生化分析方法(熊)

1、指導老師：張宏姓名：熊昱什么叫生化分析，我們可以這樣理解：用生物、化學的原理和方法，研究生命現(xiàn)象的分析方法。研究生物體的化學組成、代謝、營養(yǎng)、酶功能、遺傳信息傳遞、生物膜、細胞結構及分子病等等，闡明生命現(xiàn)象。 生化分析是進行生命科學研究的一個重要手段，在生物醫(yī)藥研發(fā)、臨床生化診斷、生化產品生產等領域起著越來越重要的作用，是一門理論與實踐相結合的綜合性技術。從早期對生物總體組成的研究。進展到對各種組織和細胞成分的精確分析。目前正在運用諸如光譜分析、同位素標記、x射線衍射、抗原抗體反應、酶交聯(lián)的免疫吸附法、其他物理學、化學技術，對重要的生物大分子（如蛋白質、核酸等）進行分析，以期說明這些生物大分子

2、的多種多樣的功能與它們特定的結構關聯(lián)對不同的對象，有不同的分析方法，要達到不同的目的，也要使用不同的分析方法，因此分析方法也就多種多樣，在這里我就講蛋白質的分析方法概述，拋磚引玉氨基酸蛋白質的分析方法生物體中廣泛存在的一類生物大分子，由核酸編碼的氨基酸之間通過氨基和羧基形成的肽鍵連接而成的肽鏈，經翻譯后加工而生成的具有特定立體結構的、有活性的大分子。泛指某一類蛋白質，與前面的限定詞組成復合詞時，一律用“蛋白質”，如血漿蛋白質、纖維狀蛋白質、酶蛋白質等，此時“質”字不得省略(習慣詞除外，新命名者從此)。凡指具體蛋白質時，“質”字可省略，如血紅蛋白、肌球蛋白等。 蛋白質四聚體蛋白質四聚體(四級結構

3、四級結構)1.氨基酸類藥物分析 藥典中氨基酸含量測定大多應用化學滴定法,只有美國藥典中乙酰半胱氨酸采用高教液相色譜法( hplc ) 。1.1柱前衍生法柱前衍生法是將樣品制成適當?shù)难苌镌龠M行hplc分離，衍生化的結果不僅僅改善了被測物的檢測特性，有時對其色譜分離也有一定的幫助 ，常用 衍生化試劑有鄰苯二 甲醛、羥基琥珀酸亞胺一 吲哚乙酸(siia)、苯氨基硫代甲酰酯(ptc)。有科學家分別用亞硝酸和 n 芘基馬來酰亞胺作為衍生化試劑以紫外和熒光作檢測的反相高效液相法(r phplc) 定量測定人體內乙酰半胱氨酸，獲得到滿意結果。1.2柱后衍生法柱后衍生法是將樣品先經色譜柱分離， 柱后再進行衍

4、生。nozal等將乙酰半胱氨酸經rphplc分離后，用二硫硝基苯酸衍生處理再進行檢測， 同時加入溴化十六烷基三 甲銨陽離子以增強靈敏度，檢測限為0.6g 。得到了滿意的結果1.3其他衍生方式除了以上兩種經典衍生方式外，最近有文獻 “介紹了用于定量分析氨基酸的一種毛細管柱內衍生方法，可在緩沖液中加入衍生劑(online法)， 也可在毛細管前端的衍生室進行反應(sandwich法)，這種方法與柱前衍生法檢測水平相當( 微克級) 此外， 還可用蒸發(fā)光散射檢測器直接檢測非衍生化的氨基酸，配合hplc的分離定量， 檢測限達 納克級 ， 回收率為9 4%2 酶類分析 酶的種類極多， 目前研究發(fā)現(xiàn)的酶已達

5、1300多種，它們都是機體細胞中合成的蛋白質，具有高度的催化作用及選擇性；雖為活體產生，但 自活體提出后 ，仍不失其催化活性個，因此某些酶經提取后，可作 為藥用。 現(xiàn)有藥用酶制劑已達100種， 。 酶類藥物分析基本上還是應用生化反應方法，生化物質為底物，輔以紫外分光光度法 (uv) ，反映酶解反應的程度 ， 測定酶效價。映酶解反應的程度 ， 近年來， 人們嘗試用一些新的生化反應底物使反應更加靈敏和準確 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱sod)是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內超氧陰離子清除劑，保護細胞免受損傷。sod廣泛存在于各類生

6、物體內，所有好氧微生物細胞中都含有sod。自1969年mccord等人首次發(fā)現(xiàn)了sod生物活性后，醫(yī)學界對其醫(yī)療作用做了許多研究，證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用，被專家稱為21世紀最有前途的藥用酶。歐美國家已開始將其應用于醫(yī)療、食品、保健、化妝品等領域?！久富顪y定】在25 4.5ml 50mmoll ph8.3的k2hpo4- kh2po4緩沖液中加入待測sod樣液，再加入10ul 50mmoll的連苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑lcm 的比色杯，在325nm波長下每隔30s測一次a值。同時測定sigma公司的sod標準品，對所測樣品sod活性進行校正?！久富疃x】

7、在1ml反應液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達50時的酶量為一個酶活單位， 即325nm 0.035odmin為一個酶活單位。jones應用硫代氨基甲酰-酪蛋白熒光底物使胰蛋白酶、胃蛋白酶的檢測靈敏度提高了幾十倍；張東裔等以對甲苯磺酰基精氨酸甲酯(tame ) 為底物，以 苯酚紅指示劑在特定波長下光吸收值的變化作為測定胰蛋白酶效價的指標， 相對于藥典中以消耗氫氧化鈉體積為指標，這種方法更加簡便靈敏；此外， 通 過選擇不同的底物和指示劑 ， 此法還 可用于測定其 它蛋白酶的活性 ， 從而建立一 系列以指示劑為基礎的酶活性測定方法。3 蛋白質多肽類藥物分析 ，英文名：（western blott

8、ing ）一種分析和鑒定特定蛋白質的技術。即將混雜的蛋白質經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至固相膜上，再用標記的抗體或二抗與之反應，以顯示膜上特定的蛋白條帶 3.2，簡稱elisa，簡稱elisa。它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。 3.3。一般用制好的單克隆抗體試劑盒來檢測，操作簡單，結果準確3.4，是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化

9、學技術(immunocytochemistry)。3.5熒光光譜法熒光光譜法靈敏度高，復雜組分辨識度好，作為一種常規(guī)的檢測手段在生物傳感方面發(fā)揮著其優(yōu)勢，是定量測定蛋白質的常用方法。常用的幾種方法是內源熒光法、熒光探針法、熒光偏振、時間分辨熒光法及激光誘導時間分辨免疫分析法。3.51內源熒光法是基于蛋白質中存在著酪氨酸和色氨酸，能夠吸收270-300nm的紫外光而發(fā)出紫外熒光發(fā)展起來的61, 62。當測定體系中加入小分子配體(sm)時，sm與蛋白質發(fā)生相互作用，會導致蛋白質熒光的碎滅，利用sm對蛋白質內源熒光的碎滅這一現(xiàn)象可以確定蛋白質與sm的作用類型及其結合部位等。此法比紫外分光光度法靈敏，

10、且核酸的干擾較小，來自其他小分子化合物的干擾也比較小。3.523.53利用熒光體在轉動擴散速度上的差異而導致偏振熒光的差別，建立了熒光偏振測定法。利用熒光偏振我們可以研究:(1)酶與熒光底物的結合程度;(2)蛋白質聚合與解離;(3)蛋白質從螺旋到無規(guī)則卷曲的研究。另外還可得到一些通常由圓二色譜和紫外可見分光光度計得不到的有關蛋白質柔性微區(qū)的信息3.54時間分辨熒光光譜是依據待測組分熒光衰減特性的差異而進行選擇性測定，可以消除瑞利和拉曼散射的干擾，又可以根據熒光壽命的差異對熒光光譜重疊組分進行測定，為復雜體系的熒光測量提供了選擇性基礎。時間分辨一熒光免疫分析以具有較長熒光壽命的熒光基團作為免疫標

11、記，利用時間分辨熒光測量技術進行測定。一方面可以在熒光分子定量中獲得高靈敏度，另一方面可以通過時間分辨技術使選擇性得到改善，這樣就可以定性和定量分析微量蛋白質。3.55在稀土配合物時間分辨熒光光譜和免疫分析的基礎上發(fā)展起來的激光誘導時間分辨免疫分析法在靈敏度、專一性、穩(wěn)定性等方面均可與放射免疫分析相媲美，是超微量蛋白質免疫分析的有力手段，已用于人尿中免疫球蛋白g的測定。 4儀器分析由于科學的發(fā)展，各種物理化學手段的不斷提高，許多科學儀器被制作出來，大量復雜的、精確的操作都有科學儀器來完成4.1生化分析儀光電比色原理來測量體液中某種特定化學成分的儀器。由于其測量速度快、準確性高、消耗試劑量小，現(xiàn)

12、已在各級醫(yī)院、防疫站、計劃生育服務站得到廣泛使用。配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗的效率及收益。4.11 自動是將生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、保溫、比色、結果計算、書寫報告和清理等步驟的部分或全部由模仿手工操作的儀器來完成。它可進行定時法、連續(xù)監(jiān)測法等各種反應類型的分析測定。除了一般的生化項目測定外，有的還可進行激素、免疫球蛋白、血藥濃度等特殊化合物的測定以及酶免疫、熒光免疫等分析方法的應用。它具有快速、簡便、靈敏、準確、標準化、微量等特點 4.12幾種生化分析儀 4.13蛋白質分析全自動凱氏定氮儀（國家發(fā)明專利號zl200710054302.7） 使用世界上領先的顏色傳感器技術判定滴定終點技術，該技術與光電管檢測方式相比具有終點判斷精確、抗干擾能力強、壽命長、無需將滴定系統(tǒng)置于暗室，操作與觀察方便等顯著的優(yōu)點;與電位滴定檢測方式相比具有滴定終點無溫度漂移，無需預熱與校準等明顯優(yōu)勢。 設計嚴謹，選材嚴格，確保測試高精度與高回收率 pc化，網絡化優(yōu)勢，儀器具有rs232接口(標配)與無線藍牙接口(選配)，連接電腦由配套的專用數(shù)據處理軟件自動生成測試信息和全面的檢測報告,并有增強型的計算機控制軟件可供選購.k05a自動定氮儀（專利申請?zhí)?00520000443.7） .采用國標規(guī)定的檢驗方法 .大屏幕lcd顯示屏，人性化操作界面，使用舒適方便 .自動加吸收液、