第十一章植物體細(xì)胞無性系變異

1、第十一章：植物體細(xì)胞無性系變異微生物：誘變育種、誘發(fā)遺傳變異機(jī)理的 研究高等植物：20世紀(jì)70年代后，生物技術(shù)發(fā)展使得能利用離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞，在 細(xì)胞水平上直接進(jìn)行誘變和篩選。第一節(jié)：體細(xì)胞無性系變異的來源與特征一、體細(xì)胞無性變異的概念與應(yīng)用一、體細(xì)胞無性變異的概念與應(yīng)用體細(xì)胞無性系：是指一切由植物的體細(xì)胞再生的植株。經(jīng)過組織培養(yǎng)循環(huán)出現(xiàn)的再生植株的變異稱為體細(xì)胞無性變異（stmaclonal variation).體細(xì)胞無性變異的優(yōu)點(diǎn)：誘變?nèi)后w大，篩選方便；不受體細(xì)胞無性變異的優(yōu)點(diǎn)：誘變?nèi)后w大，篩選方便；不受季節(jié)限制效率高；試驗(yàn)重復(fù)性好，誘變條件可控；誘變季節(jié)限制效率高；試驗(yàn)重復(fù)性好，誘變

2、條件可控；誘變頻率高變化幅度大；出現(xiàn)新的變異；在單細(xì)胞上進(jìn)行避頻率高變化幅度大；出現(xiàn)新的變異；在單細(xì)胞上進(jìn)行避免出現(xiàn)嵌合體；可以拓寬種質(zhì)資源、加快育種進(jìn)程。免出現(xiàn)嵌合體；可以拓寬種質(zhì)資源、加快育種進(jìn)程。缺點(diǎn)：畸變率高、依賴于基因型、變異并不總是穩(wěn)定和遺傳。缺點(diǎn)：畸變率高、依賴于基因型、變異并不總是穩(wěn)定和遺傳。海雀稗體細(xì)胞耐寒突變體篩選海雀稗體細(xì)胞耐寒突變體篩選拓寬遺傳資源，進(jìn)行遺傳改良拓寬遺傳資源，進(jìn)行遺傳改良在山東省濰坊地區(qū)，海雀稗原始品種受凍害致死，耐寒突變體材料能安全越冬（綠化）。遺傳學(xué)研究、發(fā)育生物學(xué)研究、生化代謝途徑研究。遺傳學(xué)研究、發(fā)育生物學(xué)研究、生化代謝途徑研究。二、體細(xì)胞無性系

3、變異的來源及影響變異的主要因素二、體細(xì)胞無性系變異的來源及影響變異的主要因素外植體來源：外植體來源：離體培養(yǎng)誘導(dǎo)：離體培養(yǎng)誘導(dǎo)：嵌合體嵌合體存在于分化的細(xì)胞中存在于分化的細(xì)胞中嵌合體嵌合體。 3影響變異的主要因素：影響變異的主要因素：1. 1. 外植體的種類和基因型、染色體水平、生理狀態(tài)、不同培養(yǎng)器官外植體的種類和基因型、染色體水平、生理狀態(tài)、不同培養(yǎng)器官2. 2. 培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分3. 3. 繼代培養(yǎng)時(shí)間繼代培養(yǎng)時(shí)間三、體細(xì)胞無性系變異的特征1. 普遍性和多樣性2. 可遺傳性不同植物都具有體細(xì)胞無性變異變異涉及到農(nóng)藝性狀、生化特征、抗病性和抗逆性、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的變異?？?/p>

4、以通過有性生殖傳遞給后代。外遺傳（epigenetic): 性狀的變異不是有DNA序列改變引起的植物表型變異，而是特定培養(yǎng)條件使某些基因表達(dá)調(diào)控發(fā)生變化所致，變異具有方向性，但不能通過有性生殖進(jìn)行傳遞。體細(xì)胞變異的植物第二節(jié)：植物體細(xì)胞無性系變異機(jī)理第二節(jié)：植物體細(xì)胞無性系變異機(jī)理在培養(yǎng)植物細(xì)胞和再生植株中發(fā)現(xiàn)各種不同變異存在，其在培養(yǎng)植物細(xì)胞和再生植株中發(fā)現(xiàn)各種不同變異存在，其中有些是可以遺傳的變異，被稱為體細(xì)胞無性系變異。中有些是可以遺傳的變異，被稱為體細(xì)胞無性系變異。細(xì)胞水平的變異：細(xì)胞水平的變異：分子水平的變異分子水平的變異一、細(xì)胞無性系細(xì)胞水平的變異一、細(xì)胞無性系細(xì)胞水平的變異（一）

5、染色體數(shù)目變化（一）染色體數(shù)目變化整倍體變異：姊妹染色體分離與細(xì)胞分裂不同步。非整倍體變異：姊妹染色體進(jìn)入相同的細(xì)胞。1. 1. 有絲分裂失敗或進(jìn)行無絲分裂有絲分裂失敗或進(jìn)行無絲分裂2. 2. 核內(nèi)有絲分裂，染色體復(fù)制而細(xì)胞并不分裂核內(nèi)有絲分裂，染色體復(fù)制而細(xì)胞并不分裂3. 3. 核內(nèi)核內(nèi)DNADNA復(fù)制而染色體并不復(fù)制，導(dǎo)致二分染色體和多復(fù)制而染色體并不復(fù)制，導(dǎo)致二分染色體和多線染色體的形成，二者恢復(fù)為正常染色體則也可能形成多線染色體的形成，二者恢復(fù)為正常染色體則也可能形成多倍體細(xì)胞。倍體細(xì)胞。4. 4. 有絲分裂時(shí)出現(xiàn)多極紡錘體，分裂完成后產(chǎn)生有絲分裂時(shí)出現(xiàn)多極紡錘體，分裂完成后產(chǎn)生3 3

6、個(gè)以上細(xì)胞。個(gè)以上細(xì)胞。細(xì)胞有絲分裂過程Plant CellAnimal Cell多倍體細(xì)胞的產(chǎn)生（二）染色體結(jié)構(gòu)變化染色體斷裂后經(jīng)過修復(fù)和重新聯(lián)結(jié)所形成的易位、倒位、缺失和重復(fù)是造成無性系變異的真正原因。二、分子水平的變化（一）核基因突變（一）核基因突變基因突變是指基因序列中堿基發(fā)生了改變，導(dǎo)致由一種遺傳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N遺傳狀態(tài)。Brettell 等（1986）從645株玉米雜種胚培養(yǎng)的再生植株中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)表現(xiàn)穩(wěn)定的Adh1（乙醇脫氫酶）位點(diǎn)變異體。由單堿基突變引起的：編碼106位的賴氨酸（AAG）突變?yōu)榻K止密碼子（TAG）。（二）DNA總量和DNA重復(fù)序列拷貝數(shù)的變異在水稻中，用DNA重復(fù)

7、序列進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，一些重復(fù)序列在組織培養(yǎng)中有顯著的選擇性擴(kuò)增，愈傷組織的DNA重復(fù)序列與葉片相比有5-70倍的拷貝數(shù)差異，而不同品種葉子間的差異只有2-3倍。亞麻的衛(wèi)星DNA小麥的rRNA(三）DNA甲基化有些植物細(xì)胞經(jīng)過離體培養(yǎng)后，基因組中的堿基會(huì)發(fā)生某種化學(xué)修飾，如甲基化，從而影響基因的表達(dá)。一般來說甲基化的程度與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。對(duì)對(duì)DNADNA甲基化，一般采用甲基化，一般采用CCGGCCGG位點(diǎn)的特異性限制內(nèi)位點(diǎn)的特異性限制內(nèi)切酶切酶Hpa II/Msp I Hpa II/Msp I 來進(jìn)行研究。來進(jìn)行研究。Hpa II Hpa II 識(shí)別并切割未識(shí)別并切割未甲基化的甲基化的CCG

8、GCCGG序列，但對(duì)甲基化的序列，但對(duì)甲基化的CGCG不起作用；不起作用；Msp I Msp I 識(shí)別并切割所有的識(shí)別并切割所有的CCGGCCGG序列。序列。（四）轉(zhuǎn)座子（四）轉(zhuǎn)座子（transposible elements) transposible elements) 的活化的活化能夠進(jìn)行自我復(fù)制、在染色體上能夠進(jìn)行隨機(jī)插入的能夠進(jìn)行自我復(fù)制、在染色體上能夠進(jìn)行隨機(jī)插入的DNADNA片段。片段。植物細(xì)胞組培過程中轉(zhuǎn)座子可能被激活而發(fā)生轉(zhuǎn)座和插入，引植物細(xì)胞組培過程中轉(zhuǎn)座子可能被激活而發(fā)生轉(zhuǎn)座和插入，引起體細(xì)胞無性變異。起體細(xì)胞無性變異。芭芭拉麥克林托克(McClintock B.，190

9、21992)“轉(zhuǎn)座因子”的概念麥克林托克早在1938年就已提出直到1976年，在美國(guó)冷泉港召開的“DNA插入因子、質(zhì)粒和游離基因”專題討論會(huì)上，與會(huì)科學(xué)家才明確地承認(rèn)可以用麥克林托克的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)座因子”1983年，瑞典皇家科學(xué)院諾貝爾獎(jiǎng)金評(píng)定委員會(huì)終于把這一年度的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了這位81歲高齡、不屈不撓的女科學(xué)家，麥克林托克也由此成為遺傳學(xué)研究領(lǐng)域第一位獨(dú)立獲得諾貝爾獎(jiǎng)的女科學(xué)家。決定被子植物花各個(gè)器官發(fā)育的基因共分為A、B、C三類。A類基因決定花的萼片和花瓣；B類基因決定花的花瓣和雄蕊；C類基因決定花的雄蕊和雌蕊。A A基因突變基因突變B B基因突變基因突變C C基因突變基因突變正常

10、擬南芥花正常擬南芥花A A類基因突變，形成了如右圖的雌蕊類基因突變，形成了如右圖的雌蕊 - - 雄蕊雄蕊 - - 雄蕊雄蕊 - - 雌蕊的異?；?。雌蕊的異?；?。B B類基因突變，形成如右圖的萼片類基因突變，形成如右圖的萼片 - - 萼片萼片 - - 雌蕊雌蕊 - - 雌蕊的異?；ā４迫锏漠惓；?。C C類基因突變，形成如右圖的萼片類基因突變，形成如右圖的萼片 - - 花瓣花瓣 - - 萼片萼片 - - 花瓣的異?；??；ò甑漠惓；?。（五）細(xì)胞質(zhì)基因突變離體培養(yǎng)條件可以使一些植物線粒體離體培養(yǎng)條件可以使一些植物線粒體DNADNA環(huán)狀構(gòu)象和分子環(huán)狀構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以及花藥愈傷組織再生植株的葉綠

11、體基因結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以及花藥愈傷組織再生植株的葉綠體基因部分丟失。部分丟失。雄性不育煙草小麥白化苗（六）DNA多態(tài)性的變化RAPD(random amplified polymorphic DNA)即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記，其基本原理與PCR技術(shù)一致。RAPD 技術(shù)是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板, 以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列( 通常為10 個(gè)堿基對(duì)) 為引物,在熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳

12、分離、溴化乙錠染色后,在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD 技術(shù)現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究上植物細(xì)胞經(jīng)過組培形成的愈傷組織往往存在RAPD. 說明DNA發(fā)生了組成的變化。第三節(jié)：細(xì)胞突變體的誘導(dǎo)和篩選植物的遺傳改良、遺傳研究和遺傳資源的拓寬一、細(xì)胞突變體篩選的意義突變、重組10-4在細(xì)胞水平上可以通過選擇壓力，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行定向誘發(fā)突變，使突變體的篩選在細(xì)胞水平上進(jìn)行，更為可控，誘變數(shù)量大，誘變幾率高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好?？共⌒浴⒖鼓嫘?、抗除草劑、抗氨基酸和氨基酸類似物突變體?？共⌒?、抗逆性、抗除草劑、抗氨基酸和氨基酸類似物突變體

13、。二、細(xì)胞突變體篩選的原理篩選的原理建立在有區(qū)別地殺死正常型細(xì)胞的基礎(chǔ)上。篩選的原理建立在有區(qū)別地殺死正常型細(xì)胞的基礎(chǔ)上。正篩選法、負(fù)篩選法、正篩選法、負(fù)篩選法、“綠島綠島”法法（一）篩選原理（一）篩選原理1. 1. 正篩選法正篩選法 把細(xì)胞群體置于某種選擇劑或選擇條件下，細(xì)胞突把細(xì)胞群體置于某種選擇劑或選擇條件下，細(xì)胞突變體可以正常生長(zhǎng)，正常型細(xì)胞不能生存而死亡，從而達(dá)到分離變體可以正常生長(zhǎng)，正常型細(xì)胞不能生存而死亡，從而達(dá)到分離目的的一種選擇方法。目的的一種選擇方法。一步篩選法：篩選單基因突變細(xì)胞多步篩選法：篩選多基因突變細(xì)胞2. 2. 負(fù)篩選法負(fù)篩選法先控制培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，使正常型細(xì)胞生

14、長(zhǎng)，而突變的細(xì)胞處于抑先控制培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，使正常型細(xì)胞生長(zhǎng)，而突變的細(xì)胞處于抑制不分裂狀態(tài)，然后用一種能毒害細(xì)胞生長(zhǎng)而對(duì)不分裂細(xì)胞無害的制不分裂狀態(tài)，然后用一種能毒害細(xì)胞生長(zhǎng)而對(duì)不分裂細(xì)胞無害的藥物淘汰正常細(xì)胞。藥物淘汰正常細(xì)胞。亞砷酸鹽、某些核苷酸類似物營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變體3.3.“綠島綠島”法法在整體的植株水平上，用某在整體的植株水平上，用某種化學(xué)物質(zhì)作用于植株葉片，種化學(xué)物質(zhì)作用于植株葉片，使細(xì)胞發(fā)生突變，葉片局部使細(xì)胞發(fā)生突變，葉片局部呈現(xiàn)綠色斑點(diǎn)，切下這部分呈現(xiàn)綠色斑點(diǎn)，切下這部分細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過培細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過培養(yǎng)細(xì)胞的再分化，使抗性細(xì)養(yǎng)細(xì)胞的再分化，使抗性細(xì)胞分化成完

15、整植株。胞分化成完整植株。（二）一般篩選程序（二）一般篩選程序1. 1. 確定選擇劑的濃度確定選擇劑的濃度 使90%以上培養(yǎng)物致死2. 2. 致死濃度篩選致死濃度篩選3. 3. 逐步篩選逐步篩選三、細(xì)胞突變體的篩選與利用三、細(xì)胞突變體的篩選與利用（一）富含氨基酸和氨基酸類似物細(xì)胞突變體（一）富含氨基酸和氨基酸類似物細(xì)胞突變體大豆缺失甲硫氨酸、玉米缺失賴氨酸和色氨酸、小麥缺失賴氨大豆缺失甲硫氨酸、玉米缺失賴氨酸和色氨酸、小麥缺失賴氨酸和蘇氨酸、水稻缺失賴氨酸。酸和蘇氨酸、水稻缺失賴氨酸。通過采用氨基酸和氨基酸類似物選擇抗性細(xì)胞突變體，達(dá)到改通過采用氨基酸和氨基酸類似物選擇抗性細(xì)胞突變體，達(dá)到改良

16、人類食物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)需要的目的。良人類食物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)需要的目的。高濃度的氨基酸或氨基酸類似物可以通過反饋性抑制與高濃度的氨基酸或氨基酸類似物可以通過反饋性抑制與氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶作用，而抑制植物細(xì)胞的正常氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶作用，而抑制植物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。高賴氨酸玉米、高甲硫氨酸沙打旺、蘆筍等。（二）抗病細(xì)胞突變體（二）抗病細(xì)胞突變體在離體條件下直接以毒素為選擇壓力篩選抗病細(xì)胞突變體，由這些在離體條件下直接以毒素為選擇壓力篩選抗病細(xì)胞突變體，由這些突變細(xì)胞進(jìn)一步再生出抗病植株。突變細(xì)胞進(jìn)一步再生出抗病植株。馬鈴薯晚疫病馬鈴薯晚疫病煙草野火病煙草野火病（三）抗除草劑細(xì)胞突變體（三）抗除草劑細(xì)胞突變體用含除草劑的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。用含除草劑的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。（四）抗逆細(xì)胞突變體（四）抗逆細(xì)胞突變體耐鹽、耐高溫、低溫、耐干旱、耐重金屬。耐鹽、耐高溫、低溫、耐干旱、耐重金屬。（五）單倍體細(xì)胞突變體（五）單倍體細(xì)胞突變體（六）其他性狀的選擇（六）其他性狀的選擇高產(chǎn)、品質(zhì)好、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)等優(yōu)良性狀。高產(chǎn)、品質(zhì)好