(完整版)影響PCR的因素

1、影響PCR反應(yīng)的條件(1)引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互 補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至 10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳， G+C過多易出現(xiàn)非特異 條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的喋吟或喀咤 核甘酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) ，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是 3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物 二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)

2、格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1lumol或10100Pmol,以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高 會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。(2)酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶， 另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)

3、增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。(3)dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀， 如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后， 以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5,小量分裝，-20C冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L ,尤其是注意4種dNTP的濃度 要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。(4)

4、模板(靶基因)核酸模板核酸的量與Z化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病 原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫鼠酸月瓜或蛋白酶 K法，要

5、防止RNase降解RNA。(5)Mg2+濃度Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特 異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。(6)溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈 DNA在9095c變性，再迅速冷卻至 4060C,引物退火并 結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為1

6、00300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94 c變性，65c左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93c94Clmin足以使模板DNA變性，若低于93c則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)?高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40 c60 C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板 之間的

7、碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度， 還有靶基序列的長度。 對于20個(gè)核甘酸，G+C含量約50%的引物，55 C 為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫 度：Tm 值（解鏈溫度）=4（G+C） +2（A+T） 復(fù)性溫度=Tm值-（510 C ） 在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 c 150核甘酸/S/酶分子70 C

8、 60核甘酸/S/酶分子55 C 24核甘酸/S/酶分子高于90c時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 7075c之間，常用溫度為 72C ,過高的延伸溫度不利于 引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般 1Kb以內(nèi) 的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至 15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。（7）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。一 般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異

9、性產(chǎn)物的量亦隨之增多。影響pcr特異性的因素通過上述內(nèi)容，可以看出有許多因素可以影響 pcr的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考： 退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交， 從而提高特異性。減短退火 時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸 。引物二聚體 是最常見的副產(chǎn)品，降低引物 及酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā) ，尤其是引物的二聚化。 改變mgcl2（有時(shí)kcl）濃度可以改 進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對 taq酶的直接作用。一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測， 有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型就會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。Trouble shooting

10、guide1 .假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)， 模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈， 特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程 出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适Щ虿粔蚨鴮?dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí) PCR時(shí)忘了加Taq酶

11、或電泳時(shí)忘了加澳化乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮 度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做 PCR有可能失敗，應(yīng)和引物 合成單位協(xié)商解決。 如一條引物亮度高， 一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物 使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效

12、。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR擴(kuò)增的特異性， 濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用白體積為20口30網(wǎng)50 口或100dl應(yīng)用多大體 積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如 20 口后，再做大 體積時(shí)，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。物理原因：溫度對 PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要。如果變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn) 假陰性；退火溫度過低， 可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高，影

13、響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失 使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。2 .假陽性引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新 設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染， 導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小

14、心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。3 .出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時(shí)，重新設(shè)計(jì)引物。減低