一種基于TaqMan探針?lè)ǖ内嫫槟c桿菌qPCR全自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)體系的建立

1、    一種基于taqman探針?lè)ǖ内嫫槟c桿菌qpcr全自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)體系的建立    王芬 劉寬 馬龍摘要 目的建立快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食物樣品中食源性致病菌的體系。方法配套湖州市微生物制劑與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的微生物分子檢測(cè)儀，建立一種基于taqman探針?lè)ǖ内嫫槟c桿菌qpcr檢測(cè)體系。結(jié)果體系建立成功，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率為-3.44，r2 =0.995 5，擴(kuò)增效率為95.3%。結(jié)論該qpcr體系特異性強(qiáng)，靈敏度高，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間，并具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性，為食品中阪崎腸桿菌的高通量和自動(dòng)化檢測(cè)提供了一個(gè)新的途徑。關(guān)鍵詞 阪崎腸桿菌；qpcr；全

2、自動(dòng)檢測(cè)中圖分類(lèi)號(hào) ts207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 a 文章編號(hào) 0517-6611（2017）34-0144-04abstract objectiveto establish a rapid and accurate detection system for foodborne pathogens in food samples.methoda qpcr detection system for enterobacter sakazakii based on taqman probe method was established，which was supported by the microb

3、ial molecular detector researched by key laboratory of huzhou mocrobilogical agents and agricultural products safety.resultthe system was successfully established and the standard curve slope，r2，amplification efficiency was 3.44，0.995 5，95.3%，respectively.conclusionthe qpcr detection system has stro

4、ng specificity，high sensitivity，good stability and repeatability，which could shorten the detection time greatly.the system provides a new way for high throughput and automated detection of e.sakazakii in food.key words enterobacter sakazakii； qpcr；automatic detection近年來(lái)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及一些食品安全事件的普遍發(fā)生，人們對(duì)食品

5、安全問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注。引起食品安全問(wèn)題的因素涉及方方面面，而微生物污染是導(dǎo)致食品安全問(wèn)題的重要原因之一，其中阪崎腸桿菌污染是一種廣泛存在的微生物污染。阪崎腸桿菌即克羅諾桿菌屬，耐酸、耐干燥、抗?jié)B透壓，在食品、飲料、加工材料、環(huán)境中廣泛存在并且很容易生存1-4。國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（icmsf）在2002年將阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群生命、引起長(zhǎng)期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的一種致病菌”5。該菌易引起腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和敗血癥等疾病，是引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，死亡率高達(dá)50%6-8 。因此，加強(qiáng)對(duì)食品中阪崎腸桿菌的檢測(cè)對(duì)于維護(hù)食品安全和維持人體健康尤其是嬰幼兒的健康具有非常重要的意義。目前

6、檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法已有很多，如普通微生物學(xué)檢測(cè)、基于-葡萄糖苷酶活性的檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)（elisa、 imb、 ifa）和分子檢測(cè)等。其中分子檢測(cè)法又包括普通 pcr、熒光定量 pcr 、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增 （lamp） 等方法9-10。國(guó)標(biāo)法對(duì)于阪崎腸桿菌的鑒定是增菌培養(yǎng)后以tsa平板上產(chǎn)生黃色素為基礎(chǔ)進(jìn)行生物檢測(cè)，而黃色素產(chǎn)生并不是阪崎腸桿菌所特有的，同時(shí)一些研究也表明，自然界中存在一些不產(chǎn)黃色素的阪崎腸桿菌11。與國(guó)標(biāo)法相比，qpcr檢測(cè)技術(shù)的特異性和靈敏度要強(qiáng)得多，并且時(shí)間會(huì)明顯縮短。該研究主要基于taqman探針?lè)╭pcr檢測(cè)技術(shù)，配套湖州市微生物制劑與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的微

7、生物分子檢測(cè)儀以完成阪崎腸桿菌檢測(cè)體系的建立。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株。試驗(yàn)總共涉及5種菌株，其名稱(chēng)與來(lái)源見(jiàn)表1。1.1.2 儀器與試劑。普通pcr儀為美國(guó)bio-rad公司生產(chǎn)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和加樣器均為德國(guó)eppendorf公司生產(chǎn)；微生物智能檢測(cè)設(shè)備為湖州市微生物制劑與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)設(shè)計(jì)；dna 提取試劑盒購(gòu)自湖州高億諾有限公司；pcr反應(yīng)試劑購(gòu)自大連寶生物（takara）公司；引物與探針為英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。1.2 方法1.2.1 阪崎腸桿菌 qpcr引物與探針。試驗(yàn)涉及引物與探針序列均來(lái)自于國(guó)家檢驗(yàn)檢疫總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)。引物序列為f：5

8、-gggatattgtcccctgaaacag-3，r：5-cgagaataagccgcgcatt-3；探針序列為5fam-agagtagtagttgtagaggccgtgcttccgaaag-bhq-1-3。1.2.2 細(xì)菌基因組dna提取。將各菌株的單菌落分別接種于lb培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)12 h完成細(xì)菌培養(yǎng)，利用細(xì)菌基因組dna提取試劑盒（gyn106-100t，高億諾）提取基因組dna。1.2.3 引物特異性驗(yàn)證。提取不同菌種的基因組dna，利用阪崎腸桿菌的引物和探針進(jìn)行qpcr驗(yàn)證，確定阪崎腸桿菌檢測(cè)引物的特異性。1.2.4 qpcr試驗(yàn)。反應(yīng)體系為premix ex taqtm （

9、rr390a，takara） 12.5 l，10 mol/l primer f 2 l，10 mol/l primer r 2 l，10 mol/l probe s 0.5 l，模板dna 2 l，depc處理水6 l，總體積25 l。反應(yīng)條件為95 30 s；95 5 s；60 30 s，40個(gè)循環(huán)，退火過(guò)程中收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。1.2.5 qpcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立。分別以阪崎腸桿菌基因組dna進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)贸⒘亢怂釡y(cè)定儀（biodrop lite）測(cè)定基因組的濃度，以基因組拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與反應(yīng)循環(huán)數(shù)（ct）之間建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?；蚩截悢?shù)的計(jì)算公式為：1.2.6 面包樣品的前處

10、理及基因組提取。取冷凍干燥后的面包樣品0.2 g加入到2 ml離心管中，依次加入100 l梯度稀釋的阪崎腸桿菌菌液，再加入900 l的超純水（將阪崎腸桿菌菌液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6種不同濃度的菌液），渦旋混勻后在4 ，12000r/min的條件下離心3 min，棄上清。再利用試劑盒（gyn106-100t，高億諾）提取基因組。1.2.7 面包加標(biāo)樣品的qpcr檢測(cè)。利用“1.2.6”中得到的基因組dna為模板，進(jìn)行qpcr驗(yàn)證。2 結(jié)果與分析2.1 阪崎腸桿菌檢測(cè)引物的特異性分別提取阪崎腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌5

11、種菌株的基因組，以該5種菌株的基因組為qpcr模板，進(jìn)行qpcr試驗(yàn)。引物與探針均為阪崎腸桿菌專(zhuān)屬的引物與探針。由圖1可知，僅有阪崎腸桿菌的基因組模板有對(duì)應(yīng)的ct值，fam 通道有明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)；單增李斯特菌、副溶血性弧菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌4種菌株基因組模板對(duì)應(yīng)的通道沒(méi)有明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，說(shuō)明阪崎腸桿菌引物的特異性較好，且擴(kuò)增體系無(wú)污染。所得擴(kuò)增片段送往上海生工測(cè)序后證實(shí)確為阪崎腸桿菌片段。2.2 阪崎腸桿菌qpcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的靈敏度與重復(fù)性2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立。將阪崎腸桿菌基因組dna 10倍梯度稀釋后，作為qpcr模板dna，進(jìn)行qpcr試驗(yàn)。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)（copi

12、es）為橫坐標(biāo)，ct值作為縱坐標(biāo)建立阪崎腸桿菌qpcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2所示。利用該qpcr體系檢測(cè)阪崎腸桿菌，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率為 -3.44，r2=0.995 5，擴(kuò)增效率e為95.3%。2.2.2 qpcr體系的重復(fù)性試驗(yàn)。為驗(yàn)證該檢測(cè)體系的重復(fù)性，人工污染面包后，提取各不同稀釋梯度的人工污染面包的基因組，分別每隔12 h進(jìn)行1次qpcr檢測(cè)，總共3次，每次3個(gè)重復(fù)。由表2可知，3次重復(fù)的變異系數(shù)為1.30%3.89%，結(jié)果顯示該qpcr體系有良好的重復(fù)性。2.2.3 模擬樣本檢測(cè)。將加有不同稀釋梯度阪崎腸桿菌原菌液的面包樣品的宏基因組直接作為pcr模板dna，進(jìn)行pcr電泳驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果如

13、圖3所示。從圖中可以明顯看出條帶的亮度逐漸變暗，表明面包的人工污染成功。再將加標(biāo)面包樣品的宏基因組直接作為qpcr模板dna，進(jìn)行qpcr試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，未增菌的面包加標(biāo)樣品在系列梯度稀釋下，阪崎腸桿菌在379.33×105 拷貝/ml濃度條件下均有明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，因此實(shí)際樣品中的最低檢測(cè)限為37拷貝/ml。3 討論與結(jié)論qpcr技術(shù)因具有快速、靈敏性高、特異性好等特點(diǎn)，近年來(lái)在食源性病原微生物的快速檢測(cè)中大受歡迎，是一種可靠的檢測(cè)方法。該技術(shù)定量和擴(kuò)增同步進(jìn)行，克服了pcr的平臺(tái)效應(yīng)，有效解決了傳統(tǒng)pcr只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限性15。該試驗(yàn)以食源性致病微生物中常見(jiàn)的

14、阪崎腸桿菌為供試菌株，針對(duì)湖州市微生物制劑與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的微生物分子檢測(cè)儀，成功建立了一種配套該儀器的阪崎腸桿菌qpcr檢測(cè)體系。通過(guò)特異性、敏感性、重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果表明該試驗(yàn)建立的檢測(cè)體系具有較好的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。根據(jù) sn/t 1870201616，樣品在檢測(cè)前需經(jīng)過(guò)二次增菌才能進(jìn)行基因組提取，整個(gè)qpcr檢測(cè)過(guò)程至少需要3 d；gb 4789.4201617中的傳統(tǒng)培養(yǎng)法以分離培養(yǎng)和生化鑒定為主，最快也需要4 d；黃燾等18用taq man-mgb 探針?lè)▽?duì)食品樣品中阪崎腸桿菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)時(shí)（不包括增菌過(guò)程）最快需要10 h；而在該研究建立的檢測(cè)體系中，樣

15、品的前處理只需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單增菌，不必經(jīng)過(guò)增菌后的選擇培養(yǎng)，可直接提取基因組進(jìn)行檢測(cè)，并且該試驗(yàn)配套食品有害微生物智能檢測(cè)設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)樣品富集與處理、核酸提純、靶基因定量、分析等步驟一體化，是全封閉、一體式自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，可以保證樣品和試驗(yàn)操作的安全性，降低檢測(cè)過(guò)程污染風(fēng)險(xiǎn)，也可降低人工操作引起的誤差，且對(duì)從業(yè)人員的專(zhuān)業(yè)素養(yǎng)要求不高。該體系的檢測(cè)通量為192個(gè)樣本/（d·臺(tái)），整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)16 h，這樣不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，又有著常規(guī)檢測(cè)方法和快速檢測(cè)裝備所不能實(shí)現(xiàn)的高通量，為食源性致病菌檢測(cè)提供了理想的平臺(tái)。seo等19建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法靈敏性為100 cfu/ml；張朝

16、20在用熒光定量qpcr檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的研究中的測(cè)限可以達(dá)14.117拷貝/l；而該研究建立的檢測(cè)體系靈敏度達(dá)37拷貝/ml，且樣品的前處理不必經(jīng)過(guò)增菌后的選擇培養(yǎng)，直接提取基因組的優(yōu)勢(shì)更為明顯。該qpcr檢測(cè)體系的特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，檢測(cè)下限較低，可以明顯提高檢測(cè)效率和檢測(cè)通量，該體系的建立可為阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)提供新的參考。但仍不能排除結(jié)果中的假陽(yáng)性，即檢測(cè)樣品中死菌與活菌的區(qū)分，另外，是否所有食品樣品都適合不經(jīng)過(guò)增菌后的選擇培養(yǎng)的前處理這一問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1 林玉宙.mlst技術(shù)在嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌鑒定中的應(yīng)用d.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2015

17、：1-2.2 裴曉燕，劉秀梅.中國(guó)市售配方粉中阪崎腸桿菌和其它腸桿菌的污染狀況j.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006，6（5）：6-10.3 kandhai m c，heuvelink a e，reij m w，et al.a study into the occurrence of cronobacter spp.in the netherlands between 2001 and 2005j.food control，2010，21（8）：1127-1136.4 friedemann m.enterobacter sakazakii in food and beverages（other than

18、infant formula and milk powder）j.international journal of food microbiology，2007，116（1）：1-105icmsf.microbiological testing in food safety management：volume 7r.new york：academic/plenum publishers，2002.6 zhou x f，fu s z，gao j x，et al.enterobacter sakazakii：an emerging foodborne pathogenic bacateriumj.

19、annals of microbiology，2012，62（1）：1-5.7 muytjens h l，kolle l a.enterobacter sakazakii meningitis in neonates：causative role of formula？j.pediatr infect dis j，1990，9（5）：372-373.8 centers for disease control and prevention （cdc）.enterobacter sakazakii infections associated with the use of powdered inf

20、ant formulatennessee，2001j.mmwr，2002，51（14）：297-300.9 朱英蓮.阪崎腸桿菌免疫磁性富集及快速檢測(cè)方法研究d.青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2015：2-11.10 王翔，祝長(zhǎng)青，徐幸蓮，等.阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）分子檢測(cè)方法 研究進(jìn)展j.食品科學(xué)，2011，32（13）：350-354.11 lversen c，forsythe s j.comparison of media for the isolation of enterobacter sakazakiij.appl environ microbiol，2007，73（1）：48-52.12

21、 garrido a，chapela m j，ferreira m m，et al.development of a multiplex realtime pcr method for pathogenic vibrio parahaemolyticus detection （tdh+and trh+）j.food control，2012，24（1/2）：128-135.13 zeng h y，zhang j m，li c s，et al.the driving force of prophages and crisprcas system in the evolution of cronobacter sakazakiij.scientific reports，2017，7：1-2.14