氨基酸的分離鑒定(紙層析法)

1、氨基酸的分離鑒定（紙層析法）氨基酸的分離（紙層析法）一、實驗原理1、層析法又稱色譜法，是一種物理的分離方法。利用混合物屮各組 分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配 系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中，并使各組 分以不同速度移動，從而得到有效的分離。操作方式：紙層析、薄層層析、柱層析等分離機理：分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層 析等2、紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，展層溶劑由有機溶劑和水組成。濾紙纖維上的輕基具有親水性，在濾紙上水就被吸附在 纖維素的纖維之間形成固定相。當冇機溶劑（流動相）沿紙流動經過層析 點時，層析

2、法上溶質就在水相和有機相之間不斷進行分配。由于溶質就在 水相和有機相之間不斷進行分配。由于溶質中各組分的分配系數(shù)不同，移 動速率也不同，因而可以彼此分開。分配系數(shù)二溶質在固定相中的濃度溶質在流動相中的濃度物質被分離后在濾紙上的移動速率用?值表示：?=原點到層析點屮心的距離原點到溶劑前沿的距離只耍條件（如溫 度、展層溶劑的組成）不變，？?值是常數(shù)，故可根據(jù)?值作定性依據(jù)。氨基酸無色，利用苗三酮反應，可將氨基酸層析點顯色作定性、定量 用。二、實驗器材標準氨基酸溶液、濾紙、層析缸、保鮮膜、剪刀、毛細管、電吹風。三、實驗試劑1、酸相溶劑:v正丁醇（a.r） ： v88%甲酸：v水=15： 3： 22、

3、顯色貯備液:v（04mol/l苗三酮異丙醇）:v （甲酸）:v （水）=20： 1： 5四、實驗操作1、點樣量取30ml層析溶劑、iml顯色貯備液于層析缸中，混勻密閉，靜置。戴好手套，在桌上鋪好一層保鮮膜。取一張干凈濾紙，將其剪彩為 18cm*14cmo在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線 上等距離分出幾個點作為點樣原點。用毛細管將標準氨基酸和未知樣品分別點在點樣點上，每次點樣后用 電吹風冷風吹干再點下一次，點樣點直徑不超過5mm。2、層析與顯色將濾紙卷成圓筒形，用釘書針固定成圓筒狀，紙的兩邊不能接觸。將濾紙垂直放入盛有展層劑的層析缸中，迅速蓋緊層析缸蓋（點樣點 的一端朝下，

4、展層劑液面需低于點樣線lcm左右）。待溶液前沿線距濾紙末端l-2cm （展層長度10cm,約2h）后，取出 濾紙（需帶上手套），用鉛筆將前沿線作一標記。剪去縫合線，電吹風熱 風吹干（通風櫥中進行），即可看見層析斑點。3、結果處理用鉛筆將層析圖譜上的斑點圈出，分別測量點樣點到層析點中心和點 樣點到層析前沿的距離，計算各種標準氨基酸的rf值，并根據(jù)樣品分離的 情況鑒定混合樣品中氨基酸的組分。五、結果與討論1層析圖譜苯丙氨酸、脯氨酸和組氨酸。樣品層析圖譜中最下方的斑點難以判斷 是組氨酸還是甘氨酸，結合rf值和斑點的形狀與顏色,初步判斷是組氨酸。4、本次層析的結果不好，各標準氨基酸的rf值與參考值相差

5、較大（偏 小），且樣品的層析方向不垂直，斑點的朝向也不一致。如果僅僅是層析 時紙筒沒有放平，也不可能出現(xiàn)斑點朝向不一致的現(xiàn)象。將有層析結果的濾紙放置兩天后，變成了以下情形：圖中顯示，層析溶劑出現(xiàn)了明顯的分層（水相和有機相），可能是因 為層析缸內壁冇較多水，破壞了溶劑的比例。由于正丁醇與水的互溶冇一 定限度，過多的水與有機相無法互溶。到層析后期，有機相大部分到濾紙 上時，水相開始接觸濾紙并向上移動。由于水相的存在切斷了有機相與下 方溶液的通路，有機相無法再向上移動，而水相不斷在擴大其“勢力范圍”。 因為有機相無法繼續(xù)上移，有機相中溶解的氨基酸也無法隨溶液移動，因 此rf值也測不準確。由圖可以看出，層析斑點的形狀與水相和有機相的分界線輪廓匹配, 從而解釋了為何斑點的朝向不一致。因為到層析后期，層析速度慢的氨基酸 只能停留在水相與有機相的交界處。5、實驗總結與改進：1）在做紙層析時，應嚴格保證展層劑各組分的比例，因為rf值與展 層劑的組成密切相關，且比例不對時還可能引起展層劑分層，嚴重影響實 驗結果。2）將紙筒放入層析缸時一定要小心放平，否則層析方向會偏，后續(xù) 測量層析點到原點的距離時容易產生誤差。3）實驗時一定要避免用手直接接觸濾紙，也不要將