實驗蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)ppt課件

1、實驗一、蛋白質(zhì)等電點實驗一、蛋白質(zhì)等電點測定及沉淀反響測定及沉淀反響 一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康? 1、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)2 2、學習測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法、學習測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法3 3、加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定要素的認識、加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定要素的認識4 4、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實意圖義、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實意圖義5 5、了解蛋白量變性與沉淀的關(guān)系、了解蛋白量變性與沉淀的關(guān)系 二、實驗原理二、實驗原理n蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在以蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在以下平衡：下平衡：n蛋白質(zhì)分子的解離形狀和解離程度

2、受溶液的酸蛋白質(zhì)分子的解離形狀和解離程度受溶液的酸堿度影響。堿度影響。n當溶液的當溶液的pHpH為一定值時，蛋白質(zhì)極性基團解離為一定值時，蛋白質(zhì)極性基團解離的正負離子數(shù)相等，凈電荷為的正負離子數(shù)相等，凈電荷為0 0，此溶液的，此溶液的pHpH值值為該蛋白質(zhì)的等電點。為該蛋白質(zhì)的等電點。n不同蛋白質(zhì)具有各自特定的等電點，與該蛋白不同蛋白質(zhì)具有各自特定的等電點，與該蛋白質(zhì)的組成構(gòu)造有關(guān)。質(zhì)的組成構(gòu)造有關(guān)。n在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點。利用性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點。n常用方法：測其溶解度最低時的溶液常用

3、方法：測其溶解度最低時的溶液pHpH值。值。問題：蛋白質(zhì)等電點的測定還有哪些方法問題：蛋白質(zhì)等電點的測定還有哪些方法?n本實驗經(jīng)過察看不同本實驗經(jīng)過察看不同pHpH溶液中酪蛋白的溶解溶液中酪蛋白的溶解度來測定其等電點。度來測定其等電點。n用醋酸與醋酸鈉醋酸鈉混合在酪蛋白溶液用醋酸與醋酸鈉醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中配制各種不同中配制各種不同pHpH值的緩沖液。向各緩沖值的緩沖液。向各緩沖溶液中參與酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖溶液中參與酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的液的pHpH值即為酪蛋白的等電點。值即為酪蛋白的等電點。n在水溶液中，蛋白質(zhì)分子由于外表生成水在水溶液中，蛋白質(zhì)分子由于外表生成水化層

4、和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體。化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體。n在一定的理化要素影響下，蛋白質(zhì)顆?？稍谝欢ǖ睦砘赜绊懴?，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。因失去電荷和脫水而沉淀。n蛋白質(zhì)的沉淀反響可分為兩類。蛋白質(zhì)的沉淀反響可分為兩類。可逆的沉淀反響可逆的沉淀反響 蛋白質(zhì)分子的構(gòu)造尚未發(fā)生顯著變蛋白質(zhì)分子的構(gòu)造尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的要素后，蛋白化，除去引起沉淀的要素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并堅持其天然性質(zhì)而不變性。并堅持其天然性質(zhì)而不變性。如：鹽析作用、低溫下用乙醇丙如：鹽析作用、低溫下用乙醇丙酮短時間作用于蛋白質(zhì)。酮短時間作用

5、于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反響。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反響。問題：提純蛋白質(zhì)時常用的沉淀方法有哪些問題：提純蛋白質(zhì)時常用的沉淀方法有哪些? 不可逆沉淀反響不可逆沉淀反響l蛋白質(zhì)分子內(nèi)部構(gòu)造發(fā)生艱苦改動，蛋白質(zhì)常蛋白質(zhì)分子內(nèi)部構(gòu)造發(fā)生艱苦改動，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。l加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機酸的反響都屬于此類。屬離子或某些有機酸的反響都屬于此類。問題：這些不可逆的沉淀反響有哪些運用問題：這些不可逆的沉淀反響有哪些運用?l蛋白量變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的蛋白量變性

6、后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件依然存在如電荷，并不析出。條件依然存在如電荷，并不析出。l因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。三、試劑器材三、試劑器材1 1、實驗資料、實驗資料 雞蛋清雞蛋清 牛奶牛奶2 2、儀器設(shè)備、儀器設(shè)備 水浴鍋水浴鍋 溫度計溫度計錐形瓶錐形瓶 100mL100mL容量瓶容量瓶吸管吸管試管及試管架試管及試管架 n0.4% 0.4% 酪蛋白乙酸鈉溶液：取酪蛋白乙酸鈉溶液：取20mL20mL牛奶，參與牛奶，參與10mL 1mol/L NaAC,10mL 1mol/L NaAC,用去離

7、子水定容至用去離子水定容至100mL100mLn 1.00 mol/L 1.00 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.10 mol/L 0.10 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.01 mol/L 0.01 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液3 3、試劑、試劑n蛋白質(zhì)溶液：蛋白質(zhì)溶液：5%5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液新穎雞蛋清新穎雞蛋清: :水水=1:9=1:9n0.2M 0.2M 醋酸醋酸- -醋酸鈉緩沖液，醋酸鈉緩沖液，pH4.7 pH4.7 n3%3%硝酸銀溶液硝酸銀溶液n5%5%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液n95%95%乙醇乙醇n飽和硫酸銨溶液：飽和硫酸銨溶液：

8、2525，100mL100mL水水76.7g76.7g硫酸銨硫酸銨n0.1 M0.1 M鹽酸溶液鹽酸溶液n0.1 M0.1 M氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液n0.05 M0.05 M碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液n0.1 M0.1 M醋酸溶液醋酸溶液n甲基紅溶液：甲基紅溶液：pHpH變色范圍為變色范圍為4.4-6.24.4-6.2，由紅變黃，由紅變黃 四、實驗操作四、實驗操作一酪蛋白等電點的測定1 1取取4 4支試管，按下表順序分別參與各試劑，混勻。支試管，按下表順序分別參與各試劑，混勻。試管號試管號蒸餾水蒸餾水mL0.01 M醋酸醋酸mL0. 1 M醋酸醋酸mL1. 0 M醋酸醋酸mL18.40.6-28.

9、7-0.338.0-1.047.4-1.62 2向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL1mL，加一管，搖勻一管。此時加一管，搖勻一管。此時1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH依次為依次為5.95.9、5.55.5、4.74.7、3.53.5。察看其混濁度。靜置。察看其混濁度。靜置1010分鐘分鐘后，再察看其混濁度。最混濁有顆粒沉淀的一后，再察看其混濁度。最混濁有顆粒沉淀的一管管pHpH即為酪蛋白的等電點。即為酪蛋白的等電點。二蛋白質(zhì)沉淀實驗二蛋白質(zhì)沉淀實驗1. 蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)的鹽析n加加5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 mL于試管中，再加等量于試

10、管中，再加等量飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘那么析出飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘那么析出球蛋白的沉淀。球蛋白的沉淀。n離心，取沉淀，加少量水，察看能否溶解。離心，取沉淀，加少量水，察看能否溶解。n離心后上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為離心后上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。止，此時析出的沉淀為清蛋白。n離心，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，察看離心，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，察看沉淀能否重新溶解。沉淀能否重新溶解。2. 重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)取取1支試管，參與蛋白質(zhì)溶液支試管，參與蛋白質(zhì)溶液2 mL，再加，再加3%硝酸銀溶液硝酸銀溶液12

11、滴，振蕩試管，有沉滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。淀產(chǎn)生。離心傾去上清液，向沉淀中參與少量的水，離心傾去上清液，向沉淀中參與少量的水，沉淀能否溶解？為什么？沉淀能否溶解？為什么？ 3有機酸沉淀蛋白質(zhì)有機酸沉淀蛋白質(zhì)取取1支試管，參與蛋白質(zhì)溶液支試管，參與蛋白質(zhì)溶液2 mL，再加，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，察看三氯乙酸溶液，振蕩試管，察看沉淀的生成。沉淀的生成。離心傾去上清液，向沉淀中參與少量水，離心傾去上清液，向沉淀中參與少量水，察看沉淀能否溶解。察看沉淀能否溶解。4有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)取取1支試管，參與支試管，參與2 mL蛋白質(zhì)溶液，再參蛋白質(zhì)溶液，再參與與2 mL

12、95%乙醇?；靹?，察看沉淀的生乙醇?；靹颍炜闯恋淼纳?。成。5乙醇引起的變性與沉淀乙醇引起的變性與沉淀 取取3支試管，編號，依下表順序參與試劑：支試管，編號，依下表順序參與試劑： 試劑試劑 mL 管號管號 5%卵卵清蛋白清蛋白0.1 M氫氧化氫氧化鈉鈉0.1 M鹽酸鹽酸pH4.7緩沖液緩沖液 95%乙乙醇醇 111121113111n振搖混勻后，察看各管有何變化。振搖混勻后，察看各管有何變化。n放置片刻，向各管內(nèi)加水放置片刻，向各管內(nèi)加水8 mL。在。在2、3號管中各加一滴甲基紅，分別用號管中各加一滴甲基紅，分別用0.1 M醋醋酸溶液及酸溶液及0.05 M碳酸鈉溶液中和。察看顏碳酸鈉溶液中和

13、。察看顏色的變化和沉淀的生成。色的變化和沉淀的生成。n每管再加每管再加0.1 M鹽酸溶液數(shù)滴，察看沉淀鹽酸溶液數(shù)滴，察看沉淀的再溶解。的再溶解。n解釋各管發(fā)生的全部景象。解釋各管發(fā)生的全部景象。提示：卵清蛋提示：卵清蛋白等電點白等電點4.7n實驗結(jié)果與分析：實驗結(jié)果與分析：n按照實驗報告要求記錄實驗結(jié)果并分析。按照實驗報告要求記錄實驗結(jié)果并分析。n研討：研討：n經(jīng)過本次實驗，有否對該工程改良的合理建議。經(jīng)過本次實驗，有否對該工程改良的合理建議。 n解釋鹽析、有機溶劑、等電點、重金屬、有機酸沉淀蛋解釋鹽析、有機溶劑、等電點、重金屬、有機酸沉淀蛋白質(zhì)的不同機理。白質(zhì)的不同機理。n查閱資料，引見蛋白

14、質(zhì)等電點的測定方法。查閱資料，引見蛋白質(zhì)等電點的測定方法。n查閱資料，引見生物大分子制備常用的沉淀方法。查閱資料，引見生物大分子制備常用的沉淀方法。n蛋白量變性有哪些方面的運用？蛋白量變性有哪些方面的運用？n大組總結(jié)交流大組總結(jié)交流PPT：n內(nèi)容：實驗結(jié)果與分析，課后研討題，實驗領(lǐng)會等。內(nèi)容：實驗結(jié)果與分析，課后研討題，實驗領(lǐng)會等。五、實驗結(jié)果與報告五、實驗結(jié)果與報告實驗結(jié)果實驗結(jié)果管號管號 pH值值混濁度混濁度 解釋景象解釋景象1234一酪蛋白等電點的測定一酪蛋白等電點的測定二蛋白質(zhì)沉淀實驗二蛋白質(zhì)沉淀實驗 1蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)的鹽析 現(xiàn)現(xiàn) 象象 解解 釋釋蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)溶液中加硫酸銨溶液加硫酸銨溶液加水加水上清液中加硫上清液中加硫酸銨粉末酸銨粉末加水加水2重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)現(xiàn)現(xiàn) 象象解解