分子診斷劉斌

1、分子診斷在病理診斷中的應用蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科 劉劉 斌斌 腫瘤的發(fā)生根本原因是由于基因的異常改變引起。隨著分子生物學的發(fā)展，特別是人類基因組計劃的順利實施、人類基因組序列的剖析、相關基因功能的識別，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸機制有了更深入的了解，使人類除了能更早期發(fā)現(xiàn)及診斷腫瘤外，還可預測人群或個體發(fā)生腫瘤的風險（腫瘤易感性）、病因檢測、腫瘤的惡性特征、對特定治療手段的反應（療效預測）、轉(zhuǎn)移復發(fā)的可能與早期發(fā)現(xiàn)等，進行腫瘤診斷、分類、判斷預后及指導治療。 如今檢測癌患者的基因狀態(tài)有很多方法： ihc，fish，cish，southern blot，pcr，real time

2、 pcr?，F(xiàn)如今fish技術已應用于實體瘤、血液腫瘤、產(chǎn)前產(chǎn)后多個領域。 熒光原位雜交熒光原位雜交fluorescence in situ hybridization 原理原理利用dna堿基對的互補性，將直接標記了熒光的單鏈dna(探針)和與其互補的目標樣本的dna(玻片上的標本)雜交,通過觀察熒光信號在染色體上的位置反映相應染色體的情況fish檢測類型 基因過表達的檢測 基因突變及其檢測 基因的易位與重排 染色體數(shù)目的檢測 端粒酶與腫瘤的關系檢測一.基因過表達檢測1.對her2的檢測檢測方法檢測方法檢測指標檢測指標優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點ihcher2蛋白費用低光鏡即可觀察結(jié)果準確性差，判斷主觀性強

3、，假陽性、陰性率高cishher2 dna光鏡即可觀察結(jié)果對低倍擴增及染色體非整倍擴增檢測靈敏度下降fishher2 dna對于低倍、高倍及染色體非整倍性擴增檢測準確性高，靈敏度特異性好，結(jié)果判斷比較客觀，是her2基因檢測的“金指標”相對費用較高其中fish是fda批準的方法，被譽為“金標準”。ich赫賽汀 fish技術對her2基因的檢測 her-2基因為致癌基因，位于17q11.2-q12 可編碼跨膜蛋白，基因有擴增的乳腺癌對三苯氧胺不敏感。 her-2基因擴增是決定herceptin是否有效的關鍵性指標。赫賽汀赫賽汀(herceptin)(herceptin)抗腫瘤機制抗腫瘤機制阻斷異

4、常信號轉(zhuǎn)導阻斷異常信號轉(zhuǎn)導增強抗體依賴性細增強抗體依賴性細胞毒作用胞毒作用乳腺癌和胃癌中her2基因的擴增比率 所做乳腺癌中her2基因檢出陽性率為65%；胃癌中her2基因檢出陽性率為35.7%。標本her2總數(shù)陽性例數(shù)乳腺癌2617胃癌145總計40例2.非小型細胞肺癌中egfr基因擴增的檢測 egfr擴增egfr無擴增 nsclc中egfr基因擴增鱗癌擴增為鱗癌擴增為80%80%左右，腺癌與大細胞癌為左右，腺癌與大細胞癌為60%60%左右左右基因擴增能引起基因擴增能引起egfregfr酪氨酸激酶活化，激發(fā)其下游一系列信酪氨酸激酶活化，激發(fā)其下游一系列信 號傳導途徑，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，基因

5、擴增與酪氨酸激酶抑制號傳導途徑，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，基因擴增與酪氨酸激酶抑制 劑的敏感性相關劑的敏感性相關基因擴增病人用藥有效率達基因擴增病人用藥有效率達38.9%38.9%，無擴增的病人用藥有效率，無擴增的病人用藥有效率在在9.8%9.8% egfr功能 egfr在多種上皮性腫瘤高表達, 其過表達與腫瘤細胞的增殖、活動性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關, 最終導致細胞的轉(zhuǎn)化、增殖, 抵抗細胞凋亡、促進細胞生存, 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床分期、生存期、預后和對治療反應相關。tkgene transcriptioncell cycle progression抗凋亡抗凋亡canceratpe

6、gfregfr變異變異目前應用于nsclc的靶向治療藥物 吉非替尼吉非替尼(gefitinib, zd-1839,商品名iressa 2003 fda approved) 厄洛替尼厄洛替尼 (erlotinib,osi-774,商品名tarceva 2004 fda approved) 西妥昔單抗西妥昔單抗: : (cetuximab fda 2004 approved) 二.基因突變及其檢測real-time檢測基因突變原理taqman taqman 探針的機理探針的機理:dna:dna聚合酶在延伸階段把探針切碎，產(chǎn)熒光基團和聚合酶在延伸階段把探針切碎，產(chǎn)熒光基團和熒光淬滅基團分開，于是熒光

7、得以檢測。熒光淬滅基團分開，于是熒光得以檢測。egfr基因突變基因突變 突變率在33%左右，其中腺癌高達48%（董強剛等 2006） 東方亞裔明顯高于高加索人種、女性高于男性、非吸煙高于吸煙 egfr19、21外顯子的突變占95%左右 egfr 變異使egfr 酪氨酸激酶atp結(jié)合位點的某些關鍵基團發(fā)生重構, 使得小分子酪氨酸激酶抑制劑更易與之結(jié)合，增強了與atp競爭性抑制劑的相互作用 全球突變型nsclc用iressa/tarceva有效率約80%； 無突變nsclc用ressa/tarceva有效率約10%。 real-time檢測檢測 egfr 19、21突變突變k-rask-ras基因

8、突變的檢測基因突變的檢測kras基因?qū)儆趓as家族的一員，包括k-ras,n-ras,h-ras具有gtp酶活性，活化狀態(tài)與gtp結(jié)合，失活與gdp結(jié)合，絕大部分細胞是與gdp結(jié)合的非活化狀態(tài)參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化與凋亡15-20%的nsclc存在ras基因突變，其中90%以上是k-ras突變，12號密碼子的突變占80%以上。而腺癌的病人突變占30%，k-ras突變與吸煙密切相關，終生未吸煙的未發(fā)現(xiàn)k-ras基因突變與egfr基因突變存在排斥性是gefitinib與erlotinib原發(fā)耐藥的分子標記之一 在直腸癌中k-ras基因突變的患者不會從egfr單抗靶向治療中獲益，k-ras野生

9、型患者對cetuximab/erbitux（愛必妥）和panitumumab/vectibix（維克替比）單藥或與基礎化療聯(lián)合治療的反應率顯著大于突變型患者。野生型 現(xiàn)臨床通常將egfr和k-ras基因聯(lián)合檢測，來針對非小細胞肺癌進行靶向治療，對擬行tki治療的患者，可以首先檢測kras突變狀態(tài)，排除陽性后對kras陰性者進行egfr突變檢測；若egfr突變陽性，選擇tki治療。 三.基因的易位與重排1.慢性淋巴細胞白血?。╟ll）檢測 通過對p53、rb1、d13s25、atm基因以及12號染色體檢測來判斷預后。 2.慢性粒細胞白血病（cml）檢測bcr/abl融合基因1.輔助診斷cml2.

10、指導格列衛(wèi)用藥3.藥物使用效果評估4.骨髓移植效果評估bcr/abl基因融合正常細胞3.急性早幼粒細胞白血?。╩3）檢測pml/rara融合基因。 指導全反式維甲酸(all trans-retinoic acid，atra) 用藥atra治療機制是靶向降解pml/rara融合蛋白，促進阻滯在早幼粒細胞階段的白血病細胞分化成熟。pml/rara融合基因正常細胞3.性染色體骨髓錯配移植檢測 用于監(jiān)測性染色體錯配的骨髓移植效果 女性患者骨髓移植前 女性患者骨髓移植后四.染色體數(shù)目的檢測 不明原因流產(chǎn)中較為常見的有x單體，發(fā)生率約為20%；16號三體，發(fā)生率約為16%；18號三體，發(fā)生率約為3%；21三體，發(fā)生率約為5%；22三體，發(fā)生率約為5%。進行染色體檢測可以為下一胎妊娠遺傳咨詢提供資料。 21三體13三體 其它項目一一. .基因重排在淋巴瘤診斷中的應用基因重排在淋巴瘤診斷中的應用它在淋巴瘤的分型、療效評價、預測復發(fā)和預后評估等方面有重要的臨床意義。二二. .端粒酶與腫瘤的關系檢測端粒酶與腫瘤的關系檢測 由于terc（telomerase of rna component ）基因編碼端粒酶的rna組分，維持端粒的長度，該基因的擴增使得端粒穩(wěn)