常見(jiàn)化學(xué)發(fā)光技術(shù)3

1、現(xiàn)代免疫分析技術(shù)及展望現(xiàn)代免疫分析技術(shù)及展望湖北省臨床檢驗(yàn)中心湖北省臨床檢驗(yàn)中心黃黃 鵬鵬不適當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)限及分組方法不適當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)限及分組方法對(duì)能力驗(yàn)證對(duì)能力驗(yàn)證/ /室間質(zhì)評(píng)結(jié)果所造成的影響室間質(zhì)評(píng)結(jié)果所造成的影響（以腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)為例，適合內(nèi)分泌檢測(cè)）（以腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)為例，適合內(nèi)分泌檢測(cè)） 一、湖北省腫瘤標(biāo)志物能力驗(yàn)證一、湖北省腫瘤標(biāo)志物能力驗(yàn)證/ /室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)指室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)指定值（靶值）確定進(jìn)程定值（靶值）確定進(jìn)程 自自20072007年始，依年始，依北京科臨易檢軟件公司北京科臨易檢軟件公司提供的室間質(zhì)評(píng)軟件，提供的室間質(zhì)評(píng)軟件，借鑒借鑒部臨檢中心對(duì)腫瘤標(biāo)志物采用的相關(guān)評(píng)價(jià)方法部臨檢中心

2、對(duì)腫瘤標(biāo)志物采用的相關(guān)評(píng)價(jià)方法，在指定值（靶，在指定值（靶值）確定上經(jīng)歷了如下進(jìn)程：值）確定上經(jīng)歷了如下進(jìn)程： 二、不同類(lèi)型檢測(cè)試劑盒、儀器及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法二、不同類(lèi)型檢測(cè)試劑盒、儀器及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法分組統(tǒng)計(jì)結(jié)果間的比較分組統(tǒng)計(jì)結(jié)果間的比較 三、湖北省腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)三、湖北省腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)能力驗(yàn)證能力驗(yàn)證/ /室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)指定值（靶值）確定的發(fā)展趨勢(shì)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)指定值（靶值）確定的發(fā)展趨勢(shì) 對(duì)現(xiàn)代免疫分析技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性回顧尤為必要對(duì)現(xiàn)代免疫分析技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性回顧尤為必要 （一）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAELISA） 1 1、待檢標(biāo)本（、待檢標(biāo)本（抗體或抗原抗體或抗原）與）與

3、酶標(biāo)記抗原或抗體酶標(biāo)記抗原或抗體按一定按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異免疫反應(yīng)；程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異免疫反應(yīng)； 2 2、反應(yīng)終止時(shí)，固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合，與、反應(yīng)終止時(shí)，固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合，與待檢抗體或抗原量成一定比例；待檢抗體或抗原量成一定比例； 3 3、加酶反應(yīng)底物后，底物可在酶作用下出現(xiàn)、加酶反應(yīng)底物后，底物可在酶作用下出現(xiàn)顏色反應(yīng)顏色反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。 ELISAELISA方法方法: : 既特異又敏感。既特異又敏感。 應(yīng)用此技術(shù)的自動(dòng)化儀器設(shè)備

4、包括：應(yīng)用此技術(shù)的自動(dòng)化儀器設(shè)備包括： 羅氏公司羅氏公司: : ES300ES300、 Cobas CoreCobas Core（IIII） Bio-Rad Bio-Rad 公司：公司： CODACODA、EVOLISEVOLIS （三）（三） 酶促放大時(shí)間分辨熒光免疫分析酶促放大時(shí)間分辨熒光免疫分析（EATRF IAEATRF IA） 引入了時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，有利于排除特異熒光的引入了時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，有利于排除特異熒光的干擾，并經(jīng)酶促信號(hào)放大，增強(qiáng)了測(cè)量的特異性。干擾，并經(jīng)酶促信號(hào)放大，增強(qiáng)了測(cè)量的特異性。 見(jiàn)于美國(guó)見(jiàn)于美國(guó) M D M D 公司公司（Molecular Devic

5、es CorporationMolecular Devices Corporation）的）的SPECTRA max GEMINI XSSPECTRA max GEMINI XS。 （一）（一） 透射濁度法（透射濁度法（TurbidimetryTurbidimetry） 1 1、抗原抗體復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變；、抗原抗體復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變； 2 2、光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液，被復(fù)合物微粒吸、光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液，被復(fù)合物微粒吸收；收； 3 3、透射光被吸收的量（吸光度）與免疫復(fù)合物的量呈、透射光被吸收的量（吸光度）與免疫復(fù)合物的量呈正相關(guān)；正相關(guān)； 4 4、測(cè)量透射光強(qiáng)

6、度，與已知濃度的抗原對(duì)照，計(jì)算被、測(cè)量透射光強(qiáng)度，與已知濃度的抗原對(duì)照，計(jì)算被檢測(cè)溶液抗原的含量。檢測(cè)溶液抗原的含量。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：合適的試劑，可在生化分析儀中作全自動(dòng)分析。合適的試劑，可在生化分析儀中作全自動(dòng)分析。 （二）（二） 散射濁度法散射濁度法（NepHelometryNepHelometry） 1 1、一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過(guò)溶液時(shí)遇到抗原、一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過(guò)溶液時(shí)遇到抗原抗體復(fù)合物微粒；抗體復(fù)合物微粒； 2 2、光線被微粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)、光線被微粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物大小、多少密切相關(guān)；射光的波長(zhǎng)和抗原抗

7、體復(fù)合物大小、多少密切相關(guān)； 3 3、散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測(cè)物越、散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測(cè)物越多，形成的復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)；多，形成的復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)； 4 4、儀器通過(guò)微電腦對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)自動(dòng)分析處理，即可得、儀器通過(guò)微電腦對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)自動(dòng)分析處理，即可得知待測(cè)抗原的含量。知待測(cè)抗原的含量。 此原理研發(fā)的全自動(dòng)分析系統(tǒng)有：此原理研發(fā)的全自動(dòng)分析系統(tǒng)有： Beckman-Coulter Beckman-Coulter 公司：公司：ArrayArray和和ImmageImmage SIEMENS SIEMENS的的 BNBN系列產(chǎn)品系列產(chǎn)品 三三 、

8、熒光免疫分析（、熒光免疫分析（FIA） 是抗原是抗原- - 抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合的免抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合的免疫分析技術(shù)。疫分析技術(shù)。 以雙抗夾心法為例：以雙抗夾心法為例： 1 1、首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；、首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體； 2 2、除去未結(jié)合抗體，加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原、除去未結(jié)合抗體，加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物；與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物； 3 3、洗滌除去未結(jié)合物，加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與、洗滌除去未結(jié)合物，加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體抗原特異性

9、結(jié)合，形成抗體- -抗原抗原- -抗體復(fù)合物；抗體復(fù)合物； 4 4、最后根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量。、最后根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量。 普通的熒光檢測(cè)水平能達(dá)到普通的熒光檢測(cè)水平能達(dá)到ng/Lng/L至至mg/Lmg/L。 熒光免疫分析系統(tǒng)（熒光免疫分析系統(tǒng)（FIAFIA系統(tǒng)）的分析技術(shù)包括：系統(tǒng)）的分析技術(shù)包括： 熒光偏振免疫分析熒光偏振免疫分析（FPIAFPIA）；）； 熒光酶免疫分析熒光酶免疫分析（FEIAFEIA）；）； 時(shí)間分辨熒光免疫分析時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIATRFIA）。）。（二）熒光酶免疫分析（二）熒光酶免疫分析（FEIAFEIA） 1 1、利用酶

10、標(biāo)記抗原（或抗體）與待檢抗原（或抗體）反、利用酶標(biāo)記抗原（或抗體）與待檢抗原（或抗體）反應(yīng)；應(yīng)； 2 2、借助、借助酶反應(yīng)熒光底物酶反應(yīng)熒光底物，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定、高效的，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定、高效的熒光物質(zhì)；熒光物質(zhì)； 3 3、通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度確定待檢抗原或抗體的含量、通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度確定待檢抗原或抗體的含量。 代表性儀器為：代表性儀器為： 法國(guó)梅里埃公司的法國(guó)梅里埃公司的VIDASVIDAS全自動(dòng)熒光酶免疫分析系統(tǒng)等。全自動(dòng)熒光酶免疫分析系統(tǒng)等。 五、五、 流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞分析 流式細(xì)胞分析是綜合流式細(xì)胞分析是綜合激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、顯微熒光激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、顯微熒光光度測(cè)定技術(shù)

11、、流體噴射技術(shù)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)多門(mén)學(xué)光度測(cè)定技術(shù)、流體噴射技術(shù)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)多門(mén)學(xué)科科的科學(xué)技術(shù)。的科學(xué)技術(shù)。 流式細(xì)胞儀的原理流式細(xì)胞儀的原理 1 1、采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性、采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；與激發(fā)效率； 2 2、利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，、利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；保證檢測(cè)的靈敏度和特異性； 3 3、用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多、用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，保證檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析的精確個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)

12、分析，保證檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析的精確性。性。 代表的分析儀有：代表的分析儀有： 貝克曼的貝克曼的EPICSEPICS流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 BD BD的的 FACSCaliburFACSCalibur流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 六六 、生物芯片、生物芯片 生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）又稱(chēng)微陣列（）又稱(chēng)微陣列（MicroarrayMicroarray），是），是一種通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)，在固相載體芯片表面構(gòu)一種通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)，在固相載體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)。建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)。 在面積很小（可達(dá)幾個(gè)平方毫米）的固相材料（玻片、在面積很?。蛇_(dá)幾個(gè)

13、平方毫米）的固相材料（玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等）芯片表面，有序地點(diǎn)陣固定排列硅片、金屬片、尼龍膜等）芯片表面，有序地點(diǎn)陣固定排列一定數(shù)量的可尋址分子（一定數(shù)量的可尋址分子（DNADNA、抗體或抗原等蛋白質(zhì)及其他、抗體或抗原等蛋白質(zhì)及其他分子）。分子）。 這些成分與待測(cè)成分及相應(yīng)的標(biāo)記分子結(jié)合或反應(yīng)這些成分與待測(cè)成分及相應(yīng)的標(biāo)記分子結(jié)合或反應(yīng)，結(jié)，結(jié)果以熒光、化學(xué)發(fā)光或酶顯色等指示，果以熒光、化學(xué)發(fā)光或酶顯色等指示，再用掃描儀或再用掃描儀或CCDCCD攝攝像等技術(shù)記錄，像等技術(shù)記錄，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理和分析，最后得到所需要經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理和分析，最后得到所需要的信息。的信息。 生物芯片能夠在短

14、時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，快速準(zhǔn)確生物芯片能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍。 由于生物芯片技術(shù)在疾病篩查和早期診斷上的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)由于生物芯片技術(shù)在疾病篩查和早期診斷上的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的熱點(diǎn)之一。成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的熱點(diǎn)之一。 英國(guó)朗道公司（英國(guó)朗道公司（RANDOXRANDOX）生產(chǎn)的）生產(chǎn)的EVIDENCE180EVIDENCE180全自動(dòng)生物全自動(dòng)生物芯片分析儀，在一張芯片分析儀，在一張9mm9mm2 2的正方形固相載體芯片上，可同時(shí)進(jìn)的正方形固相載體芯片上，可同

15、時(shí)進(jìn)行多種腫瘤標(biāo)志蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子檢測(cè)。行多種腫瘤標(biāo)志蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子檢測(cè)。ImmunoAssayImmunoAssay）。）。生物芯片分析儀生物芯片分析儀七、七、 展望展望 隨著各種免疫技術(shù)及其他科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使得臨床免疫隨著各種免疫技術(shù)及其他科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使得臨床免疫分析向分析向自動(dòng)化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、集成化、微型化、網(wǎng)絡(luò)化、自動(dòng)化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、集成化、微型化、網(wǎng)絡(luò)化、系統(tǒng)化與一體化系統(tǒng)化與一體化，不斷提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度、精密度和速度，不斷提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度、精密度和速度，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果互認(rèn)的方向發(fā)展。促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果互認(rèn)的方向發(fā)展。 隨著免疫檢驗(yàn)的自動(dòng)化，檢驗(yàn)同仁們應(yīng)注重隨著免疫檢驗(yàn)的自