rna的抽提與鑒定

1、rna的抽提與鑒定背景核糖核酸（ribonucleic acid,簡稱rna）是由至少幾十個核糖核背酸通過磷酸二酯鍵 連接而成的一類核酸，因含核糖而得名，簡稱rnao遺傳信息從dna傳遞給rna,再從rna傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻 譯的過程。也可以從dna傳遞給dna,即完成dna的復制過程。這是所有有細胞結(jié)構(gòu)的 生物所遵循的法則。在某些病毒中的rna自我復制（如煙草花葉病毒等）和在某些病毒中能 以rna為模板逆轉(zhuǎn)錄成dna的過程（某些致癌病毒）是対中心法則的補充。三種常見的rna1-mrna信使rna功能：蛋白質(zhì)合成的直接模板2. trna轉(zhuǎn)運rna功能：氨基酸的運載體3. r

2、rna核糖體rna功能：核糖體的組成成分，蛋白質(zhì)的合成場所其他小分子rna1. hnrna核內(nèi)不均一 rna成熟mrna的前提2. snrna核內(nèi)小rna參與hnrna的剪接與轉(zhuǎn)運3. snorna核仁小rna rrna的加工與修飾4.scrna/7sl-rna胞質(zhì)小rna蛋白質(zhì)內(nèi)置為定位合成信號識別體組成成分5.sirna小的干擾rnasirna在rna沉寂通道屮起中心作用，是對特定信使rna（mrna） 進行降解的指導要素實驗原理細胞中的rna可分為信使rna,轉(zhuǎn)運rna和核糖體rna三類，這三種類型的rna都存 在于細胞質(zhì)中，所以從不同組織屮提取的總rna的本質(zhì)就是細胞的裂解，rna的釋

3、放，通 過不同的方式去除蛋白質(zhì)，dna等雜質(zhì)，最終獲得高純度的rna產(chǎn)品工藝。實驗目的1完整rna的提取和純化，是進行rna方面的研究工作，如nothern雜交、mrna分離、rt-pcr、 定量pcr、cdna合成及體外翻譯等的前提。2臨床診斷屮的應用：病毒檢測等rna提取的方法及步驟1提取總核酸，再用氯化鋰將rna沉淀出來。（該方法將導致小分子量rna的丟失，冃前該 方法的使用頻率已很低。）2在酸性條件下抽提，酸性下dna與蛋白質(zhì)進入有機相而rna留在水相，而達到分離rna 的目的。根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下兩種制備方法：1弧鹽法：異硫氤酸弧和硫氤酸肌2 lici/尿素法以肌鹽

4、法最好，對于從那些rnase含量很高的組織（胰臟）中提取rna特別有效，可使rnase 迅速變性，制備的rna有較高翻譯活性。trizol （異硫氤酸肌苯酚法）1由苯酚和硫氤酸肌等配制而成的單相的快速抽提試劑；2可在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持rna的完整性；3在氯仿抽提、離心分離后，rna處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀rna； 4 trizol可以從最少100個細胞或lmg組織屮提取rna。如果細胞量過少或組織來源特異, 可以采用相應試劑盒提取rnaotrizol法的原理1異硫氤酸，卜筑基乙醇，sds裂解細胞2酸性條件（ph4.0）下酚、氯仿抽提，離心,蛋白質(zhì)，dna和脂質(zhì)進入

5、有機相，而rna存在 于水相3界丙醇沉淀水相中的rnatrizol法提取rna操作步驟1. 剪碎的鼠肝中加入trizol試劑，進行機械勻漿，取lml trizol勻漿液于1.5ml離心管內(nèi)， 室溫放置5分鐘，以充分裂解細胞。目的：變性劑充分作用裂解細胞，釋放核酸。2. 每管加入200ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min；注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組 dna斷裂。3. 4°c 12,000rpm 離心 15min；4. 吸取上層水相，至另一離心管中；注：不要吸取中間界面。目的：分離rna、dna、蛋 白質(zhì)等。5. 加入0.5ml異丙醇混勻，室溫放置5-10min；6. 4°

6、;c 12,000g離心lomin,棄上清，rna沉于管底；目的：沉淀rna。異丙醇會奪取大 量rna分子間的水分子，因此rna分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。7. 按lml 75%乙醇/ml trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。（此時可放-70°c 保存）目的：洗滌rna,去除殘余的鹽類等雜質(zhì)。8. 4°c loooorpm離心5min,盡量棄上清。9. 短暫離心收集管壁液體并吸棄。室溫晾干2-3min0注：rna樣品不要過于干燥，否則 很難溶解。10. 用200ul （體積可根據(jù)rna的沉淀量具體調(diào)整）depc處理的h20溶解rna樣品，溶解后 立即

7、置于冰上。注：h2o> te或05%sds均須用depc處理并高壓。簡易tbe電泳觀察rna的完整度1制膠：瓊脂糖凝膠粉（0.7%）,消毒tbe緩沖液，goldview顯色劑2上樣：20ul樣品（含上樣緩沖液）混勻后,加入凝膠孔中；上樣緩沖液（loading buffer）:漠 酚藍、二甲苯青ff、蔗糖，甘油3 電泳：電泳 110v, 15mino4紫外燈下觀察rna質(zhì)量及純度的分析方法一、檢測rna溶液的吸光度260、320、230、280nm的吸光度分別代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)的 水平；純的 rna, 230： 260： 280 = 1： 2： 1；一般od260

8、/od280二1.8-2吋，我們認為rna中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的; 當r<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯；當r>2.2時，說明rna己經(jīng)水解成單核酸了； rna 濃度=od260x40ng/mlx稀釋倍數(shù)。方法二、rna的電泳圖譜檢測28s和18s條帶的完整性和他們的比值，或者是mrna smear的完整性。一般28s 和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28s的亮度在18s條帶的兩 倍以上，我們認為rna的質(zhì)量好。方法三、保溫試驗rna溶液在70°c的恒溫水浴屮保溫1 ho另一份放置在-20°c冰箱屮保存1 h。比較兩 者的電泳條帶，說