核酸電泳與檢測(cè)PPT課件

1、 核酸凝膠電泳 用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段 優(yōu)點(diǎn)： 便于分離；便于檢測(cè)；便于回收第1頁(yè)/共53頁(yè)1.基本原理 瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。(1)電荷效應(yīng) 在 pH 值為 8.08.3 時(shí)， DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中,核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。 第2頁(yè)/共53頁(yè)(2)分子篩效應(yīng) 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型。 分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快； 同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，cccDNA

2、IDNAocDNA 第3頁(yè)/共53頁(yè)（3）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)值成反比，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。 第4頁(yè)/共53頁(yè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對(duì)遷移距離推測(cè)待測(cè)定的DNA片段的大小第5頁(yè)/共53頁(yè)如何提高核酸電泳的分辨率？如何提高核酸電泳的分辨率？ 第6頁(yè)/共53頁(yè)（4）凝膠電泳的分辨力與凝膠的類型類型和密度密度相關(guān)一、凝膠類型1.瓊脂糖凝膠的分辨力在0.250Kb之間(20kb);可區(qū)分相差loobp的DNA片段，常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離550

3、0bp的片段;垂直裝置進(jìn)行電泳 效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開(kāi)，能容納相對(duì)大量的DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 第7頁(yè)/共53頁(yè)不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（分子的有效分離范圍（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2二、凝膠的密度第8頁(yè)/共53頁(yè) 可以通過(guò)提高瓊脂糖的濃度減小凝膠孔徑來(lái)提高電泳分辨率。 或者改用聚丙烯酰胺凝膠。 還可以降低跑電泳的電壓，增大跑電泳的時(shí)間等。 如何提高核酸如何提高核酸電泳的分辨率？電泳的分辨率

4、？ 第9頁(yè)/共53頁(yè)2.影響DNA在凝膠中遷移速率的因素： （1）DNA分子的大?。弘p鏈線狀DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)值近似成反比。樣品分子越大，在通過(guò)膠孔時(shí)的摩擦阻滯力越大，泳動(dòng)速度越慢。第10頁(yè)/共53頁(yè)（2）構(gòu)象：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀第11頁(yè)/共53頁(yè)（3） 凝膠濃度：濃度越低，相同核酸分子遷移越快。 凝膠濃度愈低,則凝膠孔徑愈大(但凝膠的強(qiáng)度也愈低)。一般地分子量越大,選用的凝膠濃度應(yīng)越小。 第12頁(yè)/共53頁(yè)（4）電壓:低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用電壓成正比。但隨著電壓上升,不同長(zhǎng)度DNA泳動(dòng)的增加程度不同 ，分辨率會(huì)降低第13頁(yè)/共53頁(yè)（5）離子強(qiáng)度 緩沖液中無(wú)離子時(shí),

5、 DNA幾乎不移動(dòng) 。而在高離子強(qiáng)度下，導(dǎo)電性極高,帶電顆粒泳動(dòng)很快,并產(chǎn)生大量的熱,有時(shí)甚至熔化凝膠或使DNA變性。第14頁(yè)/共53頁(yè) 電泳緩沖液TAE TBE TPE三者區(qū)別（1）緩沖容量：TAE的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化。 TBE和TPE比TAE花費(fèi)貴，但有高得多的緩沖容量。（2）遷移速度：雙鏈線狀DNA片段中TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%，（3）分辨率：對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。 TBE濃溶液長(zhǎng)期貯存會(huì)出現(xiàn)沉淀，為避

6、免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5溶液 第15頁(yè)/共53頁(yè)（5）溴化乙錠 在DNA電泳中,溴化乙錠染料可插入到堿基對(duì)中,從而增加線性及開(kāi)環(huán)DNA的長(zhǎng)度。加溴化乙錠后進(jìn)行電泳,可使DNA的泳動(dòng)速度降低達(dá)15%。第16頁(yè)/共53頁(yè)3.瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。當(dāng)瓊脂糖加熱至90左右,即可熔化形成清亮、透明的液體,待冷至40-45時(shí)則可固化形成凝膠 。第17頁(yè)/共53頁(yè) 基本過(guò)程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時(shí)間后停止電泳 取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保

7、存結(jié)果 注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套第18頁(yè)/共53頁(yè)（1）瓊脂糖凝膠電泳的基本過(guò)程第19頁(yè)/共53頁(yè)第20頁(yè)/共53頁(yè) 上樣緩沖液的三個(gè)作用（1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)（2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程（3）其中的染料在電場(chǎng)中可以預(yù)測(cè)泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。第21頁(yè)/共53頁(yè) 6*上樣緩沖液成分：第22頁(yè)/共53頁(yè)（2）瓊脂糖凝膠中）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測(cè)的檢測(cè) 通過(guò)染色通過(guò)染色, 紫外燈下檢測(cè)。紫外燈下檢測(cè)。 主要有溴化乙錠（主要有溴化乙錠（ethidium bromide, EB）染色）染色法和法和SYBR Gold染色法。

8、染色法。第23頁(yè)/共53頁(yè)凝膠的凝膠的EB染色染色（1）EB被認(rèn)為是一種被認(rèn)為是一種強(qiáng)強(qiáng)致癌物質(zhì)致癌物質(zhì),見(jiàn)光分解。見(jiàn)光分解。（2）EB可用來(lái)檢測(cè)單鏈可用來(lái)檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸或雙鏈核酸第24頁(yè)/共53頁(yè) （3 3）EBEB使用時(shí)的配制、貯存及使用使用時(shí)的配制、貯存及使用 EBEB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的貯存液，于室溫保存在的貯存液，于室溫保存在棕棕色瓶色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5 g/ml0.5 g/ml 。（4）當(dāng)要知道）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無(wú)片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無(wú)EB情情況下電泳，電泳結(jié)束

9、后再用況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。染色。第25頁(yè)/共53頁(yè)EB替代品替代品 SYBR GoldSYBR Gold是一種新型極敏感染料的商品名稱。是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與其與DNADNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號(hào)。大增強(qiáng)熒光信號(hào)。第26頁(yè)/共53頁(yè) sybr-green、sybrgold - 不穩(wěn)定，毒性毒性也很大也很大 goldview -宣稱無(wú)毒,不靈敏,回收連接不好,熒光易猝滅。對(duì)于大片段DNA的染色效果還湊合，但是在對(duì)于500bp以下的片段效果不是很好。 GelRed/GelGreen低毒,效果很強(qiáng)!但價(jià)格昂貴。第

10、27頁(yè)/共53頁(yè)第28頁(yè)/共53頁(yè)（3）結(jié)果分析 提取細(xì)菌基因組電泳圖第29頁(yè)/共53頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中 DNA Ladder的形成PCR產(chǎn)物的電泳第30頁(yè)/共53頁(yè) RNA電泳圖第31頁(yè)/共53頁(yè)4.注意事項(xiàng) 1、溴乙錠(EB)是誘變劑 ，應(yīng)戴乳膠手套。凡是沾污過(guò)溴乙錠的器皿或物品,必須經(jīng)專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。 2、加樣量的多少?zèng)Q定于加樣孔最大容積。加入樣品的體積應(yīng)略少于加樣孔容積。 第32頁(yè)/共53頁(yè)5.常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策DNA帶很淡或無(wú)帶 第33頁(yè)/共53頁(yè) DNA帶拖尾 第34頁(yè)/共53頁(yè)第35頁(yè)/共53頁(yè)第36頁(yè)/共53頁(yè)6.DNA濃度和純度的測(cè)定紫外吸收法、定

11、磷法（1）目測(cè)條帶亮度來(lái)判斷DNA濃度跑膠時(shí)候marker 按說(shuō)明書(shū)的量上樣電泳，電泳完畢后，就可將目的DNA條帶和marker 條帶的亮度做個(gè)大致的比較。 找出兩者最接近亮度的條帶。根據(jù)條帶的亮度、大小大致就可推測(cè)目的DNA的濃度。 在通過(guò)目測(cè)DNA濃度的時(shí)候，最好要把加樣量設(shè)一個(gè)梯度，如果質(zhì)粒的量很濃的話。 第37頁(yè)/共53頁(yè)（2）分光光度法）分光光度法 DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。 波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1g / ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD2600.0

12、2 當(dāng)OD2601時(shí)，dsDNA濃度約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml 寡核苷酸濃度約為30g / ml（由于底物不同有差異第38頁(yè)/共53頁(yè) 當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。 一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算其比值來(lái)衡量樣品的純度。第39頁(yè)/共53頁(yè) 經(jīng)驗(yàn)值： 純DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 純RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0時(shí)表明可能有異

13、硫氰酸殘存） 若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無(wú)法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量，可使用方案二的方法或其他方法進(jìn)行估算。 第40頁(yè)/共53頁(yè)操作步驟操作步驟1、 UV-240紫外分光光度計(jì)開(kāi)機(jī)預(yù)熱10min.2、 用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關(guān)上蓋板。3、 設(shè)定狹縫后校零。4、 將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（DNA5l或RNA4l用TE緩沖液稀釋至1000l）后，記錄編號(hào)和稀釋度。5、 把裝有標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品的比色皿放進(jìn)樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板。6、 設(shè)定紫外光波長(zhǎng)，分別測(cè)定230nm、260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值。7、 計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純

14、度。DNA樣品的濃度（g / l）:OD260稀釋倍數(shù)50/1000RNA樣品的濃度（g / l）：OD260稀釋倍數(shù)40/1000第41頁(yè)/共53頁(yè)（3）溴化乙錠法 溴化乙錠（EB）插入堆積堿基之間。結(jié)合的EB的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于游離EB的熒光產(chǎn)率。熒光強(qiáng)度正比于嵌入溴化乙錠的量。 EB結(jié)合量的多少與DNA的大小和構(gòu)型有關(guān)，對(duì)于單一構(gòu)型的同種DNA樣品來(lái)說(shuō)，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的DNA含量成正比。第42頁(yè)/共53頁(yè) 基本過(guò)程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來(lái)配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格

15、處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 RNA 電 泳第43頁(yè)/共53頁(yè) 如何通過(guò)分析電泳圖譜評(píng)判基因組DNA、質(zhì)粒DNA等的提取物的質(zhì)量？ 為什么我的PCR產(chǎn)物跑電泳時(shí)發(fā)生拖尾？ 解決辦法？第44頁(yè)/共53頁(yè)1.基本原理 瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。(1)電荷效應(yīng) 在 pH 值為 8.08.3 時(shí)， DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中,核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)

16、。 第45頁(yè)/共53頁(yè)(2)分子篩效應(yīng) 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型。 分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快； 同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，cccDNAIDNAocDNA 第46頁(yè)/共53頁(yè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對(duì)遷移距離推測(cè)待測(cè)定的DNA片段的大小第47頁(yè)/共53頁(yè)（2）構(gòu)象：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀第48頁(yè)/共53頁(yè)（5）溴化乙錠 在DNA電泳中,溴化乙錠染料可插入到堿基對(duì)中,從而增加線性及開(kāi)環(huán)DNA的長(zhǎng)度。加溴化乙錠后進(jìn)行電泳,可使DNA的泳動(dòng)速度降低達(dá)15%。第49頁(yè)/共53頁(yè)3.瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線

17、性多糖聚合物。當(dāng)瓊脂糖加熱至90左右,即可熔化形成清亮、透明的液體,待冷至40-45時(shí)則可固化形成凝膠 。第50頁(yè)/共53頁(yè)（2）分光光度法）分光光度法 DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。 波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1g / ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD2600.02 當(dāng)OD2601時(shí)，dsDNA濃度約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml 寡核苷酸濃度約為30g / ml（由于底物不同有差異第51頁(yè)/共53頁(yè)操作步驟操作步驟1、 UV-240紫外分光光度計(jì)開(kāi)機(jī)預(yù)熱10min.2、 用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖