實驗七DNA體外重組技術

1、僅供個人參考實驗七 DNA體外重組技術一概念DNA重組：指不同來源的 DNA片段共價連接，通過重新組合，構成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新的重組體DNA。DNA體外重組技術：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法感興趣的目的基 因，在體外與載體 DNA分子重組，然后將重組子轉入受體細胞，并篩選出表達重組DNA的活細胞，加以純化、擴增、成為克隆，這一過程稱為DNA體外重組技術。DNA體外重組技術是基因工程的核心內(nèi)容。二.基本過程For pers onal use only in study and research; not for commercial use分、切、連、轉、篩1分：分離

2、出要克隆的目的基因及載體。 目的基因的來源：i。直接分離適于遺傳背景了解比較清楚的細菌染色體、質粒及病毒DNA的提取分離。首先通過組建幾種限制性內(nèi)切酶的物理圖譜進行基因定位，然后用DNA的酶切片段電泳分離 DNA，應用相應DNA探針確定目的DNA后，從膠中回收 DNA。ii。人工合成序列明確的短DNA片段，可用DNA合成儀合成。iii。由 mRNA逆轉錄合成 cDNA細胞總RNA分離 mRNA分離 目的基因mRNA的純化 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成cDNA發(fā)卡環(huán)的消化cDNA的克隆iv。從基因組文庫中篩選目的基因首先構建基因組文庫（G文庫）或cDNA文庫（C文庫），需要時利用探

3、針技術將所需目的 基因“釣”出來。v。PCR 載體：可容忍外源性 DNA片段插入，可在細胞間轉移并能在細胞內(nèi)自主復制的DNA分子。理想的質?？寺≥d體應具有的特性：i 能在宿主細胞中獨立復制，并能攜帶DNA片段一同擴增i 具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點，即多克隆位點（MCS, multiple cloning sites）,便于進行克隆iii. 分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復制V 易于導入受體細胞具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、a -互補顯色反應（藍白斑篩選）v .表達型載體應配備與宿主細胞相適應的啟動子，前導序列，增強子等調控元件vi。生物安全性好目前常用的載體有質粒

4、、噬箘體、病毒等。2切：用限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生便于連接的末端。3連：將切割后的目的基因和載體用T4DNA連接酶連接。4轉：把連接好的重組載體轉化入感受態(tài)細胞的過程（細菌：E.coli，真菌：Yeast,昆蟲細胞或哺乳動物細胞）。5篩：在不同層次上、不同水平上進行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將 帶有重組載體的宿主菌從培養(yǎng)基中篩選出來。例如：載體大小，酶切結果，篩選標記等。 實驗質粒DNA提取一原理1定義獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈 DNA分子?？少x予宿主細胞一定生物學性狀，如：抗生素抗性Ampr等。2. 來源存在于細菌、放

5、線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。3分類質粒按復制方式分為兩種類型：松弛型質粒和嚴緊型質粒 嚴緊型質粒（Stringent control）嚴緊型質粒只在細胞周期的一定階段進行復制，當染色體不復制時，它也不能復制，通常每個細胞內(nèi)只含有 1個或幾個質粒，如F因子。 松弛型質粒（Relaxed control）松弛型質粒在整個細胞周期中隨時可以復制，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上,如Col質粒。松弛型質粒的復制不需要質粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的 酶。即使蛋白質合成受抑制，質粒的復制依然進行。當抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素等抗生素存在時

6、，質粒的拷貝數(shù)可達2000-3000拷貝。4.構型質粒構型：超螺旋型（SC）,開環(huán)形（0C）,線型（LC）加樣孔皈H oc SC5堿裂解法提取質粒原理堿裂解法提取質粒 DNA的原理是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA與線性染色體DNA的分子大小和結構差異來實現(xiàn)分離的。在pH12-12.5時，線性DNA被徹底變性，但共價閉環(huán)質粒 DNA雖然H鍵也發(fā)生斷裂， 但兩條互補鏈仍會緊密纏繞結合在一起。當在溶液體系中加入 pH4.8的KAC時，溶液恢復中性，質粒 DNA迅速復性，染色體 DNA則由于變性而相互混亂纏繞，不能復性，從而離心即可以把變性的染色體DNA沉淀和蛋白-SDS復合物沉淀分離出來。質粒DNA染色

7、體DNA分子量小(1.5kb 15kb 或 60kb 120kb)大結構超螺旋，共價，閉環(huán)線性，雙螺旋變性 pH> 12.6氫鍵斷裂，兩條互補鏈不完全分離雙螺旋完全打開復性 pH中性恢復原始構象不能復性二.實驗試劑溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris-CI(pH 8.0)10mmol/L EDTA(pH 8.0) 溶液n0.4moI/L NaOH 2%SDS臨用前1:1混合貯存液即為II液.溶液川60ml11.5ml28.5ml (最終 pH4.8)5mol/L醋酸鉀冰醋酸水三.操作步驟1. 10,000g,1min離心收集1.5- 5ml菌液沉淀于1.5ml離心管中。

8、2. 加入100川溶液1,振蕩至徹底懸浮。3. 加入200川溶液2,立即輕柔顛倒離心管 6次，使菌體充分裂解，隨后將離心管冰上放置3分鐘4. 加入150川溶液3,立即溫和顛倒離心管數(shù)次，冰上放置3分鐘，10, 000g離心10min。5. 將步驟4的上清轉移至新的離心管（盡量去除雜質），加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合均勻10, 000g離心5min。6. 將步驟5的上清轉移至新的離心管，加入2倍體積的無水乙醇，室溫放置5- 10min，沉降DNA7. 10, 000g離心10分鐘,棄乙醇，保留沉淀，加入 1ml 70 %的乙醇洗滌沉淀，10, 000g離心5分鐘8. 倒掉乙醇溶液，用吸水紙

9、吸凈管壁上的水珠，室溫蒸發(fā)痕量乙醇9. 加入適量含 RNase的TE或滅菌雙蒸水溶解質粒 DNA10. 取適量體積的質粒 DNA進行電泳檢測不得用于商業(yè)用途僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uni

10、quementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to員bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ymoiflCH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 員 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 員 ex.以下無正文僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forsch

11、ung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to員bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ygoiccH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 員 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 員 ex.For personal use only in study and research; not for commercial use以下無正文僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerieel Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude