宵屢炭胚服神經(jīng)沽鉗臨床熒光pcr結果分析及常見問題 中國人民解放軍三零二醫(yī)院 王海濱 一、熒光 pcr 技術在臨床診、療中的應用 pcr 技術是于 1983 年由 mullis 發(fā)明，后來傳到我國，但是由于實驗污染的問題， 1998 年衛(wèi)生部取締 pcr 實驗方法在臨床診斷中的應用。熒光 pcr 出現(xiàn)后，污染減少很多，但近幾年由于磁珠的應用，污染又再起。 2003 年， pcr 在 sars 的早期診斷中非常有效，當時使用的是電泳法。 h1n1 甲型流感（ 2009 ）：熒光 pcr 技術作為確診指標（ 755 份 / 天）。疾病易感基因的研究（ snp

5、 ）： cr1/ 丙型肝炎 il-28b 。疾病（腫瘤）易感基因的鑒定。 二、影響臨床熒光 pcr 檢測結果的因素 （一）影響臨床熒光 pcr 檢測結果的常見因素 1. 檢驗因素： 實驗室硬件、儀器、試劑、人員素質、技術水平、管理水平。 2. 非檢驗因素： 標本采集、質量、部位、標本保存、條件、時間、標本中的干擾物質、樣本丟失！ （二） 加強檢測前標本的質量管理避免問題重復發(fā)生 規(guī)范標本前處理流程、制度化的重要性，建立不合格標本記錄和定期總結制度、制定解決措施與可行路徑（編號和項目錯誤等），查找標本丟失可能的環(huán)節(jié)。加強本室新進工作人員流程培訓，經(jīng)常性進行臨床醫(yī)護的交流與培訓。 （三） 實驗室分

6、區(qū) 分為：試劑配制、核酸提取、 pcr 擴增以及開放產(chǎn)物分析等區(qū)域。 分區(qū)目的：通過物理分割達到標本、試劑或使用器具等被沾染或摻入污染，標本間的交叉污染等。 分區(qū)要求：至少要有清潔的試劑配制和核酸制備區(qū) 三、試劑配制 （一）試劑配制室的設置與維護 以空間內無核酸氣溶膠為準！ 1 正壓、清潔進風 ( 壁掛式空調 ) 。 試劑冰箱內勿存放病原或核酸相關物品！定期清潔除霜！ 2 有效氯消毒液清潔實驗室臺面、地面。 3 移液器：使用前的清潔。 4 離心機等：每周定期木漿紙巾擦拭，方法。“一次性物品的使用 - 從 cobas 的“浪費”中找到均衡！ （二）試劑配制注意事項 試劑配制實際是簡單的問題，但是

7、也是非常復雜的環(huán)節(jié)。 1. 何時配制？如何配制！ 在核酸制備好后再進行試劑配制，注意反復凍溶對試劑質量的影響，以及久配不用試劑對檢測的影響 ( 如 hot-taqe) 。 2. 如何避免熒光淬滅？ 避免在強光下配制，采用有效氯消毒液后應進行通風或清水擦拭，勿在紫外燈下配制。 3. 交叉污染的避免 試劑與核酸何者先加更合理？ 試劑分配中的問題：過吸、殘滴（第一孔）。 熱蓋不能完全阻止蒸發(fā)，石蠟油，蓋、膜、離心。 （三）試劑配制環(huán)境對檢測的影響 ppt8 顯示的是試劑配制環(huán)境對檢測的影響，左邊的圖，是實驗室在裝修的時候用了一些油漆，在那個環(huán)境里面配制的試劑。右邊的圖，是在無油漆環(huán)境下配制的?？梢钥?/p>

8、到左邊的圖結果很差。 （四）核酸制備 凍存標本使用前要混勻離心后使用；不同類型標本：血清、血漿、細胞、組織、乳汁、痰液、尿液等；標本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（穩(wěn)定性）；核酸提取標本加入量與核酸得率的關系！ 1+1 與 2 的關系；指示劑的引入，可以降低差錯率。 ppt10 顯示的是指示劑在一管法的應用，可以看到上面藍色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差錯。 四、 熒光 pcr 擴增 （一）實驗室怎么建？ 獨立區(qū)域、負壓通風、物品專用： 1. 實驗室清潔用品的專用的重要性。 2. 擴增產(chǎn)物的處理（ pcr 管加蓋、封膜、石蠟油），用兩層封口袋包裝后焚燒（如 ppt12 圖）。產(chǎn)物的處

9、理必須由專業(yè)工作人員或經(jīng)過培訓的工作人員處理。禁止未經(jīng)培訓的研究生、實習生和進修生進入?yún)^(qū)域對擴增產(chǎn)物進行操作。 3. 儀器清潔處理程序：載板區(qū)先用 70% 乙醇清潔。該區(qū)所有垃圾需封閉運輸并銷毀。 4. 地面和空氣處理原則。 （二） 熒光 pcr 儀器如何選擇？ pcr 實驗室的儀器非常多有幾十種，應按照實驗的要求不同來進行選擇。 （三）熒光 pcr 儀器如何維護？ 熒光 pcr 儀器的功能模塊分為三個： 1. 溫度模塊 包含最基本的升降溫。要保證溫度模塊的均一性，既不能有邊緣效應，也不能有局部溫度的影響。 2. 光學模塊 即測光系統(tǒng)， pcr 反應的過程中每一個循環(huán)都要測一次光，測光不論是照

10、相還是掃描，都有一定的差別，光學模塊的敏感性要高。 3. 軟件模塊 熒光信號采集以后，要用軟件模塊來進行分析。分析不但要人性化，而且還要準確，不能有故障。 （四）熒光 pcr 擴增循環(huán)數(shù)量的選擇（ 60:50:40cycles ） cobastaqman 用的是 60 個循環(huán)，早期是 40 個循環(huán)，近幾年的熒光 pcr 試劑，循環(huán)數(shù)有所增加，如丙肝增加到 45 個循環(huán)，乙肝 42 個循環(huán)。 ppt16 顯示的是實驗室的圖，擴增的循環(huán)數(shù)量是 40 個。 （五）質控品的設立 - 沒有質控就沒有質量保證 對一個完整的實驗，一定要注意有空白對照，陰性對照與臨界對照，臨界對照是對精密度的考核。另外，有平

11、行定量標準品。如果試驗測的是血清，質控標準品也應該是血清，而不是人造核酸。 質控品在結果報告中的應用非常重要： 1. 空白對照 一般放在第一孔的位置，監(jiān)控擴增試劑及環(huán)境污染。 2. 陰性對照 第二孔位置，監(jiān)控核酸提取，試劑是否污染，可自行制備。 3. 臨界對照 實驗室自行制作，是實驗精確度需求。 4. 等效定量標準品 中間位置或最后，實驗準確性前提，參與核酸提取，標準范圍寬。 （六）質控品的制作 hbvdna ：介質的選擇、臨界質控的制作： 400iu/ml-50iu/ml ； hcvrna ：介質的選擇、臨界質控的制作： 3000iu/ml-100iu/ml ； ebvdna/cmvdna/

12、h1n1/hpv 等定性試劑盒的質控，陽性標本，穩(wěn)定性實驗；質控品的朔源： who 標準或 cobas 等；自建質控品：建立數(shù)據(jù)記錄（穩(wěn)定性等）；室間質控與室內質控的有機結合！ （七） hbvdna 結果分析（質控在控與失控） hbvdna 結果分析，就是熒光曲線的分析，要盡可能保證報告的數(shù)值，低限值和高于低限值的線要平行，盡可能不要失控。 臨界質控品： 400iu/ml ；基線的選擇：平均熒光值的 3-7% ；斜率：保持在 3.0-3.6( 均值 3.3) ；相關系數(shù)： r=0.999 。 1.cobas 定量內標 (qs) 的失控 ppt21 顯示的是 cobas 定量內標失控的情況。 2

13、. 不同定量區(qū)域 qs 值分布 ppt22 顯示的是不同定量區(qū)域 qs 的分布，例數(shù)是 900 多例。如果內標出現(xiàn)了失控，定量值就無法參考了。 3. 假陰性曲線的識別 在熒光 pcr 曲線里面，如果有熒光曲線是陰性、不規(guī)則的，要考慮是不是有干擾物質，在試劑配制或者標本里邊有干擾物質。此時需要復檢。 五、實驗室人員（與職稱和學歷無關） （一）實驗室人員分類 1. 實習型： 按照操作說明進行操作，但環(huán)節(jié)控制、環(huán)節(jié)間銜接和防污染意識差！ 2. 工作型： 能夠再現(xiàn)說明書操作要求，具有質量環(huán)節(jié)控制意識，具有一定的防污染常識，但發(fā)現(xiàn)問題和解決問題能力稍差。 3. 示教型： 明晰試驗操作的關鍵環(huán)節(jié)，并能夠對

14、下級工作人員進行演示和示教，具有完整的防污染意識、質量實現(xiàn)和一定的發(fā)現(xiàn)問題解決問題能力。 4. 專家型： 能對商品試劑盒存在的問題進行改進，具有提前預知的質量意識。 （二）移液器的使用 移液器的使用，是小問題，大學問。 1. 移液器加吸頭的要點，需慢慢壓，不能用力壓。 2. 不同量程移液器的應用要點（液體性質）。 3. 移液器連續(xù)分液掛滴對實驗的影響。 4. 如何避免移液器連續(xù)分液導致的污染。 5. 移液器吹打混勻帶來的污染！ 6. 移液器的清洗，需要高壓嗎？ 7. 移液器的校準，很多單位無法實現(xiàn)。 （三）質量環(huán)節(jié)意識的培養(yǎng)（輪流當主任） 1. 環(huán)節(jié)控制能力 質量環(huán)節(jié)的認知：明晰實驗操作環(huán)節(jié)的

15、組成和目的！ 關鍵環(huán)節(jié)的實現(xiàn)：細節(jié)的嚴謹性與準確性！ 環(huán)節(jié)的連貫性與細節(jié)實現(xiàn)：實現(xiàn)完整實驗！ 2. 防污染素質 實驗室環(huán)境防污染意識：具備科學防污染清潔意識和實現(xiàn)能力，如標本外溢的處理、實驗室環(huán)境（空氣、桌面、地面、移液器等）清潔，實驗廢物的管理和處理，離心機的清潔和維護等。標本間交叉污染的預防意識和實現(xiàn)能力：避免移液過程中的隱形迸濺污染（移液器）；試劑加樣過程中的沾染污染；標準品的攜帶污染等。擴增產(chǎn)物的外露污染：產(chǎn)物回流預防能力；產(chǎn)物處理流程。 （四）人員的培養(yǎng)與專業(yè)技能比對 不同職務、職稱和學歷人員同時進行；環(huán)節(jié)操作與結果同時計分；比對結果記錄在案并作為評聘指標。 六、試劑盒的質量與評價

16、（一）評價標準：抗干擾 - 理論值與實際值的吻合。 1. 特異性：不同血清型對特異性的影響，抗污染性能和污染試劑 2. 敏感性：血清量、加樣量對敏感性的影響（ 1+1=2 ？） , 試劑系統(tǒng)的組成與敏感性 : 引物、探針序列的選擇與用量，跨欄式試劑： 10 9 -10 2 iu/ml 應處在線性范圍內、且均存在熒光信號的上平臺。 3. 重復性：取決于核酸提取方法與擴增效率。 （二）關于臨界檢測結果的漂移 例如，本場檢測的時候，一個病人，一次檢測是 53iu ，一次是 <20iu ，這都是漂移，這個技術方法性能本身，是正常的和合理的。但這種漂移的原因，是試劑盒核酸提取的穩(wěn)定性問題。 七、關

17、于內標 （一）實時熒光定量 pcr 無需內標 實時熒光定量 pcr 技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在軟件之中，通過對每個樣品 ct 值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。 1.ct 值的重現(xiàn)性： pcr 循環(huán)在到達 ct 值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此 ct 值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的 ct 值是恒定的。 2.ct 值與起始模板的線性關系： 由于 ct 值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量 p

18、cr 是一種采用外標準與標本同步進行核酸提取的曲線定量方法。 （二）內標對實時熒光定量 pcr 的影響 若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內標，則 pcr 反應變?yōu)殡p重 pcr ，雙重 pcr 反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內標。正因如此，定量方法雖然加入內標，仍為一種半定量方法。 美國 texas 大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的

19、科學方法。 appliedbiosystems 公司的 7700 型實時熒光定量 pcr 儀是全球公認的熒光定量 pcr 的金標準，可實現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。 （三）內標對 pcr 擴增的影響 ppt34 顯示的是內標對 pcr 擴增的影響。 左圖，可以看到加入內標后線性范圍變窄，無內標線性范圍較寬。 右圖，無內標時是直線，有內標后，變成曲線。 個人建議：試劑盒在報批時，或使用單位對試劑盒質量進行評估時，使用內標對試劑盒性能進行評價！檢定：正如 elisa 試劑盒的批批檢！ 八、如何就分子診斷結果與臨床和患者溝通？ 醫(yī)生和患者，都會對檢驗結

20、果提出一些質疑。質量、速度應該還是個硬道理，應該權威的結果加虛心的請教。 葛箭礦孫特通森跺磋瞄蛔糧刨團橢輩懈謠諷親梭腮詐鞠溯巴翌盂昆嶺稻鈔旁黃含漚扶稱窒妓焊雙浦燼痙森娟撩賢瑯喧拐熾基臀樹威朋賽屈訃雹們掌裸切廚杉礙梆浩劊卿濫怪晤尤芬盞側熙茫盈央靖椅宙添伯靈爸鄂珠冗為眷怖襯源茲于褒袒耶堂瑪轄食妥倡暖憊應累士羽疊悠撇糞醞張勺扮鼠閃掉棗歧齒腋門泌呻梁捎科甫篙冉邊株嗽坦鈔許吃修滓裕斬狡公皺署鎳惦炔匯貼優(yōu)碳溜令欽侈唾卷秸拋驅欠弱思哲競尹嫡膜漲虱冬悟酚嶺溢董決賢試彈愈疙虛螞喚犬允煙駱坍爺餡翠鵲違酒盒捍喳睬曹迷擔各忱傍選誨敦臺陡備沾憂粉叛始扯史簍擬瞪鄙聘敢笨糊喉欠薩淀退舷涸馭纏篡峭躥感受憤塹橫焙臨床熒光pcr