臨床微生物檢測(cè)的基因同源性分析

1、臨床微生物檢測(cè)的基因同源性分析      醫(yī)院感染的流行病學(xué)研究是臨床微生物學(xué)工作者的重要課題，在醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)的研究中，一個(gè)很重要的問題就是如何確定感染途徑和傳播途徑，以采取有效預(yù)防和控制措施，從而防止醫(yī)院感染或者暴發(fā)流行，因此對(duì)微生物鑒定和菌株同源性分析提出了更高的要求。      目前，傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定和同源性分析技術(shù)已不能很好地滿足醫(yī)院感染診斷和流行病學(xué)調(diào)查的需要，從型、亞型、株，甚至分子水平上去認(rèn)識(shí)細(xì)菌變得愈來愈重要了。近年來分子生物學(xué)的理論和技術(shù)在細(xì)菌感染診斷中的滲透

2、和廣泛應(yīng)用，使得細(xì)菌鑒定、耐藥基因的檢測(cè)、分子流行病學(xué)調(diào)查變得更加準(zhǔn)確、簡(jiǎn)潔和快速。細(xì)菌DNA 同源性分析技術(shù)如脈沖場(chǎng)凝膠電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA 探針雜交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析細(xì)菌的主要手段，它在鑒定細(xì)菌感染的爆發(fā)、確定院內(nèi)交叉感染、感染病原菌之間的基因同源性等方面有著重要的作用，本文將對(duì)常用基因同源性分析方法的機(jī)理和過程做簡(jiǎn)要綜述。 一、質(zhì)粒分型(Plasmid profile assay)：1、原理：     質(zhì)粒是可移動(dòng)的染色體外元件，可以自發(fā)丟失或者被宿主穩(wěn)定地獲得

3、，因此流行病學(xué)上相關(guān)的分離菌株有可能表現(xiàn)出不同的質(zhì)粒圖譜。把質(zhì)粒提取出來，進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖電泳分析，就可以知道分離菌株攜帶質(zhì)粒的大小和數(shù)目。2、實(shí)驗(yàn)過程：a.質(zhì)粒抽提；b.0.8%瓊脂糖電泳；c.EB染色、凝膠成像。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：   優(yōu)勢(shì)：         a.步驟比較簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求不高。         b.在評(píng)價(jià)那些從局限的時(shí)間和地點(diǎn)（如一個(gè)醫(yī)院中的急性爆發(fā)）分離出來的

4、菌株非常有效。   缺點(diǎn)：          a.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好。          b.分辨力不高。 二、染色體DNA的限制性內(nèi)切核酸酶分析(Restriction Endonuclease Assay REA)1、原理：    限制性內(nèi)切核酸酶（REA）在特異的核酸識(shí)別序列切割D

5、NA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的數(shù)目和大小是由酶的識(shí)別位點(diǎn)和DNA的組成共同決定的。在傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切核酸酶分析中，人們用含有相對(duì)多的限制性位點(diǎn)的內(nèi)切核酸酶消化細(xì)菌的DNA，這樣就會(huì)得到成百上千條長(zhǎng)度在0.5-50Kb范圍內(nèi)的DNA片段。恒定的電場(chǎng)瓊脂糖電泳，可以根據(jù)分子質(zhì)量的大小將這些DNA片段分開，然后通過EB染色并在紫外燈下觀察其圖譜。同一種的不同分離菌株的DNA序列的變異可造成限制性位點(diǎn)數(shù)目和分布的變化，所以可以導(dǎo)致其REA圖譜出現(xiàn)差異。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.染色體DNA抽提；b.限制性內(nèi)切酶消化DNA（主要是Hind III）；c.0.7%瓊脂糖電泳；d.EB染色、凝

6、膠成像。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：  優(yōu)勢(shì)：        a.實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單。       b.所有的菌株都可以這個(gè)方法來分型。   缺點(diǎn)：       a.REA圖譜包括成百上千條帶，一些條帶可能不能檢測(cè)到，一些條帶可能會(huì)重疊。        b.REA

7、圖譜分析復(fù)雜。       c.分辨力不高。三、染色體DNA的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Eelectrophoresis PFGE)1、原理：    用識(shí)別位點(diǎn)相對(duì)多的酶進(jìn)行REA的一個(gè)重要的局限性，是分析那些大量的、重疊的、分辨力較差的限制性酶切片段構(gòu)成的圖譜相當(dāng)困難。如果用限制性位點(diǎn)相對(duì)少的酶消化細(xì)菌的基因組，那么就可以得到數(shù)量相當(dāng)少但更大的限制性片段，這樣在電泳中，穿過瓊脂糖的電場(chǎng)作周期性的改變，就可以產(chǎn)生一個(gè)有5-20條清晰

8、的分辨較好的圖譜。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.染色體DNA抽提；b.限制性內(nèi)切酶消化DNA（主要是XbaI）；c.凝膠電泳(脈沖場(chǎng)；d.EB染色、凝膠成像；e.軟件分析。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：      優(yōu)勢(shì)：          a.PFGE方法的分辨力和可重復(fù)性都很高，          b.PFGE方法是腸球菌, 腸桿菌和葡萄球菌基因分

9、型的金標(biāo)準(zhǔn)。       缺點(diǎn)：          a.必須使所有的酶和緩沖液都能浸透凝膠塊，準(zhǔn)備合適的DNA樣品需要延長(zhǎng)培育時(shí)間。近來也有報(bào)道葡萄球菌和腸球菌可以用相當(dāng)短的時(shí)間來進(jìn)行PFGE分析。          b.需要昂貴的專業(yè)設(shè)備。四、核糖體分型（Ribotyping）1、原理：   核糖

10、體操縱子包括編碼16SrRNA和25SrRNA以及一種或多種RNA的核苷酸序列。核糖體序列高度保守，針對(duì)大腸桿菌rRNA 制備的探針，或者是克隆的核糖體操縱子，可與許多細(xì)菌的染色體核糖體操縱子雜交，細(xì)菌的基因組中通常有多個(gè)核糖體基因，分別存在于不同長(zhǎng)度的酶切片段中，因此核糖體分型可以得到類似指紋的結(jié)果，因此是可以分型的。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.堿性磷酸酶脫去E.coli rRNA末端磷酸；b.-32PATP末端標(biāo)記上述E.coli rRNA；c.抽提DNA,限制性內(nèi)切酶消化DNA（主要是Hind III）；d.凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；e.用標(biāo)好的rRNA探針進(jìn)行sou

11、ther 印記、放射性自顯影。  3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：   優(yōu)勢(shì)：         a.核糖體序列高度保守, 用大腸桿菌rRNA 制備的探針能對(duì)所有的細(xì)菌進(jìn)行分型。   缺點(diǎn)：        a.分辨力中等。         b.

12、流行病學(xué)上無關(guān)的菌株，有可能有相同的核糖體型圖譜。        c.需要用到放射性同位素，成本很高。        d.實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。   五、限制性內(nèi)切核酸酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP）的核酸雜交分析1、原理：    DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形

13、成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長(zhǎng)度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.裂解細(xì)菌，抽提基因組DNA、pvuII酶消化；b.凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；c.過氧化物酶標(biāo)記過的IS110探針雜交、X-ray 膠片顯影；d. 軟件分析。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：    優(yōu)勢(shì)：        a.能對(duì)所有攜帶與探針同源基因的菌株進(jìn)行分型。 &#

14、160;      b.實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很高。     缺點(diǎn)：        a.樣品用量大、純度要求高。        b.探針設(shè)計(jì)的難度大。        c. RFLP分析技術(shù)步驟繁瑣，工作量大，成本較高。 六、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性D

15、NA(Random Amplified Polymorphic DNA   RAPD-PCR)1、原理：    由于整個(gè)基因組存在眾多反向重復(fù)序列，單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合。使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。引物結(jié)合位點(diǎn)DNA序列的改變以及兩擴(kuò)增位點(diǎn)之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長(zhǎng)度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB染色以檢測(cè)DNA片段的多態(tài)性。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.抽提DNA； b.合成引物， c1. 普通PCR，d1. 

16、;瓊脂糖電泳，e1.凝膠成像；c2. PCR with -35SdATP，d2. 尿素多聚丙烯酰胺凝膠電泳，e2.干膠 X-ray顯影。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：  優(yōu)勢(shì)：       a.分辨力高。  缺點(diǎn)：      a.可重復(fù)性差。      b.圖譜很難解釋。     

17、; c.實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，過程中需要用到同位素。 七、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism  AFLP-PCR）1、原理：    由于不同物種的基因組DNA 大小不同，基因組DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA 片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對(duì)模板DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，

18、只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA 指紋的有無來檢出多態(tài)性。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.裂解細(xì)菌，抽提基因組DNA；b.限制性內(nèi)切酶消化；c.PCR擴(kuò)增；d.毛細(xì)管電泳；e.用ABI-310 Genetic Analyzer分析電泳結(jié)果。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：   優(yōu)勢(shì)：        a.分辨力高。   缺點(diǎn)： 

19、      a.引物需要同位素標(biāo)記。       b.對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求嚴(yán)格。       c.實(shí)驗(yàn)中需要用到毛細(xì)管電泳，一般實(shí)驗(yàn)室不具備此儀器。八、重復(fù)片段PCR（repetitive extragenic palindromic rep-PCR）1、原理：    rep-PCR所使用的引物是以短的基因外重復(fù)序列為基礎(chǔ)的。腸

20、桿菌科成員、一些革蘭氏陽性菌和真菌中，都有這些序列，一般說來，這種序列在細(xì)菌染色體上有許多位點(diǎn)。當(dāng)兩個(gè)序列的距離足夠近時(shí)，那么位點(diǎn)之間的DNA片段將被有效的復(fù)制。因?yàn)橹貜?fù)序列的數(shù)目和位點(diǎn)變化很大，所以不同菌株擴(kuò)增產(chǎn)生重復(fù)片段的大小和數(shù)目也就相應(yīng)的不同。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.抽提基因組DNA； b.合成rep引物、PCR；c.1.5%瓊脂糖電泳；d.軟件分析結(jié)果。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：  優(yōu)勢(shì)：       a.有較好的重復(fù)性。      b.

21、實(shí)驗(yàn)步驟比較簡(jiǎn)單。  缺點(diǎn)：       a.中等的分辨力。       b.該方法的結(jié)果分析是基于Dendron software (Solltech, Inc.,Oakdale, Calif.)軟件分析，一般實(shí)驗(yàn)室很少有此 軟件。九、核苷酸序列分析 （Nucleotide sequence determination）1、原理：  &

22、#160; 在細(xì)菌界中，核糖體的某些學(xué)列高度保守，人們可以設(shè)計(jì)幾乎從任何細(xì)菌都可以擴(kuò)增到核糖體序列的引物。通過測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物以及分析核糖體操縱子相對(duì)變化的區(qū)域，就可以確定感染性微生物的類型。2、實(shí)驗(yàn)流程：a.細(xì)菌基因組DNA抽提；b. PCR擴(kuò)增；c.PCR產(chǎn)物測(cè)序；d.測(cè)序結(jié)果與GeneBank 序列比對(duì)，得出鑒定結(jié)果。3、實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)：    優(yōu)勢(shì)：         a.實(shí)驗(yàn)步驟比較簡(jiǎn)單，結(jié)果容易分析。  

23、60;      b.對(duì)一些難于分型的菌株也能得到很好的結(jié)果。    缺點(diǎn)：          a.代測(cè)菌株必須有足夠的差異序列以保證切實(shí)有效。         b.目前還不清楚單一位點(diǎn)的測(cè)序能否提供可靠的鑒定結(jié)果。隨著越來越多的分子技術(shù)應(yīng)用到醫(yī)院感染的病原菌研究中，為流行病學(xué)調(diào)查和患者的治療提供了快捷準(zhǔn)確的

24、支持。然而，醫(yī)院感染病原菌存在廣泛而迅速的變異，這些變異使得菌株的基因同源性分析資料的解釋變得錯(cuò)綜復(fù)雜。在任何一種分析系統(tǒng)中，一個(gè)單一遺傳事件(如單個(gè)代謝酶的變化或者一條電泳條帶的變化)組成的改變，不足以得出兩個(gè)菌株代表不同菌株的結(jié)論，也就是說它們不一定在流行病學(xué)上無關(guān)。因此，多種分子分析技術(shù)的聯(lián)用，已成為分子流行病學(xué)調(diào)查和臨床微生物診斷的趨勢(shì)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳1984年，Schwartz和Centor發(fā)明了交變脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技術(shù)，與常規(guī)的直流單向電場(chǎng)凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改

25、變后持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。     一、PFGE的基本原理     脈沖電泳分離DNA大分子的介質(zhì)是瓊脂糖，大于20kb的線性DNA雙鏈片段，在瓊脂糖凝膠的網(wǎng)孔中的泳動(dòng)，就像蛇行似的尋找彎曲蜿蜒的孔隙。普通的單方向恒定電場(chǎng)給DNA分子的泳動(dòng)動(dòng)力方向確定且不發(fā)生變化，所以嚴(yán)重影響凝膠電泳分離大分子量DNA片段的效果。    PFGE施加在凝膠上至少有兩個(gè)電場(chǎng)方向，時(shí)間與電流大小也交替改變，使得DNA分子能夠不斷地調(diào)整泳動(dòng)方向，以適應(yīng)凝膠中不

26、規(guī)則的孔隙變化，達(dá)到分離大分子線性DNA的目的，最大分辨率為5000kb大小的線性DNA分子。在交變脈沖電場(chǎng)中，大分子量線性DNA改變泳動(dòng)方向所需時(shí)間比小分子線性DNA要長(zhǎng)，因?yàn)榍罢咦冃文芰Φ陀诤笳摺．?dāng)某一線性DNA在脈沖場(chǎng)中改變形狀調(diào)整方向進(jìn)行遷移所需的時(shí)間大于脈沖場(chǎng)脈沖維持時(shí)間時(shí)，該DNA的遷移速度將減為最低。線性分子改變形狀和泳動(dòng)方向所需時(shí)間與其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差異作為分離不同DNA分子的依據(jù)。當(dāng)DNA分子變形轉(zhuǎn)向所需時(shí)間與脈沖時(shí)間較接近時(shí)，遷移率與DNA分子量成反比。根據(jù)被分離DNA分子的范圍選擇適當(dāng)?shù)拿}沖時(shí)間，經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間不斷變形轉(zhuǎn)向泳動(dòng)，不同大小的DNA就被分離。DNA分子的凈遷移方向與普通電泳一樣，垂直于樣品孔。    影響PFGE分辨率的因素包括幾方面：兩個(gè)脈沖場(chǎng)的均一性；兩個(gè)脈沖場(chǎng)的脈沖時(shí)間以及它們之間的比率；兩個(gè)脈沖場(chǎng)的強(qiáng)度和方向。為了增強(qiáng)PFGE對(duì)大小差異較大的DNA樣品的分辨率，可采用交變脈沖梯度電場(chǎng)，即在電泳過程中，先用較短的交變脈沖時(shí)間使較小的DNA分子分離，然后用較長(zhǎng)的交變脈沖時(shí)間分離