岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的LrPR10的克隆及表達(dá)分析

1、園 藝 學(xué) 報 2014，41（6）：12181226 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131120；修回日期：20140508 基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863）項目（2011aa1008） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：zhangyanlong） 岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的lrpr10的克隆及表達(dá)分析 張響玲，張延龍*，牛立新，孫道陽，梁振旭 （西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100） 摘 要：為了

2、研究黃瓜花葉病毒（cmv）誘導(dǎo)的岷江百合（lilium regale）病程相關(guān)蛋白pr10基因在抗病毒防御反應(yīng)中的作用，對岷江百合葉片接種cmv，采用race技術(shù)獲得岷江百合lrpr10的全長cdna序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用實時熒光定量pcr對lrpr10在各器官特異性以及cmv和水楊酸（sa）處理后的表達(dá)模式進(jìn)行了測定分析。結(jié)果表明：lrpr10全長756 bp，可編碼由157個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白具有病程相關(guān)蛋白典型的bet_v1_like保守結(jié)構(gòu)域；lrpr10在岷江百合鱗莖中相對表達(dá)量最高，在嫩葉中最低；該基因可以被cmv和sa誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，岷江百合、卷丹（l. la

3、ncifolium）和宜昌百合（l. leucanthum）在cmv接種處理后lrpr10的相對表達(dá)量分別在4 d、4 d和1 d達(dá)到最大值，分別為處理前的58倍、27倍和292倍，在sa處理后lrpr10的相對表達(dá)量都在8 h達(dá)到最大值，分別為處理前的34倍、8倍和38倍。以上結(jié)果表明lrpr10在岷江百合抗黃瓜花葉病毒防御反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。 關(guān)鍵詞：岷江百合；黃瓜花葉病毒；lrpr10；race；表達(dá)分析 中圖分類號：s 682.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）06-1218-09 cloning and expression analysis of lrpr

4、10 gene from lilium regale induced by cucumber mosaic virus zhang xiang-ling，zhang yan-long*，niu li-xin，sun dao-yang，and liang zhen-xu （college of forestry，northwest a & f university，yangling，shaanxi 712100，china） abstract：this study aimed to clone pr10 gene which was up-regulated in the leaves

5、of lilium regale infected by cucumber mosaic virus（cmv）and examine the role of pr10 gene in defense response against cmv. the full length of lrpr10 was amplified by race and analyzed with bioinformatics tools. real-time pcr was performed to check the transcript levels of lrpr10 in different organs o

6、f l. regale，cmv-inoculated and salicylic acid（sa）treated leaves. the results showed that the length of complete cdna of lrpr10 was 756 bp，which encoded 157 amino acids consisting of a bet_v1_like conserved domain of pathogenesis-related proteins. the transcript level of lrpr10 was the highest in bul

7、bs，whereas the lowest in tender leaves. lrpr10 was significantly induced by cmv inoculation and sa treatment. transcript level of lrpr10 reached a peak at 4 d，4 d and 1d in the cmv-inoculated leaves of l. regale， 6期 張響玲等：岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的lrpr10的克隆及表達(dá)分析 1219 l. lancifolium and l. leucanthum respectively

8、，while the maximum relatively expression values in cmv-inoculated samples were about 58，27 and 292 times higher than the uninoculated ones in these three species. after sa treatment，lrpr10 peaked at 8 h in l. regale，l. lancifolium and l. leucanthum and the maximum relatively expression values in tre

9、ated samples were about 34，8 and 38 times higher than the untreated ones in three species. we hypothesize that lrpr10 from l. regale probably plays an essential role in plant defense against cmv. key words：lilium regale；cucumber mosaic virus；lrpr10；race；expression analysis 自stewart（1896）首次報道侵染百合的黃瓜花

10、葉病毒（cmv）到現(xiàn)在，已經(jīng)確定能夠侵染百合的病毒有19種（yamaji et al.，2001；劉博，2009），cmv是其中危害最為嚴(yán)重的病毒之一，常與其他病毒進(jìn)行復(fù)合侵染（asjes，2000）。百合育種專家都亟希望利用分子生物學(xué)的方法獲得抗病毒種質(zhì)資源（lipsky et al.，2002；徐秉良 等，2004；benidito et al.，2005；王進(jìn)忠 等，2005），以選育抗病毒百合新品種。 岷江百合（lilium regale）被公認(rèn)為百合屬中抗病性優(yōu)異的種類（yoshiji et al.，1996；yumi et al.，2000），對尖孢鐮刀菌具有很高的抗性（lim e

11、t al.，2003），對病毒病的表現(xiàn)尤其突出。王仙芝等（2008）用rt-pcr技術(shù)對岷江百合及秦巴山區(qū)的5種野生百合進(jìn)行抗病毒病檢測，發(fā)現(xiàn)岷江百合對cmv、百合無癥病毒（lsv）及百合斑駁病毒（lmov）的抗性達(dá)到免疫水平。 pr10蛋白最早在真菌誘導(dǎo)的歐芹培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)（somssich et al.，1986），目前已經(jīng)從70多種植物中鑒別出了100多種pr10基因（wen et al.，1997；markovic-housley et al.，2003；colditz et al.，2007）。研究表明，pr10蛋白具有體外抑菌活性和核酸酶活性（park et al.，2004；li

12、u et al.，2006），能被病原體（包括病毒、細(xì)菌、真菌）、sa、脫落酸、茉莉酸甲酯或乙烯誘導(dǎo)表達(dá)（constabel & brisson 1992；lo et al.，1999；mcgee et al.，2001；賀明陽，2012；parinita et al.，2013）。van loon和van strien（1999）及park等（2004）認(rèn)為，pr10蛋白可以通過降解病毒的rna來增強植物的抗性。在麻風(fēng)樹中，pr10蛋白具有核酸酶活性，并且對炭疽病菌表現(xiàn)出抗性（parinita et al.，2013）。pr10在華東葡萄中可以被葡萄霜霉菌誘導(dǎo)表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn)到易感病

13、的葡萄品種中可以增強其對霜霉菌的抵抗能力（he et al.，2013）。 本研究中根據(jù)岷江百合在cmv誘導(dǎo)下cdna文庫中的pr10的est序列設(shè)計特異引物，利用race技術(shù)克隆全長cdna，并通過實時定量pcr分析lrpr10在岷江百合不同器官中的表達(dá)模式，以及cmv和sa處理后該基因的表達(dá)情況，旨在了解該基因的有關(guān)特性及在抗病防御反應(yīng)中的作用，為進(jìn)一步開展百合抗病毒育種工作奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材料及其處理 供試植物材料岷江百合（lilium regale）、卷丹（l. lancifolium）和宜昌百合（l. leucanthum）均取自西北農(nóng)林科技大學(xué)百合資源圃，材料的

14、處理及取樣時間為2012年46月。已知岷江百合、卷丹和宜昌百合復(fù)合接種lmov和cmv的相對抗病毒指數(shù)分別為0.64、0.64和0.18，抗病程度分別為高抗、高抗和高感（王仙芝，2013）。黃瓜花葉病毒從該資源圃中感染該病毒的西伯利亞百合（l. oriental hybridssiberia）葉片中獲得。 分別采集正常生長的岷江百合嫩葉、嫩莖、花、鱗莖、根等器官，于液氮中冷凍后，80 保1220 園 藝 學(xué) 報 41卷 存。 選取正常生長的岷江百合、卷丹和宜昌百合，將cmv毒源植株黑暗處理8 h后取嫩葉1 g，用已滅菌的0.01 mol · l-1磷酸緩沖液（ph 7.2）稀釋至0.

15、001 mol · l-1，研磨后加少量石英砂摩擦接種葉片，接種后用蒸餾水沖洗。取樣時間為接種后0、1、2、3、4、5和6 d，將所取樣品液氮速凍后80 保存。 用2 mmol · l-1的sa噴灑到正常生長的岷江百合、卷丹和宜昌百合葉片上，于處理后0、2、4、6、8、10和12 h取樣，樣品經(jīng)液氮速凍后，置于80 保存。 1.2 岷江百合基因lrpr10的全長克隆 百合葉片總rna的提取采用改良的ctab法（尹慧 等，2008）。反轉(zhuǎn)錄按照fermentas公司的revertaidtm first strand cdna synthesis kit進(jìn)行。 根據(jù)已獲得的黃瓜

16、花葉病毒誘導(dǎo)的岷江百合cdna文庫中的est核心序列設(shè)計3race特異引物，gene racer 3primer：5-agctcgctcccgagatcttgctcagt-3，巢式特異引物gene racer 3nested primer：5-gggtgcatcgtgaaggtggtgacag-3。根據(jù)獲得的基因3端序列設(shè)計5race特異引物gene racer 5primer：5-ttcattctgcaagtggttctaagca-3，巢式特異引物gene racer 5 nested primer：5-aggtaagcttctgcagccttgaagag-3。引物設(shè)計用primer 5.0

17、軟件進(jìn)行并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 以接種黃瓜花葉病毒的岷江百合各時期葉片提取的rna混合樣為模板，使用 bd smarttm race cdna amplification kit（clontech）進(jìn)行race cdna擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測，回收目標(biāo)條帶連接至pgem-t easy克隆載體（promega）后測序（北京奧科鼎盛生物技術(shù)科技有限公司）。對測序獲得的lrpr10的5端序列和3端序列利用dnastar軟件進(jìn)行拼接，獲得岷江百合基因lrpr10 cdna 全長序列。 1.3 岷江百合基因lrpr10的生物信息學(xué)分析 采用ncbi的orf finde

18、r預(yù)測開放閱讀框；通過ncbi網(wǎng)站上的blast搜索，查找lrpr10的同源序列；用 ncbi 的 protein blast進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析；通過dnaman軟件分析lrpr10基因的編碼氨基酸以及比較氨基酸序列的同源性；利用mega 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用 protparam 程序（http：/expasy. org/cgi-bin/protparam）預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量和等電點；根據(jù)signalp 4.1 server（http：/www. cbs. dtu. dk/services/signalp/）分析蛋白質(zhì)的信號肽；用tmhmm（http：/www. cbs. dtu

19、. dk/services/tmhmm/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；據(jù)protscale（http：/www. expasy. org/cgi-bin/ protscale. pl）分析蛋白質(zhì)的親水性。根據(jù)motif scan（http：/hits. isb-sib. ch/cgi-bin/pfscan/）研究蛋白motifs。 1.4 岷江百合lrpr10表達(dá)的器官特異性分析 根據(jù)已獲得的岷江百合基因lrpr10 3端非保守區(qū)序列設(shè)計合成定量的引物lrpr10-1：5- taag aggctggctaccccaattc-3，lrpr10-2：5- attggggtagccagcctctta

20、ca-3。以18s rrna基因（genbank登錄號：d29775.1）為內(nèi)參基因，其引物為18s rrna-1：5-tctcaaccataaac gatgccga-3，18srrna-2：5-tttcagccttgcgaccatactc-3。分別取岷江百合嫩葉、嫩莖、花、鱗莖、根等器官的總rna各1 µg，反轉(zhuǎn)錄為cdna。按照sybr premix ex taqtm （perfect real time）（takara，japan）的說明書進(jìn)行實時熒光定量，在iq5 multicolor real-time pcr detection system（bio-rad，usa）上檢

21、測基因在不同組織的相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。pcr 擴增6期 張響玲等：岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的lrpr10的克隆及表達(dá)分析 1221 程序為：95 變性1 min；95 變性30 s，58 退火30 s，72 延伸30 s，40個循環(huán)。用excel 2007和origin 7.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算和處理，定量數(shù)據(jù)的處理方法采用2-ct法。用spss軟件進(jìn)行差異顯著性分析。 1.5 岷江百合lrpr10的表達(dá)模式分析 分別取cmv和sa處理后不同處理時間的葉片總rna 1 µg，進(jìn)行表達(dá)模式分析，本操作所用的引物、pcr程序及數(shù)據(jù)處理方法均同1.4所示。 2 結(jié)果與分析 2.1

22、 岷江百合lrpr10全長cdna序列的獲得 race擴增后，得到長度為405 bp的3 cdna序列和長度為518 bp的5 cdna序列（圖1），利用dnastar軟件進(jìn)行拼接后，獲得了756 bp的全長cdna。開放閱讀框（open reading frame，orf）長474 bp，編碼157個氨基酸。將該基因命名為lrpr10，genbank登錄號為kf690636。 圖1 岷江百合lrpr10的race擴增結(jié)果 fig. 1 race amplification product of lrpr10 from lilium regale 2.2 岷江百合lrpr10的生物信息學(xué)分析

23、經(jīng)protparam預(yù)測lrpr10蛋白的分子量為16.8 kd，等電點為5.39，為酸性蛋白。利用signalp 4.1分析可知，該序列無信號肽，為非分泌蛋白。經(jīng)tmhmm預(yù)測該蛋白不具跨膜區(qū)，屬于胞內(nèi)蛋白。通過protscale分析表明，lrpr10蛋白為親水性蛋白，其親水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸含量。通過ncbi的protein blast分析顯示，lrpr10蛋白具有病程相關(guān)蛋白典型的bet_v1_like保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。 圖2 lrpr10蛋白的保守域分析 fig. 2 conserved domain analysis of lrpr10 protein 1222 園 藝

24、學(xué) 報 41卷 motif scan分析表明，lrpr10蛋白含有1個n糖基化位點（56 59位氨基酸），4個酪蛋白激酶磷酸化位點（40 43、83 86、92 95和127 130位氨基酸），3個n豆蔻?；稽c（47 52、87 92和124 159位氨基酸），該編碼蛋白3 152位氨基酸具有病程相關(guān)蛋白bet_v_i家族保守域。 氨基酸序列比對結(jié)果（圖3）顯示：lrpr10蛋白與同屬的麝香百合中6種pr10蛋白（lilium longiflorum aad17336.1、aaf21625.1、aaf21624.1、aaf21623.1、aaf21622.1、aad17335.1）的同源性分

25、別為91%、89%、89%、88%、88%、87%；而與小麥（triticun aestivum，tapr10，acg68733.1）、高粱（sorqhum bicolor，aavv83209.1）、玉米（zea mays，np 001131012.1）、番紅花（crocus sativus，adl09408.1）的pr10蛋白同源性分別為54%、54%、53%、53%，這些蛋白都具有病程相關(guān)蛋白bet_v1_like保守結(jié)構(gòu)域。 圖3 岷江百合lrpr10蛋白與其他植物pr10蛋白的氨基酸序列同源性比對 fig. 3 alignment of amino acid sequences of

26、lrpr10 protein and pr10 protein from other plants 將lrpr10蛋白與ncbi檢索的其他物種中16種pr10蛋白進(jìn)行多序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果顯示，岷江百合pr10蛋白與同屬的麝香百合llpr10-1（l. longiflorum，aad17335.1）和llpr10-7（l. longiflorum，aad17336.1）蛋白的親緣關(guān)系最近，與單子葉植物玉米（zea mays，np 001131012.1），高粱（sorqhum bicolor，aavv83209.1），水稻（oryza sativa，aal74406.1），小

27、麥（triticun aestivum，acg68733.1），黑麥草（lolium perenne，aeo11776.1）中的pr10蛋白具有相對近些的親緣關(guān)系，與裸子植物加州山松（pinus monticola，afr78290.1）的pr10蛋白親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，而與雙子葉植物pr10蛋白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。 6期 張響玲等：岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的lrpr10的克隆及表達(dá)分析 1223 圖5 lrpr10在岷江百合不同器官中的相對表達(dá)量 不同字母表示差異顯著（p < 0.05）。 fig. 5 expression analysis of lrpr10 gene in diffe

28、rent organs of lilium regale different letters indicate significant differences among different organs（p < 0.05）. 圖4 幾種植物pr10氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 數(shù)字代表進(jìn)化距離。 fig. 4 phylogenetic tree of amino acid sequences of the pr10 from several plant species numbers stand for evolutionary distance. 2.3 lrpr10在岷江百合不同器官中的

29、表達(dá) lrpr10在岷江百合嫩葉、嫩莖、花、鱗莖、根等各器官中的表達(dá)量均不相同，在鱗莖中的表達(dá)量最高，在嫩葉中的表達(dá)量最低（圖5）。說明lrpr10在岷江百合中存在組成型表達(dá)。 2.4 cmv侵染后lrpr10的表達(dá)模式 岷江百合、卷丹和宜昌百合接種cmv后lrpr10的相對表達(dá)量均增加，達(dá)到最大值的時間分別為4 d、4 d和1 d（圖6）。lrpr10的相對表達(dá)量在高感病毒的宜昌百合中最高，為接種前的292倍，在高抗病毒的岷江百合中相對表達(dá)量居中，達(dá)處理前的58倍，在高抗病毒的卷丹中表達(dá)量最低，為接種前的27倍（圖6）。不同抗性的百合中l(wèi)rpr10的表達(dá)情況存在明顯的差異，說明cmv可以誘導(dǎo)

30、lrpr10的表達(dá)，該基因是一個百合抗病毒相關(guān)基因。 2.5 sa處理后百合中l(wèi)rpr10的表達(dá)模式 sa處理不同抗性百合后，lrpr10的表達(dá)量與百合的抗性有關(guān)。在高抗病毒的岷江百合中的表達(dá)量明顯區(qū)別于卷丹和高感病毒的宜昌百合。 1224 園 藝 學(xué) 報 41卷 sa處理后，岷江百合、卷丹和宜昌百合中l(wèi)rpr10均被誘導(dǎo)表達(dá)，該基因在3種不同抗性的百合中均在8 h時達(dá)到最大值，但表達(dá)量存在明顯的差異，在高抗病毒的岷江百合中相對表達(dá)量為處理前的34倍，而高抗病毒的卷丹中相對表達(dá)量僅為處理前的8倍，高感病毒的宜昌百合中表達(dá)量的最大值為處理前的38倍（圖7）。由此可見，百合可以通過sa信號傳導(dǎo)途徑

31、參與抗病毒反應(yīng)。 3 討論 本研究中，3種不同抗性的百合葉片接種cmv后，lrpr10的表達(dá)量均有較大提高。其中，高感病毒的宜昌百合中表達(dá)量最高，高抗病毒的岷江百合中表達(dá)量居中，高抗病毒的卷丹中最低（圖6），岷江百合和卷丹僅為宜昌百合中的20%和9%。已知植物具有復(fù)雜的抗病機制，其對某種病毒產(chǎn)生抗性是由結(jié)構(gòu)抗病毒機制和生化抗病毒機制共同作用的結(jié)果。作者所在研究組以前的試驗結(jié)果表明，岷江百合和卷丹都易感蚜蟲，而宜昌百合對蚜蟲卻高抗（王仙芝，2013），由此可知宜昌百合的結(jié)構(gòu)抗病毒能力遠(yuǎn)強于岷江百合和卷丹。而通過人工復(fù)合接種lmov和cmv試驗證明，3種百合接種初期均易被病毒感染，但最終對病毒的抗

32、性表現(xiàn)卻是高抗、高抗和高感（王仙芝，2013）。由此可知，較強的結(jié)構(gòu)抗病毒能力使高感病毒的宜昌百合中l(wèi)rpr10的表達(dá)量遠(yuǎn)大于高抗病毒的岷江百合和卷丹。以上結(jié)果表明，岷江百合lrpr10受cmv的誘導(dǎo)，且表達(dá)量與百合本身的抗性存在一定的關(guān)系，是一個百合抗病毒相關(guān)基因。 水楊酸依賴途徑是植物中主要的防衛(wèi)反應(yīng)信號途徑之一（彭金英和黃勇平，2005）。依賴于水楊酸的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以通過外源施加sa激活相同的一套pr基因（王冬良 等，2005）。已知sa是植物對病原菌產(chǎn)生抗性反應(yīng)的信號分子，能提高許多病原體響應(yīng)基因的表達(dá)（thomma et al.，2001）。已有研究表明sa可誘導(dǎo)辣椒、刺茄等植物

33、中pr10基因的表達(dá)（park et al.，2004；liu et al.，2006）。本研究中，sa處理不同抗性的百合葉片后，實時定量結(jié)果顯示lrpr10上調(diào)表達(dá)，岷江百圖6 岷江百合、卷丹和宜昌百合接種cmv后 lrpr10的相對表達(dá)量 同一時間，不同字母表示組間差異顯著（p < 0.05）。 fig. 6 expression analysis of lrpr10 in lilium regale， l. lancifolium and l. leucanthum in response to cmv in the same period，different letters in

34、dicate significant differences among groups（p < 0.05）. 圖7 岷江百合、卷丹和宜昌百合sa處理后 lrpr10的相對表達(dá)量 同一時間，不同字母表示組間差異顯著（p < 0.05）。 fig. 7 expression analysis of lrpr10 in lilium regale， l. lancifolium and l. leucanthum in response to sa in the same period，different letters indicate significant differences

35、among groups（p < 0.05）. 6期 張響玲等：岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的lrpr10的克隆及表達(dá)分析 1225 合、卷丹和宜昌百合均在8 h時達(dá)到表達(dá)量的最大值，但最大值存在明顯的差別，分別為未處理的34倍、8倍和38倍。結(jié)果表明，lrpr10可以通過sa信號傳導(dǎo)途徑參與岷江百合抗病毒的過程，并且該過程與百合本身的抗性有關(guān)。 通過黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)岷江百合中l(wèi)rpr10的克隆及表達(dá)分析結(jié)果認(rèn)為，lrpr10基因是百合抗病毒相關(guān)基因，而對于lrpr10在岷江百合抗病毒中的具體抗病作用以及抗性機理尚需進(jìn)一步的研究。 references asjes c j. 2000. c

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