胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代增值培養(yǎng)實驗報告

1、綜合性實驗報告胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織誘導(dǎo)及繼代增殖培養(yǎng)一、實驗原理及目的（一）實驗?zāi)康?1、通過MS培養(yǎng)基母液的配制和保存，掌握配制于保存培養(yǎng)基母液的基本技能。 2、通過MS固體培養(yǎng)基的配制，掌握培養(yǎng)基的制備基本技能。 3、學(xué)會和掌握誘導(dǎo)愈傷組織的基本技術(shù)。 4、初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。 5、初步掌握外植體的消毒技術(shù)。 6、掌握組培室常用的化學(xué)試劑。 7、學(xué)會和掌握愈傷組織繼代培養(yǎng)的基本操作技術(shù)。（二）實驗原理 1、配制培養(yǎng)基時，為了使用方便和用量準確，通常采用母液法進行配制，即將所選培養(yǎng)基配方中各試劑的用量，擴大若干倍后再準確稱量，分別先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用時按比例吸取

2、母液進行稀釋配制即可。 2、在自然情況下，根主要為植物吸收和固定的重要器官，同時，有些植物的根亦具有繁殖的功能。植物根生長快、代謝能力強、變異小，使得其在研究根的營養(yǎng)吸收、生長和代謝的變化規(guī)律、器官分化、形態(tài)建成規(guī)律等方面具有重大的理論與實踐意義。 依據(jù)細胞全能性原理，即指任何具有完整細胞核的細胞（動物、植物等），都擁有形成一個完整個體所必需的全部遺傳信息（DNA）。就胡蘿卜根來說，其肉質(zhì)根細胞同樣具有形成完整再生植株的能力。這種由單個根衍生而來并經(jīng)繼代培養(yǎng)而保存的，在遺傳上具有一致的根的培養(yǎng)物，稱為離體根無性系。利用這些離體根的無性系可以進行器官再生體系、苗木無性系快速繁殖和其他方面的實驗研

3、究。 3、愈傷組織（callus）原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源于植物體任何器官內(nèi)各種組織的活細胞。在植物體的創(chuàng)傷部分，愈傷組織可幫助傷口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的維管組織使砧木與接穗溝通。在植物器官、組織、細胞離體培養(yǎng)時，條件適宜也可以長出愈傷組織。其發(fā)生過程是：外植體的活細胞經(jīng)誘導(dǎo)，恢復(fù)其潛在的全能性，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚毎?，繼而其衍生的細胞分化為薄壁細胞組織而形成愈傷組織。 愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源種類，而是培養(yǎng)條件，其中激素的種類和濃度最為重要。誘導(dǎo)愈傷組織常用的生長素是2,4-D，IAA和NAA，常用

4、的細胞分裂素是KT和6-BA。 愈傷組織形成的過程分為3個時期：誘導(dǎo)期、分裂期和分化期（形成期），愈傷組織的生長是發(fā)生在不與瓊脂培養(yǎng)基接觸的表面。 4、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至PH=5.8左右。由于培養(yǎng)基的PH值直接影響到培養(yǎng)物對離子的吸收，因而過酸或過堿都會對植物材料的生長有很大的影響。此外，PH還影響到瓊脂培養(yǎng)基的凝固情況。所以，當培養(yǎng)基配制好后應(yīng)立即進行PH的調(diào)整。培養(yǎng)基若偏酸時用氫氧化鈉（1mol/L）來調(diào)節(jié)，若過堿就用鹽酸（1mol/L）來調(diào)節(jié)。當PH值高于6.0時，培養(yǎng)基將會變硬；當PH值低于5.0時，瓊脂不能很好地凝固。 5、植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點： 研究材料來源單一，無性系遺傳背景一致

5、； 經(jīng)濟、方便、效率高； 條件可控、誤差?。?生長快、周期短、重復(fù)性強； 可全年試驗或生長。 6、繼代培養(yǎng)是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，營養(yǎng)枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)。實際上就是對來自于外植體所增殖的培養(yǎng)物（包括細胞、組織或其切段）通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分立，進行連續(xù)多代的培養(yǎng)。 將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽、苗、愈傷組織、原球莖或胚狀體等培養(yǎng)物重新分割，接種到新鮮培養(yǎng)基上進一步擴大培養(yǎng)的過程稱為繼代培養(yǎng)，也稱為增殖培養(yǎng)。該過程是植物組織培養(yǎng)中決定繁殖速度快慢、繁殖系數(shù)高低的關(guān)鍵階段。繼代使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說，

6、每次幾乎完全相同。由于培養(yǎng)物在適宜的環(huán)境條件、充足的營養(yǎng)供應(yīng)和生長調(diào)節(jié)劑作用下，排除了其他生物的競爭，繁殖速度大大加快。二、實驗所需儀器設(shè)備及其原理（一）冰箱 用于長期貯存培養(yǎng)基母液、生化試劑及低溫處理材料。 （二）培養(yǎng)箱 用于少量植物材料的培養(yǎng)。有條件的話，還可采用全自動的調(diào)溫、調(diào)濕人工氣候箱來進行植物組織培養(yǎng)和試管苗快繁。 （三）超凈工作臺 超凈工作臺是為植物組織培養(yǎng)提供無菌操作環(huán)境，是最常用、最普及的無菌操作裝置，和無菌室相比，超凈工作臺既方便又舒適，無菌效果又好。 超凈工作臺一般由鼓風(fēng)機、過濾器、操作臺、紫外燈和照明燈等部分組成。它是將空氣過濾后形成無菌的風(fēng)，創(chuàng)造出一個無菌環(huán)境。根據(jù)風(fēng)

7、幕形成的方式，超凈工作臺可分為水平式和垂直式兩種。在一般的植物組織培養(yǎng)中，兩種都可以采用，而進行植物的遺傳轉(zhuǎn)化操作和農(nóng)桿菌、大腸桿菌的接種時，最好采用垂直風(fēng)幕式的超凈工作臺，這樣可以避免細菌在空氣中的擴散。（四）高壓蒸汽滅菌鍋 高壓蒸汽滅菌鍋主要用于培養(yǎng)基、蒸餾水和各種器械的滅菌消毒。高壓滅菌鍋有大型、中型和小型三種。實驗室最常用的是中型立式全自動滅菌鍋和小型便攜式美景，大型臥底式高壓滅菌鍋在大型工廠化植物組織培養(yǎng)上使用。（五）天平 較常用的為普通天平（1/100g、1/10g），在微量元素、植物激素等的稱量時，需要用分析天平（1/10000g）。（六）蒸餾水制備裝置 有蒸餾型和離子交換型兩種

8、。需要時，還可以進行重蒸餾來獲得純度更高的蒸餾水。三、培養(yǎng)基及其機制（一）培養(yǎng)基 是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工培植的養(yǎng)料，一般含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。（二）植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細胞設(shè)計的，其特點是：無機鹽和離子濃度高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，因而使用范圍較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。 MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。其具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需

9、的礦質(zhì)營養(yǎng)，還能加速愈傷組織的生長，由于配方中的離子濃度較高，在配制、貯存和消毒等過程中，即使有些 成分略有出入，也不會打破離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯的成功。MS培養(yǎng)基的無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，不再用添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分。和其它培養(yǎng)基基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的系哦啊酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的顯著特點。 1.配制MS母液培養(yǎng)基 （1）所需儀器 電子天平、燒杯、容量瓶、細口瓶、藥勺、玻璃棒、電爐

10、、量筒、稱量紙、PH試紙、冰箱 （2）所需藥品 NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、KI、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇（維生素B6）、鹽酸硫胺素（維生素B1）、甘氨酸、蒸餾水. 大量元素的配制（CaCl2·2H2O要在最后單獨加入） 用量=放大倍數(shù)×體積×培養(yǎng)基中

11、的濃度 n=20 v=1L母液化合物規(guī)定量（mg/L）擴大倍數(shù)（×20）稱取量（g）培1L培養(yǎng)基所需母液（ml）大量元素母液KNO31900380003850NH4NO316503300033MgSO4·7H2O37074007.4KH2PO417034003.4CaCl2·2H2O44088008.8 依次稱取，分別溶解，依次混合，定容，倒入母液瓶中，貼標簽，放入4冰箱。 微量元素的配制（Fe單獨配制） n=200 v=1L MnSO4·4H2O:22.3g或MnSO4·H2O：16.9g 鐵鹽母液配制n=200 配500ml螯合態(tài)的鐵，混合

12、煮沸，PH=5.86.2（用NaOH溶液調(diào)其PH） 有機物的配制（單一母液） 肌醇（10mg/ml 配250ml） V B1（1mg/ml 配250ml） V B6（1mg/ml 配250ml） 煙酸（1mg/ml 配250ml） 甘氨酸（2mg/ml 配250ml） 生長調(diào)節(jié)物配制 6-BA（1mg/ml 配100ml） 2,4-D（1mg/ml 配100ml） NAA（1mg/ml 配100ml） 注：6-BA先用少量1mol/L HCl溶解，2,4-D和NAA先用少量mol/LnaOH或95酒精溶解。 2.配制胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基）（1）配方： MS基本培養(yǎng)基+2mg

13、/L NAA+0.1 mg/L6-BA+200 mg/L水解酪蛋白+3蔗糖+0.7瓊脂粉 即：大量元素：50ml 微量元素：5 ml 有機物成分：5 ml 鐵鹽：5 ml 2mg/L NAA：2mg(ml) 0.1mg/L 6-BA：0.1mg(ml) 200mg/L水解酪蛋白：200mg 蔗糖：30g 瓊脂：7g 注：由于配制減半，因此上述試劑均減半。 （2）要求：每小組配制500ml，分裝為20瓶，每瓶25ml。 （3）步驟： 瓊脂溶解（3.5g+350ml蒸餾水，加熱煮沸2min以上）； 把蔗糖加入瓊脂溶液中（15g蔗糖）； 把CH加入瓊脂和蔗糖溶液中； 依次量取MS培養(yǎng)基母液及所需生長

14、調(diào)劑物質(zhì)母液于燒杯中，最后加入到相應(yīng)的容器中； PH調(diào)整為6.06.2，并定容到500ml； 培養(yǎng)基分裝、封口； 滅菌（121 1.1kg/cm2 ，15min）； 保存。 3.繼代培養(yǎng)基的配制 MS基本培養(yǎng)基+6-BA+ NAA+2,4-D+C+CH 蔗糖15g；瓊脂3g；大量元素2.5ml；微量元素2.5ml；鐵鹽0.5ml；肌醇5ml；V B1 0.5ml； V B6 0.25ml；煙酸0.25ml；甘氨酸0.5ml；CH 0.1g。 制500ml，分為22瓶，PH為5.8。四、外植體消毒及無菌操作技術(shù)（一）外植體消毒 在離體根培養(yǎng)中，首先芽解決外植體消毒問題，因為在自然條件下，根生長在

15、土壤中，要進行徹底滅菌、消毒。為了消滅這種污染源，在把植物組織接種到培養(yǎng)基上之前必須要進行徹底的表面消毒；內(nèi)部已受到真菌或細菌侵染的組織在組織培養(yǎng)研究中一般都淘汰不用。 胡蘿卜的肉質(zhì)根，其硬度較大，容易操作，可直接用滅菌劑進行處理。用自來水將胡蘿卜沖洗干凈，用解剖刀將其切成幾個小段；用7075的酒精浸泡胡蘿卜2min； 放入0.1HgCl2中浸泡10min； 用無菌水洗4次； 備用：為胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)作準備。（二）無菌操作技術(shù) 無菌操作技術(shù)室用于防止微生物進入實驗室區(qū)內(nèi)的操作技術(shù)。 要求：在進行無菌操作前將界面上的細菌和病毒等微生物殺滅； 操作過程中是界面與外界隔離，避免微生物的侵入。 目

16、前，多數(shù)實驗室都使用各種類型的超凈工作臺進行無菌操作。 步驟： 在實驗之前30min將超凈工作臺的紫外燈打開，進行滅菌。工作人員要避免紫外燈的照射，做實驗時將紫外燈關(guān)閉。 用酒精噴壺或酒精棉將超凈工作臺進行消毒（酒精濃度為70）。 實驗操作前，工作人員的手和小臂用70的酒精消毒。 使用的鑷子、解剖刀等用90的酒精浸泡，之后放在酒精燈上火燒滅菌，再放在滅菌支架上冷卻后使用。 在植入或移植材料的前后，培養(yǎng)瓶的瓶口需在酒精燈上火燒滅菌。（三）實驗操作的注意事項 1.進行胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)，首先要在無菌的濾紙上將已消毒的外植體的表面輕輕切去； 2.移入培養(yǎng)基時，打開封口，封口紙要小心擺正，不能亂丟亂放

17、； 3.鑷子用手拿住上端，不能去拿下端； 4.整個操作過程要盡量在超凈工作臺的無菌范圍內(nèi)進行； 5.禁止操作時正面大聲講話。五、實驗結(jié)果及討論（一）實驗結(jié)果 1.胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果：總接種瓶數(shù)4總接種塊數(shù)12污染瓶數(shù)1污染塊數(shù)3未污染瓶數(shù)3未污染塊數(shù)9未污染塊中愈傷組織發(fā)生塊數(shù)7愈傷組織發(fā)生率77 2.胡蘿卜愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)結(jié)果 這次試驗總的接種瓶數(shù)為2瓶，無污染瓶；但是愈傷組織沒有進行進一步的生長，增殖不是很好，呈現(xiàn)暗色。（二）對試驗結(jié)果的分析 1.胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織的誘導(dǎo) （1）其中一瓶接種瓶受污染，可能是由于在使用解剖刀切胡蘿卜時，拿鑷子的部位靠下后導(dǎo)致污染了細菌；也可能

18、操作時沒有在超凈工作臺的無菌范圍內(nèi)；也可能由于材料本身內(nèi)部已經(jīng)收到了污染，或是在切離胡蘿卜表面時，沒有徹底將材料表面切干凈，導(dǎo)致接種后受污染；也有可能所使用的工具消毒不夠徹底，或是操作不規(guī)范，如接種掀開培養(yǎng)瓶封口膜時手指碰到了封口膜里面，或是封口膜沒有綁緊，導(dǎo)致了微生物的進入。 （2）已接種好的材料，愈傷組織發(fā)生不好的或是沒有發(fā)生的?？赡苁怯捎冢?在配制培養(yǎng)基時，缺乏某種物質(zhì)或沒有將培養(yǎng)基混合均勻； 在分裝培養(yǎng)基時，沒有進行均勻傾倒； 所使用材料沒有將其表面切除，因其結(jié)構(gòu)被HgCl2破壞而無法使組織材料愈傷組織化。 2.愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng) （1）培養(yǎng)瓶沒有被污染，但是愈傷組織僅在培養(yǎng)基上發(fā)

19、育了一段時間后就終止其生長，其原因有： 培養(yǎng)基的配制有問題，可能培養(yǎng)基配制時某類激素用量較少或無； 接種時，切其愈傷組織時把本體胡蘿卜切了進去。（三）實驗討論 1.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH時，理論上應(yīng)調(diào)至5.8為宜，但因其培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌后，蔗糖會分解，PH值會有所下降，因此PH值調(diào)至6.0可減小誤差。 2.植物組織培養(yǎng)實驗中，必須的前提是：無菌操作，胡蘿卜肉質(zhì)根（外植體）經(jīng)HgCl2 和酒精消毒后，即認為是消毒干凈，在此后的操作中，要注意對其用具徹底消毒，操作過程中動作要規(guī)范實施。 3.廢液進行回收處理，酒精、HgCl2浸泡完材料后，應(yīng)統(tǒng)一倒入指定容器。 4.切胡蘿卜時，下方要墊上無菌濾紙。 5.接種時，動作要輕，力度要適中，不要把接種的材料切塊壓入到培養(yǎng)基里面，以致破壞培養(yǎng)基；切塊大小要適中，不宜太大，也不宜太小。 6.MS培養(yǎng)基的特點： 無機鹽濃度高； 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽； 有一定數(shù)量的銨鹽，營養(yǎng)豐富； 不需要添加更多的有機附加物。 7.植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件： 與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的材料的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、PH值和滲透壓等各種化學(xué)條