TXR1、CD44基因與鼻咽癌細胞耐藥性的相關(guān)性研究

1、txr1、cd44基因與鼻咽癌細胞耐藥性的相關(guān)性研究長沙市第八醫(yī)院耳鼻喉科湖南長沙410100； 2.忪沙衛(wèi)生職業(yè)學院湖南長 沙 410100； *3.中南大學湘雅三醫(yī)院再鼻喉科湖南長沙410013 【摘要】目的：探討txr1與cd44基因沉默后細胞對紫杉醇的敏感性，探究鼻咽癌紫杉醇耐藥性逆轉(zhuǎn)與txr1、cd44基因沉默的關(guān)聯(lián)；方法：通過脂質(zhì) 體介導轉(zhuǎn)染方法，將txrl-sirna、cd44-sirna轉(zhuǎn)染至不同鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞 株，利用實時熒光定量rt-pcr檢測人鼻咽癌親木細胞種的txr1及cd44基因的 相對表達量，用集落形成實驗分別考察txr1、cd44在基因沉默后不同耐藥細胞 株

2、耐藥性的變化;結(jié)果:txrl-sirna或cd44-sirna干擾后,txr1與cd44基因 在耐藥細胞中的表達表達均得到了有效的抑制，通過txrl-sirna或cd44-sirna 干擾紫杉醇耐藥細胞后，紫杉醇耐藥細胞（hne-2/taxol、cne-l/taxol和5-8f/taxol） 對紫杉醇的敏感性出現(xiàn)了增高。txr1基因沉默后，紫杉醇耐藥細胞的ic50值分 別為：5.41±0.40、6.41±0.09 和 5.70±0.27 ng/ml （相應的 空白組分別為 11.2±0.5、12.2&

3、;plusmn;0.2 和 10.2±0.30 ng/ml）, cd44基因sirna干擾后，上述三種細胞的ic50值分別為:6.57±0.38、 6.81±0.19 和 7.34±0.33 ng/ml （相應的空白組分別為0±0.6、12.4±0.2 和 10.5±0.8 ng/ml）;結(jié)論：在鼻咽癌 細胞中txr1 mrna或cd44 mrna的有效抑制均能使兩種基因的表達下降，表明 cd44基因與txr1兩者的表達異有潛在的交互作用，運

4、用sirna沉默txr1與cd44 基因后，紫杉醇耐藥細胞的耐藥性可得到有效的逆轉(zhuǎn)，因此txr1與cd44基因 可成為鼻咽癌治療的潛在靶分子?！娟P(guān)鍵詞】鼻咽癌；紫杉醇耐藥性；txr1； cd44基因；rna干擾；studies on the correlation between the expression of txr1/cd44 gene with thetaxol resistant of nasopharyngeal carcinoma cellsying pengl hongwei peng2 guolin tan*, 3 (1.department of otoalryngolo

5、gy, eighth hospital of changsha;, changsha,hunan 410100)(2.changsha health vocational college, changsha, hunan 410100)(3.department of otoalryngology–head neck surgery，third xiangyahospital，central south university，changsha，hunan 410013)abstract objectives to investigate the correlation be

6、tween the expression oftxr1 or cd44 gene with the paclitaxel-resistant of human nasopharygeal carcinoma(npc) cells.to explore the correlation between the reverse of npc paclitaxel-resistant and the silence of txr1 and cd44 gene.methods lip2000 wasused as carrier for transfect sirna into different np

7、c cell lines.the expression of txr1and cd44 gene in different npc cells was determined by reversetranscriptionpolymerase chain reaction (rt-pcr) .the taxol resistance of npc cells was investigate by colony formation assay.results the expression of both txr1 and cd44 gene in taxol-resistant npc cells

8、 was significantly decreased after the transfection of txrl-sirna or cd44-sirna.inhibition of both txr1 and cd44 genecould lead to significant increment of taxol sensitivity of taxol-resistant npccells.after the transfection of txrl-sirna, the ic50 responses of hne-2/taxol， cne-l/taxol and 5-8f/taxo

9、l to taxol were 5.41±0.40, 6.41±0.09 and 5.70±0.27 ng/ml，respectively, while the corresponding values for the control cells were 11.2±0.5，12.2±0.2 and 10.2±0.30 ng/ml, respectively.and after the transfection of cd44-sirna，the ic50 res

10、ponses of hne-2/taxol，cne-l/taxol and 5-8f/taxol to taxol were reduced to be6.57±0.38，6.81±0.19 and 7.34±0.33 ng/ml, respectively, while the corresponding values for the control cells were 11.0±0.6， 12.4±0.2 and 10.5±0.8 ng/ml, respec

11、tively.conclusion inhibitation of txr1 mrna or cd44 mrnathe could reduce the expression of both txr1 andcd44 gene.the reciprocal inhibition expression between cd44 gene and txr1indicated the implicative interreaction between these two genes.the taxol sensitivityof taxol-resistant npc cells could be

12、partly reversed by silencing the txr1 or cd44 gene, revealling that both txr1 and cd44 gene play important roles in taxolresistance of npc cells and could be regarded as effective targets for npc treatment.keywords nasopharyngeal carcinoma, taxol-resistance, txr1, cd44 gene, rnainterference鼻咽癌(npc,

13、nasopharyngeal carcinoma)是一種常見的耳鼻咽喉頭頸部位惡性腫瘤之一，從全球范圍來看，其發(fā)病狀況具有很強的地域性，主要集中在中 國南部以及一些東南亞國家，年均發(fā)病率為百萬分之十五至二十1】。近年來， 放療與化療的一些新手段、新方法使鼻咽癌的療效得到了很大的提高，總體五年 生存率從上個世紀八十年代的50%提高到了上個世紀末的70%2，但1558% 的患者都出現(xiàn)了的病情復發(fā)以及不得不重復治療的現(xiàn)象3, 4】。紫杉醇是一類新 型的鼻咽癌藥物，il在臨床上取得了較好的療效5】。然而臨床研究發(fā)現(xiàn)，患者 在長期使用紫杉醇藥物后，由于腫瘤細胞的產(chǎn)生了耐藥性，會導致治療效果下降。 因此，

14、為了維持紫杉醇藥物的長期治療效果，就需闡明腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的機 理以及尋求如何逆轉(zhuǎn)其耐藥性的方法。這也是了臨床上兩個亟待解決的重大問題。紫杉醇耐藥基因1 (txr1，taxol-resistance gene 1)，是一種近年來發(fā)現(xiàn)的而寸 藥基因6】。為了進一步探求txr1與腫瘤細胞耐藥性間的關(guān)系，研究者做了更深 入的研究并發(fā)現(xiàn)txr1產(chǎn)生耐藥性的原因與血小板反應蛋白(thrombospondin-1， tsp1)的表達密切相。tsp1在之前的研究中就表明具有抗血管生成以及在腫瘤 形成過程中促使其凋亡的功能7】。而txr1的異常存在能降低tsp1的表達水平，從而導致了腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生。為

15、了進-步證實tsp1在紫杉醇耐藥性中的 重要作用，研究者對txr1的紫杉醇耐藥性細胞進行tsp1給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后，紫杉醇的藥效又得到了很人程度提高8。腫瘤干細胞(cancer stem cells, cscs)是腫瘤控制與有效治療（包括放療與化療）的重要阻礙因素9, 10】。己被廣泛 認為的鼻咽癌中cscs的一個重要標志物為cd4411, cd44是一種i型跨膜糖蛋 閂，主要在間質(zhì)與神經(jīng)外胚層組織中的幾種類型細胞內(nèi)被表達。cd44是一種重 要的功能粘性蛋白，也是透明質(zhì)院（ha，hyaluronan）最主要的的受體分子12。 腫瘤的一系列生物學行為都涉及到cd44與ha的結(jié)合作用，包括腫瘤的

16、惡化、 轉(zhuǎn)移與擴散13。進一步的研究表明，cd44在鼻咽癌病變過程中起的重要作用也 為開發(fā)有效的鼻咽癌治療方法提供了新的思路14, 15?；蚰退幠孓D(zhuǎn)是針對腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)一種新開發(fā)的技術(shù)，包括rna干擾逆轉(zhuǎn)、 癌基因工程瘤苗、核酸酶逆轉(zhuǎn)以及抗癌基因的倒入技術(shù)等。其中rna干擾（rnainterference, rnai）技術(shù)在腫瘤的治療與耐藥逆轉(zhuǎn)中已得到了大量的應用。 rnai是用rna分子來抑制某種基因表達的一個生物學過程。常用同源性的、結(jié) 構(gòu)高度保守的雙鏈rna特異性地使靶體mrna降解,達到沉默相應基因的0的。 該技術(shù)具有遺傳性、高效與高特異性、經(jīng)濟操作簡便等特點，在基因疾病與腫瘤 治療方

17、面得到了有效的應用。最近有大量的研宄結(jié)果表明，rnai技術(shù)在逆轉(zhuǎn)腫 瘤mdr耐藥性方面也取得了顯著的成效。腫瘤細胞耐藥性是阻礙化療藥物發(fā)揮功效的主要原因。其耐藥性的及吋監(jiān)測 與耐藥性的逆轉(zhuǎn)將會有效地提高癌癥的治療效果。本研宄以人鼻咽癌親本細胞（hne-2、cne-1和5-8f）以及人鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞（hne-2/taxol、cne-l/taxol 和5-8f/taxol）為研究對象，用rt-pcr方法檢測txr1與cd44基因。并揭示出其 與腫瘤細胞耐藥性的關(guān)系，為耐藥性的監(jiān)測提供奮效參數(shù)依據(jù)。篩選利用sirna 來抑制txr1與cd44基因，并檢測rna干擾后細胞的txr1與cd44基因

18、表達水 平的變化，并進一步通過細胞毒性實驗考察細胞對紫杉醇藥物的敏感性。1材料和方法 1.1材料實驗用到的三株鼻咽癌親本細胞有三種hne-2、cne-1、5-8f,均由中南大學 湘雅醫(yī)學院提供，相應的三種細胞的紫杉醇耐藥細胞系hne-2/taxol、cne-1 / taxol、5-8f / taxol由本實驗室誘導得到。rpmi-1640培基購自美國hycolon公司,紫杉醇（paclitaxol）注射劑購自北 京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司，txr1、β-actin引物購自生工生物工程（上 海）有限公司，ip細胞裂解液購自中國碧云天生物技術(shù)研究院，thunderbirdsybr

19、 qpcr mix與revertra ace qpcr rt kit試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技奮 限公司，gene amp pcr system 9700 購自美國 applied biosystems, mastercyler gradient型pcr擴增儀購自德國eppendof公司。1.2方法1.2.1人鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞中txr1與cd44基因rna干擾 sirnaoligo 序列為，txr1-22 正義鏈：5’gcggccacauaauuaccaatt3’； txr1-22 反義鏈：5’uugguaauuaugugg

20、ccgctt3’； cd44-3980 正義鏈： 5’gatccctttttggat 3’； cd44-3980 反義鏈：5’ag ctat cca a a a ag g 3’； negative 正義鏈： 5’uucuccgaacgugucacgutt3’； control 反義鏈： 5’acgugacacguucggagaatt3&rsquo；o 轉(zhuǎn)染的載體為陽離子脂質(zhì)體 （lipofectaminetm2000），核酸為靶

21、向txr1或cd44基因的sirna，轉(zhuǎn)染細胞為 人鼻咽癌紫紫杉醇耐藥細胞:hne-2/taxol、cne-1/taxol和5-8f/taxol。用pbs溶 液對六孔板進行洗滌（3次）后，除去洗滌液，小心甩干六孔板；再向六孔板孔 中加入opti-mem細胞培養(yǎng)液（800μl），在培養(yǎng)箱中培育30 min;配置轉(zhuǎn)染 液前體溶液：（溶液 a 為 4 μlsirna（取自 txr1-22、cd44-3980、depc、negative control中的一種）與100 μl opti-mem細胞培養(yǎng)液混合得到，其中negative control為陰性對照組

22、;溶液b由up2000 （8 ul）與opti-mem細胞培養(yǎng)液（100 μl）混合得到）；將a液與b液混合、靜置20 min后得到轉(zhuǎn)染溶液，將轉(zhuǎn)染 溶液加入六孔板中，搖勻，在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)（37 oc, 5%co2）,培養(yǎng)6h后 倒掉培養(yǎng)基，換上rpmi-1640培養(yǎng)液；24 h后對細胞換液，用pbs溶液對六孔板 進行洗滌（3次），并加入含血清培養(yǎng)液（iml）,直到細胞長滿，在24-48 h內(nèi) 根據(jù)細胞狀態(tài)收取細胞；實驗分組（空白對照組：4μl的溶液a （depc水）+ 8μl 的溶液 b; nc 照組：4 μl 的溶液 a (neg

23、ative control 液)+ 8 μl 的溶液 b; sirna 轉(zhuǎn)染組：4μl 的溶液 a (txr1-22 或 cd44-3980) +48μl的溶液b。)pcr檢測sirna轉(zhuǎn)染后細胞的txr1與cd44基因表達轉(zhuǎn)然后用rna抽提試劑盒(total rna kit ii)抽提細胞的總rna,紫外分光 光度儀定量。去3 μg總rna進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應體系為20 μl。不冏 引物進行pcr反應，pcr引物序列設(shè)計為，txr1：正義鏈：5’gctttcttc attttcttctg3&rs

24、quo;,反義鏈：5’gttcc aatcctgccca3’，pcr if' 增產(chǎn)物長度為280 bp; β-actin：正義鏈:5’ggacctgactgactacctc3’,反義鏈：5’tcatactcctgcttgctg3’, pcr 擴增產(chǎn)物長度為 540 bp； cd44-t7： 正義鏈：5’caaggtcgggcaggaagag3’,反義鏈： 5’taatacgactcactat

25、aggg3’，pcr 擴增產(chǎn)物長度為 320 bp。擴增 反應步驟為：將樣品置于熒光定量pcr儀上，預變性1 min (95 oc)；變性30s (95 oc)；退火30s(55oc),延伸30s(72oc),進行40個循環(huán)；繼續(xù)延伸10 min (72 oc)；退火 15 s (60 oc);變性 15 s (95 oc)。反應結(jié)束后，低溫(4oc) 保存。以β-actin樣品為內(nèi)參比，根據(jù)擴增曲線得到相應樣品的ct值， δct為待測基因與內(nèi)參β-actin基因ct的差值。待測細胞中的txr1或 cd44基因的mrn

26、a相對表達量為2-δct。1.2.3細胞集落形成實驗實驗分為空白組、陰性對照組、sirna干擾組，分別為，空白組：不經(jīng)rna 處理的cnel/taxol耐藥細胞；陰性對照組：用等濃度的陰性sirna和lip2000處 理的cnel/taxol耐藥細胞;sirna干擾組：用等濃度cd44-3980sirna或txrlsirna 和lip2000處理的cnel/taxol耐藥細胞。取轉(zhuǎn)染并培育24 h后的細胞進行消化分散處理；細胞計數(shù)：用計數(shù)板分別 對不同組細胞進行計數(shù)，并通過加入培養(yǎng)基來調(diào)控細胞的濃度；細胞種板：將 96孔板分成不同的部分，分別植入不同組群細胞，并使開始時細胞

27、的數(shù)量保持一致，再將96孔板置于培養(yǎng)箱中過夜(37 oc，5%co2)；加藥：在上述96孔板 不同組群中，分別加入不同濃度的紫杉醇(0, 5, 10, 15, 20 ng/l),置于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24h (37 oc, 5%co2),然后用pbs液洗滌96孔板三次，再向各孔加 入含血清的1640培養(yǎng)基(iml),最后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；染色：待96孔板中出 現(xiàn)可見細胞克隆吋終止培養(yǎng)，除去舊培養(yǎng)液用d-hank&rsqu0;s液洗滌兩次，空 氣干燥后，加入甲醇固定30min，除去甲醇，加入giemsa染色液浸泡30 min， 用流水洗掉染液，空氣中干燥；計數(shù)：分別統(tǒng)計不同組群中細胞的集落數(shù)。

28、細胞集落抑制率的計算公式如下：集落形成率=集落數(shù)目/接種細胞數(shù)×100%集落抑制率=(1-實驗組集落形成率/對照組集落形成率)×100%藥物半數(shù)-致濃度ic50的計算：以藥物不同濃度對細胞集落抑制率作圖，可得到劑量反應曲線，將得到的曲 線進行線性擬合，根據(jù)線性冋歸方程便可求出藥物的ic50值。1.2.4統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以(m±sd)表示，即平均數(shù)數(shù)±標準差。選擇t檢驗的 統(tǒng)計學方法，p<0.05認為兩樣本差異有統(tǒng)計學意義，p<0.05則認為差異有 極顯著的統(tǒng)計學意義2結(jié)果2.1txrl

29、-sirna干擾npc紫杉醇耐藥細胞后txr1與cd44基因的表達2.1.1 txrl-sirna干擾npc紫杉醇耐藥細胞后txr1基因的表達將空白以及txrl-sirna、negative control干擾的npc紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-1/taxol 和 5-8f/taxol)培養(yǎng) 24 h 后，對細胞內(nèi)的總 rna 進行提取，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，分別利用txr1與cd44基因的引物進行pcr擴 增。根據(jù)目標基因與參比基因的擴增結(jié)果與2-δct方法處理便可得到txr1 基因在npc細胞以及npc紫杉醇耐藥細胞中的表達差異情況(圖1)。結(jié)果顯

30、示 txrl-sirna干擾后，txr1基因在細胞表達水平低于空白組與nc組，且差異均有 統(tǒng)計學意義(p < 0.05)otxrl-sirna干擾后npc紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-1/taxol和5-8f/taxol)中txr1基因的表達水平分別為相應未經(jīng)sirna處理的的 0.368±0.026、0.373±0.027、0.355±0.08 倍(見表 1)。圖1 txrl-sirna對鼻咽癌耐藥細胞中txr1 mrna表達的影響。耐藥細胞株 分別為hne-2/taxol、cne-1/taxo

31、l和5-8f/taxol (結(jié)果進行了歸一化處理，設(shè)定未轉(zhuǎn)染的耐藥細胞txr1 mrna的表達量為1)。2.1.2 txrl-sirna干擾npc紫杉醇耐藥細胞后cd44基因的表達 對上述txrl-sirna干擾后的細胞，提取總rna、逆轉(zhuǎn)錄合成cdna后，real timert-pcr檢測txr1表達的同時，利用cd44基因的引物進行pcr擴增，檢測cd44 mrna表達水平。根據(jù)0標基因與參比基因的擴增結(jié)果與2-δct方法處理便 可得到cd44基因在npc細胞以及npc紫杉醇耐藥細胞中的表達差異情況。結(jié)果 顯示txrl-sirna干擾后，cd44基因在細胞表達水平也低于

32、空白組與nc組，且 差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。txrl-sirna干擾后npc紫杉醇耐藥細胞 (hne-2/taxol cne-1/taxol和5-8f/taxol)中cd44基因的表達水平分別為相應 未經(jīng) sirna 處理的 0.434±0.053、0.650±0.047、0.649±0.014 倍(見表2)。2.2 cd44-sirna干擾npc紫杉醇耐藥細胞后txr1與cd44基因的表達2.2.1 cd44-sirna干擾npc紫杉醇耐藥細胞后txr1基因的表達將空白以及cd44-sirna、nega

33、tive control干擾的npc紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-1/taxol 和 5-8f/taxol)培養(yǎng) 24 h 后。提取總 rna、逆轉(zhuǎn)錄合成cdna,利用txr1基因的引物進行pcr擴增。根據(jù)b標基因與參比基因的擴增結(jié)果與2-δct方法處理便可得到txr1基因在npc紫杉醇耐藥細胞中的表達差異情況。結(jié)果顯示cd44-sirna干擾后，txr1基因在細胞表達水平低于空白組與nc組，且差異均有統(tǒng)計學意義(p< 0.05)c cd44干擾后npc紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-1/taxol和5-8f/taxol)中t

34、xr1基因的表達水平分別為相應未經(jīng) sirna 處理的 0.541±0.040、0.550±0.010、 0.553±0.026 倍（見表 3）。2.2.2 cd44-sirna干擾npc紫杉醇耐藥細胞后cd44基因的表達 述cd44-sirna干擾后的總rna被逆轉(zhuǎn)錄合成cdna,檢測txrl表達的同吋，檢測了 cd44mrna表達水平。根據(jù)0標基因與參比基因的擴增結(jié)果與2-δct 方法處理便可得到cd44基因在npc細胞以及npc紫杉醇耐藥細胞中的表達差異 情況。結(jié)果顯示cd44-sirna干擾后，cd4

35、4基因在細胞表達水平低于空白組與 nc組，且差異均冇統(tǒng)計學意義(p<0.05)o cd44干擾后npc紫杉醇耐藥細胞 (hne-2/taxol、cne-1/taxol和5-8f/taxol)中cd44基因的表達水平分別為相應 未經(jīng) sirna 處理的的 0.406±0.041、0.319±0.018、0.393±0.014 倍(見表 4)。2.3 txr1及cd44基因表達抑制前后npc紫杉醇耐藥細胞對紫杉醇耐藥性的變化2.3.1 txrl-sirna干擾后npc紫杉醇耐藥細胞對紫杉醇耐藥性的變化 集落形成實驗檢測

36、txrl-sirna轉(zhuǎn)染前、后npc紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-1/taxol和5-8f/taxol)對紫杉醇的敏感性的變化(如圖3-9所示)。集落抑制 率=(1-實驗組集落形成率/對照組集落形成率)×100%,并通過擬合劑量 反應曲線求出ic50值?？瞻捉M、脂質(zhì)體組、陰性對照組及txrl-sirna干擾組分 別用紫杉醇進行處理24 h后，換培基后，繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，觀察集落形成。結(jié) 果顯示 txrl-sirna 轉(zhuǎn)染 hne-2/taxol、cne-1/taxol 和 5-8f/taxol 細胞后，對紫杉 醇的敏感性顯著增強(p<0.0

37、01)。其ic50值分別為5.41±0.40、 6.41±0.09 和 5.70±0.27 ng/ml；而空白組的 ic50 值分別為 11.2±0.5、12.2±0.2 和 10.2±0.30 ng/ml；脂質(zhì)體組 ic50 值分別為 10.9±0.3、11.2±0.4 和 11.8±0.8 ng/ml。表明 txr1 的表達降低，部分逆轉(zhuǎn)了 npc對紫杉醇的耐藥性。結(jié)果如圖2與表所示。圖2txr

38、l-sirna轉(zhuǎn)染前后不冋紫杉醇耐藥細胞（hne-2/taxol （a圖）； cne-l/taxol （b圖）和5-8f/taxol （c圖）對紫杉醇的相應變化。a:干擾組b: 陰性對照組c:脂質(zhì)體組2.3.2 cd44-sirna干擾后npc紫杉醇耐藥細胞對紫杉醇耐藥性的變化 應用集落形成實驗檢測cd44-sirna轉(zhuǎn)染hne-2/taxol、cne-1/taxol和5-8f/taxol細胞前后，細胞對紫杉醇的敏感性的變化。結(jié)果顯示cd44-sirna轉(zhuǎn)染 hne-2/taxol cne-l/taxol 5-8f/taxol后，細胞對紫杉醇的敏感性有所增高，其 ic50 值分別為 6.57&

39、amp;plusmn;0.38、6.81±0.19 和 7.34±0.33 ng/ml； 而空白組的 ic50值分別為 11.0±0.6、12.4±0.2 和 10.5±0.8； 脂質(zhì)體組 ic50 值分別為 10.3±0.6、11.5±0.2 和 11.5±0.7。 結(jié)果如圖3與6所示所示。圖3cd44-sirna轉(zhuǎn)染前后不m紫杉醇耐藥細胞（hne-2/taxol （a圖）； cne-l/taxol （b圖）和5-8f

40、/taxol （c圖）對紫杉醇的相砬變化。a:干擾組b: 陰性對照組c:脂質(zhì)體組3討論1998年，andrew fire等人在nature正刊上報道了一項有效且特異性較強的 雙鏈rna干擾方法16,即后來被成為rnai （rna interference, rna干擾）。其 主要表現(xiàn)為dsrna（double stranded rna,雙鏈rna）介導特異性降解同源mrna, 使得信使rna的量減少，導致轉(zhuǎn)錄后出現(xiàn)基因沉默的現(xiàn)象（ptgs, post transcriptional gene silencing） 17。rna干擾的現(xiàn)象幾乎存于包括人類的所有真 核生物的體內(nèi)，如真菌、植物、昆蟲

41、、魚類、蛙類、哺乳動物等18。rnai技術(shù) 是指外源dsrna被系列rnaiii核酸酶切割成片段小分子干擾rna （sirna, small interfering）o新生成的sirna能進一步與細胞內(nèi)的內(nèi)切酶結(jié)合形成誘導沉默復合物(risc, rna-induced silencing complex)。risc 會與同源 mrna 結(jié)合，并對目標 mrna進行特異性的降解，從而沉默0標基因19, 20】。與蘇它相關(guān)基因相比， rna干擾技術(shù)具冇鮮明的特點與顯著的優(yōu)勢，其操作簡便、特異性與穩(wěn)定性好。 rna干擾技術(shù)在腫瘤化療與放療耐藥逆轉(zhuǎn)中的研究也得到了廣泛的開展，通過 sirna抑制腫瘤中

42、mdr基因的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的耐藥性出現(xiàn)了顯著降低。 研究者們希望通過rnai技術(shù)實現(xiàn)腫瘤以及腫瘤耐藥細胞相關(guān)基因的沉默，可以 提高相關(guān)藥物對腫瘤的治療效果21，22。本課題主要以txr1與cd44基因為考察對象，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將sirna txr1-22及cd44-3980轉(zhuǎn)染至npc紫杉醇耐藥細胞系中，并對轉(zhuǎn)染后細胞中txr1 與cd44基因表達量的變化進行了測定。結(jié)果顯示sirna對基因的表達有明顯的 抑制效果。txrl-sirna干擾后npc紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxok cne-1/taxol 和5-8f/taxol)中txr1基因的表達水平顯著降低，同吋這些耐藥細胞的c

43、d44基 因的表達水平也顯著降低。進一步使用cd44-sirna干擾這些細胞系后，在cd44 表達下降的同時，txr1表達也顯著降低。這一結(jié)果表明，在鼻咽癌細胞中cd44 與txr1具冇明顯的功能上相互作用，它們很可能處于同一信號通路上，由于cd44 為跨膜蛋白，我們可以假定cd44-txr1/tspl信號通路可能與鼻咽癌紫杉醇耐藥 密切相關(guān)。為了進一步考察sirna干擾與npc細胞耐藥性的關(guān)系，以及npc紫杉醇耐 藥細胞的耐藥性能否被逆轉(zhuǎn)，我們通過細胞集落形成實驗檢測了 sirna轉(zhuǎn)染前、 后npc紫杉醇耐藥細胞系對紫杉醇的響應性的變化。結(jié)果顯示sirna轉(zhuǎn)染后的細 胞耐藥性較為轉(zhuǎn)染細胞的耐

44、藥性冇明顯地降低。txrl-sirna干擾后npc紫杉醇 耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-1/taxol 和 5-8f/taxol)的 ic50 值分別為: 5.41±0.40、6.41±0.09 和 5.70±0.27 ng/ml；相應的空白組 與脂質(zhì)體組的分別為：(11.2±0.5、12.2±0.2 和 10.2±0.30 ng/ml)與(10.9±0.3、11.2±0.4 和 11.8&plusm

45、n;0.8 ng/ml)。cd44 基因 sirna 干擾后 npc 紫杉醇耐藥細胞(hne-2/taxol、cne-l/taxol 和 5-8f/taxol) 的 ic50 值分別為:6.57±0.38、6.81±0.19 和 7.34±0.33 ng/ml;相應的空白組與脂質(zhì)體組的分別為：(11.2±0.5、12.2±0.2 和 10.2±0.30 ng/ml)與(10.9±0.3、11.2±0.4 和 11.8&a

46、mp;plusmn;0.8 ng/ml)。上述數(shù)據(jù)證明txr1與cd44基因的過量表達與細胞的耐藥性有密切的關(guān)聯(lián)。通過rna干擾沉默抑制txr1或cd44基因的表達均能奮 效逆轉(zhuǎn)npc紫杉醇耐藥細胞的耐藥性，這為后面txr1以及cd44基因?qū)pc細 胞紫杉醇耐藥機理的深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。4結(jié)論本研宄通過txrl-sirna轉(zhuǎn)染能奮效抑制npc紫杉醇耐藥細胞中txr1與cd44 基因的表達，£l cd44-sirna轉(zhuǎn)染也能冇效抑制npc紫杉醇耐藥細胞中txr1與 cd44基因的表達。表明cd44與txrl的表達具有潛在的交互作用，這種交互作 用可能對鼻咽癌細胞紫杉醇耐藥具有調(diào)

47、節(jié)作用。通過txrl-sirna及cd44-sirna 干擾鼻咽癌耐藥細胞，其紫杉醇耐藥性可得到部分逆轉(zhuǎn)，故txr1與cd44基因 可能成為鼻咽癌耐藥逆轉(zhuǎn)的潛在靶點。參考文獻：1 zhang l，chen qy，liu h et al.emerging treatment options for nasopharyngeal carcinoma j.drug design development and therapy, 2013，7：37-52.2 lee awm, foo w，law sck et a i.total biological effect on late reactive t

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