儀器分析第三章高效液相色譜分析

1、11/14/2021第三章第三章高效液相色譜分析高效液相色譜分析high performance liquid chromatography, hplc11/14/20213-1 3-1 3-1 高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 高效液相色譜法：高效液相色譜法： 一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。 它在經(jīng)典液相色譜的基礎上，引入氣相色它在經(jīng)典液相色譜的基礎上，引入氣相色譜的理論，技術上采用了高壓泵、高效分離柱、譜的理論，技術上采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器

2、。高靈敏度檢測器。11/14/202111/14/20211. 高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較 高壓：高壓： hplc采用高壓輸液設備采用高壓輸液設備, 150-350*105 pa 高速：高速： hplc流速大增，分析速度極快，只需數(shù)分流速大增，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。時。 高效：高效：化學鍵和固定相化學鍵和固定相, 30000塔板塔板/米米 高靈敏：高靈敏：10-9g （紫外檢測）、（紫外檢測）、10-11g （熒光檢測）（熒光檢測）11/14/20212

3、、hplc與與gc的區(qū)別的區(qū)別分析對象及范圍分析對象及范圍：gc分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機物總數(shù)的這些物質(zhì)只點有機物總數(shù)的20%；hplc可以分析高沸點、高分可以分析高沸點、高分子量、熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的子量、熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的80%。流動相的選擇流動相的選擇：gc采用的流動相中為有限的幾種采用的流動相中為有限的幾種“惰性惰性”氣體，氣體，只起運載作用，和組分之間沒有相互的作用力；只起運載作用，和組分之間沒有相互的作用力；hplc采用的流采用的流動相為各種極性不同的液體或液體的混

4、合，可供選擇的機會多。動相為各種極性不同的液體或液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。改進分離。操作溫度操作溫度：gc需高溫；需高溫；hplc通常在室溫下進行。通常在室溫下進行。11/14/20213-2 3-2 3-2 3-2 3-2 3-2 高效液相色譜法理論基礎高效液相色譜法理論基礎高效液相色譜法理論基礎高效液相色譜法理論基礎高效液相色譜法理論基礎高效液相色譜法理論

5、基礎 = 2l l dp +cd dmu+cm dp2 csmdp2 cs df2dm dm ds+uh = a + + cubu 由于柱內(nèi)色譜峰擴展所引起的塔板高度的變化為：由于柱內(nèi)色譜峰擴展所引起的塔板高度的變化為：11/14/2021 速率方程：速率方程： h=a+b/u+cu （1）液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，）液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，hplc中中速率方程中的速率方程中的b/u較小，可以忽略不計，較小，可以忽略不計， （2）影響柱效的主要因素是）影響柱效的主要因素是11/14/2021 提高柱內(nèi)填料均勻性，減小固定相粒度（選擇提高柱內(nèi)填料均勻性，減小固定相粒度（選擇薄殼

6、形擔體）薄殼形擔體） 選用低粘度的流動相或適當提高柱溫，降低流選用低粘度的流動相或適當提高柱溫，降低流動相粘度動相粘度; 減小粒度是最有效的途徑減小粒度是最有效的途徑.11/14/20213-3 3-3 3-3 3-3 3-3 3-3 高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法主要類型及分離原理主要類型及分離原理主要類型及分離原理主要類型及分離原理主要類型及分離原理主要類型及分離原理11/14/20211 1 1 1 1 1、液液液液液液- - -液分配色譜液分配色譜液分配色譜液分配色譜液分配色譜液分配色譜 固定相與流動相均為液體（互不相溶）；固定相與

7、流動相均為液體（互不相溶）； 分離機制分離機制：組分在固定相和流動相上的分配；：組分在固定相和流動相上的分配； 流動相流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（動相的極性小于固定液的極性（正相色譜正相色譜），反之，流動相），反之，流動相的極性大于固定液的極性（的極性大于固定液的極性（反相反相色譜色譜）。）。 固定相固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用; 目前應用最廣的固定相目前應用最廣的固定相:化學鍵合固定相化學鍵合固定相 11/14/2021正相色譜正相色譜固定液極性固定

8、液極性 流動相極性流動相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分適于分離極性組分反相色譜反相色譜固定液極性固定液極性 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙丙醇醇 丙酮丙酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳環(huán)己烷環(huán)己烷己己烷烷煤油煤油(最小最小) 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或

9、調(diào)整出峰時間。或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。11/14/20213-6 3-6 3-6 3-6 3-6 3-6 高效高效高效高效高效高效液相色譜儀器液相色譜儀器液相色譜儀器液相色譜儀器液相色譜儀器液相色譜儀器11/14/2021液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（1 1 1）11/14/2021液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（2 2 2）11/14/2021流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly of hplcp

10、rocess and main assembly of hplcprocess and main assembly of hplc1.1.流程流程高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)11/14/20212. 2. 2.主要部件主要部件主要部件主要部件主要部件主要部件(1)高壓輸液系統(tǒng)（儲液器、高壓泵、過濾器）高壓輸液系統(tǒng)（儲液器、高壓泵、過濾器）高壓泵高壓泵為了獲得高柱效，為了獲得高柱效，hplc使用粒度很小的固定相（使用粒度很小的固定相（2000排阻色譜排阻色譜11/14/2021 樣品溶于水不離解樣品溶于水不離解反相色譜反相色譜 樣品溶于水并能離解樣品溶于水并能離解離子交換

11、色譜離子交換色譜 樣品溶于烴類（苯或異辛烷）樣品溶于烴類（苯或異辛烷）液固吸附色譜液固吸附色譜 樣品溶于甲醇樣品溶于甲醇反相色譜反相色譜 異構體異構體液固吸附色譜液固吸附色譜 同系物同系物正相色譜、反相色譜正相色譜、反相色譜11/14/202111/14/20213-8 3-8 3-8 3-8 3-8 3-8 hplchplchplc的的的的的的應用應用應用應用應用應用 application of hplcapplication of hplcapplication of hplc 1. 1. 環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：

12、正己烷 流 速：1.5 ml/min 色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑) 檢測器：示差折光檢測器 可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。11/14/20212. 2. 2. 2. 2. 2. 稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析 稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1ml/min 柱 溫：50 c 柱 壓：70 104 pa 檢測器：紫外檢測器11/14/20213-9 3-9 3-9 3-9 3-9 3-9 液相制備色譜液相制備色譜液相制備色譜液相制備色

13、譜液相制備色譜液相制備色譜 制備色譜：利用色譜技術分離、制備大量純組分的有效制備色譜：利用色譜技術分離、制備大量純組分的有效方法。方法。 分析分析hplc制備制備hplc目的目的目的目的樣品組成信息樣品組成信息純品回收純品回收通常研究大部分或全部樣通常研究大部分或全部樣品組分品組分通常只對一種或幾種樣品通常只對一種或幾種樣品組分感興趣組分感興趣11/14/20211.1.色譜柱的柱容量（柱負荷）色譜柱的柱容量（柱負荷）分析柱：分析柱：不影響柱效時的最大進樣量；制備柱：制備柱：不影響收集物純度時的最大進樣量； 超載：超載：進樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。制備柱允許超載制備柱允許超載（以柱效下降一半或容量因子（以柱效下降一半或容量因子k降低降低10%為宜）為宜）11/14/20212. 2. 2. 2. 2. 2. 液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法收集組分時，通常有以下情況：收集組分時，通常有以下情況： （1）可獲得良好分離，主峰）可獲得良好分離，主峰 使用制備柱，超載提高效率使用制備柱，超載提高效率(圖圖3-28）；）； （2）兩主成分之間的小組分；）兩