固定化酶在醫(yī)療應(yīng)用

1、固定化酶在醫(yī)療中的固定化酶在醫(yī)療中的應(yīng)用應(yīng)用應(yīng)化應(yīng)化0701 李洋李洋 酶是一類具有催化功能的蛋白質(zhì)酶是一類具有催化功能的蛋白質(zhì), 和化學(xué)催化劑相比具有和化學(xué)催化劑相比具有反應(yīng)速度快反應(yīng)速度快, 化學(xué)、立體和分子部位選擇性好化學(xué)、立體和分子部位選擇性好, 反應(yīng)條件溫和反應(yīng)條件溫和, 底物專一性強(qiáng)底物專一性強(qiáng), 可在水溶液和中性可在水溶液和中性ph下操作等優(yōu)點下操作等優(yōu)點, 同時酶同時酶本身可以被微生物降解本身可以被微生物降解, 符合綠色化學(xué)的要求符合綠色化學(xué)的要求.已在食品、醫(yī)已在食品、醫(yī)藥、輕工和農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用藥、輕工和農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用 , 但和多相催化但和多相催化

2、過程相比過程相比, 酶在能源和化工中的應(yīng)用還存在如下問題酶在能源和化工中的應(yīng)用還存在如下問題. (1) 酶一旦從細(xì)胞中分離出來酶一旦從細(xì)胞中分離出來, 其活性迅速下降其活性迅速下降, 并且在實并且在實際應(yīng)用中對外界因素非常敏感際應(yīng)用中對外界因素非常敏感, 容易因反應(yīng)條件的變化和雜容易因反應(yīng)條件的變化和雜質(zhì)的毒化作用而失活質(zhì)的毒化作用而失活. (2)酶的分離和純化手續(xù)繁雜酶的分離和純化手續(xù)繁雜, 大規(guī)模制備和應(yīng)用成本較高大規(guī)模制備和應(yīng)用成本較高. (3)酶是溶于水的酶是溶于水的, 在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行反應(yīng), 會導(dǎo)致酶和底物、會導(dǎo)致酶和底物、產(chǎn)物從水中分離的困難產(chǎn)物從水中分離的困難,

3、不利于循環(huán)使用不利于循環(huán)使用. (4)由于反應(yīng)產(chǎn)物是酶的排泄物由于反應(yīng)產(chǎn)物是酶的排泄物, 對酶催化反應(yīng)有抑制作用對酶催化反應(yīng)有抑制作用, 限制了產(chǎn)物濃度的提高限制了產(chǎn)物濃度的提高, 因此生產(chǎn)強(qiáng)度低因此生產(chǎn)強(qiáng)度低. 酶的固定化技術(shù)就是為了克服上述缺點酶的固定化技術(shù)就是為了克服上述缺點, 使酶催化反應(yīng)能使酶催化反應(yīng)能像化學(xué)催化劑一樣在多相反應(yīng)過程中穩(wěn)定操作像化學(xué)催化劑一樣在多相反應(yīng)過程中穩(wěn)定操作, 并易于回收并易于回收和反復(fù)使用而發(fā)展起來的一項酶化學(xué)與酶工程技術(shù)和反復(fù)使用而發(fā)展起來的一項酶化學(xué)與酶工程技術(shù).一、酶在治療疾病中的應(yīng)用一、酶在治療疾病中的應(yīng)用 目前藥用酶的治療作用目前藥用酶的治療作用包

4、括包括（1）由于體內(nèi)有害物質(zhì)的積累所引起的疾病，可以用酶來消）由于體內(nèi)有害物質(zhì)的積累所引起的疾病，可以用酶來消除毒物。例如：用脲酶來消除血液中過量的尿素。除毒物。例如：用脲酶來消除血液中過量的尿素。（2）由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所產(chǎn)生的疾）由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所產(chǎn)生的疾病，可以用酶來調(diào)整作用，或者補(bǔ)充酶量。如，用苯丙氨酸病，可以用酶來調(diào)整作用，或者補(bǔ)充酶量。如，用苯丙氨酸羥化酶可以治療先天性缺苯丙氨酸羥化酶的苯基酮尿癥患者。羥化酶可以治療先天性缺苯丙氨酸羥化酶的苯基酮尿癥患者。（3）癌細(xì)胞內(nèi)異常的生化環(huán)境可用酶來破壞，以殺死癌細(xì)胞。）癌細(xì)胞內(nèi)異常的生化環(huán)境可用酶

5、來破壞，以殺死癌細(xì)胞。（4）由于細(xì)菌、病毒引起機(jī)體產(chǎn)生的疾病，可以用抗生素抑）由于細(xì)菌、病毒引起機(jī)體產(chǎn)生的疾病，可以用抗生素抑制微生物代謝所需要的酶，使微生物死亡，從而恢復(fù)人體健制微生物代謝所需要的酶，使微生物死亡，從而恢復(fù)人體健康?？?。但是目前，酶治療中遇到下列幾個難題：但是目前，酶治療中遇到下列幾個難題：（1 1）外源酶具有抗原性，注入人體后易產(chǎn)生過敏反應(yīng)。）外源酶具有抗原性，注入人體后易產(chǎn)生過敏反應(yīng)。（2 2）外源酶進(jìn)入人體后極易被蛋白酶水解，被抑制劑抑制，）外源酶進(jìn)入人體后極易被蛋白酶水解，被抑制劑抑制，因而在體內(nèi)的半衰期很短。因而在體內(nèi)的半衰期很短。（3 3）外源酶進(jìn)入人體后如何集中

6、到發(fā)病部位以達(dá)到最高療效。）外源酶進(jìn)入人體后如何集中到發(fā)病部位以達(dá)到最高療效。為了解決以上難題，采用了固定化酶的方法為了解決以上難題，采用了固定化酶的方法。 藥用酶的固定化提高了其穩(wěn)定性及緩釋性、并藥用酶的固定化提高了其穩(wěn)定性及緩釋性、并可除去免疫原性可除去免疫原性 . 前列腺素衍生物是藥物在前列腺素衍生物是藥物在20世紀(jì)世紀(jì)的重要發(fā)現(xiàn)之一的重要發(fā)現(xiàn)之一, 用大孔徑用大孔徑n2聚氨乙基丙烯酰胺為聚氨乙基丙烯酰胺為載體載體, 使前列腺素合成酶固定化使前列腺素合成酶固定化, 合成前列腺素衍生合成前列腺素衍生物物e1, 顯示出良好的活性及貯存穩(wěn)定性顯示出良好的活性及貯存穩(wěn)定性. 微囊固定化微囊固定化

7、過氧化氫酶具有良好的酶活性及穩(wěn)定性過氧化氫酶具有良好的酶活性及穩(wěn)定性, 在臨床檢在臨床檢測及衛(wèi)生防疫方面具有廣泛用途測及衛(wèi)生防疫方面具有廣泛用途. 葡聚糖磁性納米葡聚糖磁性納米微粒固定化微粒固定化l-天冬酰胺酶天冬酰胺酶, 具有通過血液注射治療具有通過血液注射治療急性淋巴白血病的醫(yī)用前景急性淋巴白血病的醫(yī)用前景. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶sod在清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的過量超氧陰離子方面在清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的過量超氧陰離子方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.下面就下面就l-天冬酰胺酶和天冬酰胺酶和sod的固定化進(jìn)行拓展。的固定化進(jìn)行拓展。l-天冬酰胺酶 l-天冬酰胺酶天冬

8、酰胺酶(e.c.3.5.1.1，l-asparaginase)能能將腫瘤細(xì)胞生長所需的將腫瘤細(xì)胞生長所需的l-天冬酰胺水解為天冬氨酸天冬酰胺水解為天冬氨酸和氨，影響腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成，從而抑制腫和氨，影響腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成，從而抑制腫瘤的生長，臨床上主要用于治療急性淋巴性白血病，瘤的生長，臨床上主要用于治療急性淋巴性白血病，其有效率為其有效率為6o%左右。但直接使用游離的左右。但直接使用游離的l-天門冬天門冬酰胺酶存在著一些缺點：存在較多的副作用，可引酰胺酶存在著一些缺點：存在較多的副作用，可引起急性胰腺炎、胃腸道反應(yīng)、肝功能和其它代謝異起急性胰腺炎、胃腸道反應(yīng)、肝功能和其它代謝異常及

9、過敏反應(yīng)常及過敏反應(yīng) ；游離酶穩(wěn)定性較差，易被蛋白酶水；游離酶穩(wěn)定性較差，易被蛋白酶水解。這些缺點限制了游離解。這些缺點限制了游離l-天冬酰胺酶的應(yīng)用，固天冬酰胺酶的應(yīng)用，固定化定化l-天冬酰胺酶的研究受到了較多的關(guān)注。天冬酰胺酶的研究受到了較多的關(guān)注。 在在37水浴中使海藻酸鈉在蒸餾水中融化，水浴中使海藻酸鈉在蒸餾水中融化，加入一定體積的酶溶液，吸入注射器內(nèi)，逐加入一定體積的酶溶液，吸入注射器內(nèi)，逐滴滴入磁力攪拌下的滴滴入磁力攪拌下的2%氯化鈣溶液中，即可氯化鈣溶液中，即可形成光滑的微球體。形成光滑的微球體。4下硬化下硬化2 h，用去離，用去離子水洗滌。再用一定濃度的戊二醛交聯(lián)子水洗滌。再用

10、一定濃度的戊二醛交聯(lián)2 h，然后用大量的去離子水洗滌直到無戊二醛為然后用大量的去離子水洗滌直到無戊二醛為止止(加入奈氏試劑檢測加入奈氏試劑檢測)即得固定化酶。取即得固定化酶。取0.2 mi 游離酶或游離酶或1.5 g固定化酶，加入固定化酶，加入0.8mi 不同不同ph 值值(6.09.0)的緩沖液，再加入的緩沖液，再加入2.0mi 的的l一天冬酰胺溶液一天冬酰胺溶液(0.04 mol/mi )，測定酶，測定酶活力，結(jié)果如圖活力，結(jié)果如圖1所示。所示。從圖從圖1中可以看出，固定化酶的中可以看出，固定化酶的最適最適ph 值為值為85，與游離酶的，與游離酶的最適最適ph 值相比沒有發(fā)生偏移。值相比沒

11、有發(fā)生偏移。影響固定化酶最適影響固定化酶最適ph值的因素主值的因素主要有兩個，一是擴(kuò)散效應(yīng)，另一要有兩個，一是擴(kuò)散效應(yīng)，另一個是載體帶電性質(zhì)?？赡苁怯捎趥€是載體帶電性質(zhì)?？赡苁怯捎诓捎昧藥ж?fù)電荷的載體，載體帶采用了帶負(fù)電荷的載體，載體帶電性質(zhì)產(chǎn)生的影響和擴(kuò)散效應(yīng)產(chǎn)電性質(zhì)產(chǎn)生的影響和擴(kuò)散效應(yīng)產(chǎn)生的影響相互抵消，使得固定化生的影響相互抵消，使得固定化酶的最適酶的最適ph 與游離酶相比沒有與游離酶相比沒有大的改變。大的改變。 同理對固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)，最適同理對固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)，最適反應(yīng)溫度以及半衰期進(jìn)行測量比較，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度以及半衰期進(jìn)行測量比較，發(fā)現(xiàn)2者者基本一致，說明酶的固定

12、化對其活性未產(chǎn)生基本一致，說明酶的固定化對其活性未產(chǎn)生較大影響較大影響.超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶sod sod即超氧化物歧化酶即超氧化物歧化酶, 是人體細(xì)胞代謝不可缺少的活性是人體細(xì)胞代謝不可缺少的活性蛋白酶。超氧化物歧化酶是一種金屬酶。人們在研究中發(fā)現(xiàn)蛋白酶。超氧化物歧化酶是一種金屬酶。人們在研究中發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶是機(jī)體代謝所產(chǎn)生的有害物質(zhì)超氧陰離子自超氧化物歧化酶是機(jī)體代謝所產(chǎn)生的有害物質(zhì)超氧陰離子自由基的天然清除劑。機(jī)體在代謝中產(chǎn)生的自由基以氧自由基由基的天然清除劑。機(jī)體在代謝中產(chǎn)生的自由基以氧自由基對機(jī)體的危害最大。氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥基對機(jī)體的危害最大。氧自由基包括

13、超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫及單線態(tài)氧等自由基、過氧化氫及單線態(tài)氧等, 這些自由基是機(jī)體正常代這些自由基是機(jī)體正常代謝產(chǎn)物謝產(chǎn)物, 盡管它們在代謝中連續(xù)不斷的產(chǎn)生盡管它們在代謝中連續(xù)不斷的產(chǎn)生, 但由于機(jī)體中存但由于機(jī)體中存在防御系統(tǒng)在防御系統(tǒng), 所以正常情況下危害不大所以正常情況下危害不大, 其中的超氧陰離子自其中的超氧陰離子自由基就可以被由基就可以被sod清除。研究表明清除。研究表明,sod對人體血栓癥、動對人體血栓癥、動脈硬化癥、糖尿病等疾病有一定的預(yù)防和輔助治療作用脈硬化癥、糖尿病等疾病有一定的預(yù)防和輔助治療作用,并并且在抗腫瘤發(fā)生、消炎和抗衰老等領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前且在抗

14、腫瘤發(fā)生、消炎和抗衰老等領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。景。 sod是一種含金屬的酶是一種含金屬的酶, 按金屬輔基的不同可按金屬輔基的不同可分成三種。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基分成三種。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(cu、zn - sod) , 主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中, 也存也存在于高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體在于高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙中。該酶純品呈藍(lán)綠色膜間隙中。該酶純品呈藍(lán)綠色, 由由2條肽鏈組成條肽鏈組成, 每每條肽鏈含有銅、鋅原子各一個條肽鏈含有銅、鋅原子各一個,活性中心的核心是銅活性中心的核心是銅; 第二種含有錳原子第

15、二種含有錳原子(mn -sod ) , 主要存在真核細(xì)胞主要存在真核細(xì)胞的線粒體及原核細(xì)胞中的線粒體及原核細(xì)胞中, 也存在于植物的葉綠體基也存在于植物的葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上質(zhì)和類囊體膜上(純品呈粉紅色純品呈粉紅色, 由由4條或條或2條肽鏈組條肽鏈組成成) ; 第三種是第三種是fe - sod, 主要存在于原核細(xì)胞中主要存在于原核細(xì)胞中, fe -sod在高等植物中一般僅存在綠體中在高等植物中一般僅存在綠體中(純品呈黃純品呈黃色或黃褐色色或黃褐色, 由由2條肽鏈組成條肽鏈組成) , 多數(shù)情況下一個二聚多數(shù)情況下一個二聚體中含有一個體中含有一個fe原子。原子。 以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采

16、用固定化的方法以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用固定化的方法對超氧化物歧化酶進(jìn)行優(yōu)化。并采用鄰苯三酚自氧化法測定對超氧化物歧化酶進(jìn)行優(yōu)化。并采用鄰苯三酚自氧化法測定sod 的活性。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，在的活性。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，在自氧化過程中，超氧陰離子（自氧化過程中，超氧陰離子（o2-）不斷消失又不斷生成，）不斷消失又不斷生成，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時，其濃度保持恒定，鄰苯三酚的自氧化率呈當(dāng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時，其濃度保持恒定，鄰苯三酚的自氧化率呈o2-濃度相性。濃度相性。sod 能催化能催化o2-發(fā)生歧化反應(yīng)，生成發(fā)生歧化反應(yīng)，生成h2o2 和和o2，從而抑制鄰苯三酚的自氧化

17、。樣品對鄰苯三酚的抑制程，從而抑制鄰苯三酚的自氧化。樣品對鄰苯三酚的抑制程度，可反映樣品中度，可反映樣品中sod 的含量。實驗測定在的含量。實驗測定在325 nm 處有色處有色醌類的吸光度變化，反映出鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制程度。醌類的吸光度變化，反映出鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制程度。o2-在水溶液中是中等強(qiáng)度的還原劑和弱氧化劑，它能迅速在水溶液中是中等強(qiáng)度的還原劑和弱氧化劑，它能迅速參與單電子還原反應(yīng)，但也能被強(qiáng)氧化劑還原。當(dāng)強(qiáng)還原劑參與單電子還原反應(yīng)，但也能被強(qiáng)氧化劑還原。當(dāng)強(qiáng)還原劑維生素維生素c作為終止劑加到反應(yīng)體系時，便迅速與作為終止劑加到反應(yīng)體系時，便迅速與o2-反應(yīng)，反應(yīng)，阻止自氧化

18、反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，為同時測定多樣品爭取了時阻止自氧化反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，為同時測定多樣品爭取了時間。經(jīng)檢測，固定化超氧化物歧化酶活力可達(dá)間。經(jīng)檢測，固定化超氧化物歧化酶活力可達(dá)333 u / g，酶活回收率為酶活回收率為86. 32%，均明顯高于其他同類實驗（，均明顯高于其他同類實驗（192 u /g，34%；123 u /g，41%）。）。 固定化酶在固定化酶在85高溫條件下，活力并沒有明顯下降，反高溫條件下，活力并沒有明顯下降，反而有微小上升，可能是由于高溫使固定化酶的載體更為活躍，而有微小上升，可能是由于高溫使固定化酶的載體更為活躍，空間位阻變小，更有利于酶與底物的結(jié)合。固定化酶在強(qiáng)酸、空間位

19、阻變小，更有利于酶與底物的結(jié)合。固定化酶在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下活性維持得更久，但在強(qiáng)堿條件下活性維持得更久，但在2 h 后也會降低至后也會降低至50%以以下。在較強(qiáng)的酸堿環(huán)境下固定化酶比溶液酶穩(wěn)定，這是由于下。在較強(qiáng)的酸堿環(huán)境下固定化酶比溶液酶穩(wěn)定，這是由于溶液酶在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿中，酶與底物的結(jié)合位點構(gòu)象被破壞，溶液酶在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿中，酶與底物的結(jié)合位點構(gòu)象被破壞，不能有效地結(jié)合底物，表現(xiàn)為活力大幅度下降；而固定化酶不能有效地結(jié)合底物，表現(xiàn)為活力大幅度下降；而固定化酶由于載體的保護(hù)作用，其結(jié)合位點構(gòu)象較穩(wěn)定，受酸堿的破由于載體的保護(hù)作用，其結(jié)合位點構(gòu)象較穩(wěn)定，受酸堿的破壞程度降低，表現(xiàn)為耐酸堿能力增強(qiáng)。固定化酶的壞程度降低，表現(xiàn)為耐酸堿能力增強(qiáng)。固定化酶的km 比溶比溶液酶稍大，顯示固定化酶與底物的親和能力稍有下降。有文液酶稍大，顯示固定化酶與底物的親和能力稍有下降。有文獻(xiàn)表明，獻(xiàn)表明，km 值的下降主要由以下因素引起：值的下降主要由以下因素引起：酶分子構(gòu)象酶分子構(gòu)象的改變；的改變； 微環(huán)境的影響；微環(huán)境的影響；底物在載體和溶液間存在分底物在載體和溶液間存在分配效應(yīng)；配效應(yīng)；擴(kuò)散效應(yīng)的影響。擴(kuò)散效應(yīng)的影響。 此外固定化酶在臨床分析中也已得到應(yīng)用此外固定化酶在臨床分析中也已得到應(yīng)用,