試驗(yàn)二細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察海南大學(xué)PPT課件

1、實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察第1頁(yè)/共108頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察細(xì)菌的菌落特征 掌握簡(jiǎn)單染色法和細(xì)菌涂片方法 在油鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)特征第2頁(yè)/共108頁(yè) 形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀察。 細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。 細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況、排列方式、好氣性和運(yùn)動(dòng)性直接相關(guān)。 細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類

2、型：簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色。二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第3頁(yè)/共108頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)的基本原理 簡(jiǎn)單染色法原理：細(xì)菌在中性的環(huán)境中帶負(fù)電荷，用堿性染料（解離時(shí)帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等進(jìn)行染色。 采用加熱或化學(xué)固定兩種方法，使菌體粘附于玻片上，并且增加菌體對(duì)染料的親和力第4頁(yè)/共108頁(yè)三、 實(shí)驗(yàn)材料 顯微鏡（顯微鏡燈）、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。 0.05% 和0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液，0.5%番紅染液，中性紅染液，二甲苯，生理鹽水 細(xì)菌三種形態(tài)的染色標(biāo)本。 大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，哈氏弧菌和無(wú)乳鏈球菌24h24h液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物 蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。第5頁(yè)/共108頁(yè) 簡(jiǎn)

3、單染色法（一般染色法） .菌種：牙垢細(xì)菌 .涂片 .干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。 固定 .染色：在整個(gè)涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色分鐘 。 .水洗：傾去染液，用自來(lái)水細(xì)流沖洗至流下的水中無(wú)染料顏色為止。 干燥：空氣中自然干燥。 鏡檢：在油鏡下觀察牙垢中的各種細(xì)菌形態(tài)并繪圖。四、實(shí)驗(yàn)步驟第6頁(yè)/共108頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)步驟 油鏡的使用 1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 2.調(diào)節(jié)光亮度 3.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào) 4.依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察 5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。 6.換片：另?yè)Q新片，

4、必須從第三條開始操作。 7.用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。第7頁(yè)/共108頁(yè) 顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)： 1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件, ,以免損壞。 2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度 3.觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 4.觀察時(shí)，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。 5.拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂

5、，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。四、實(shí)驗(yàn)步驟第8頁(yè)/共108頁(yè)細(xì)菌三種基本形態(tài)的觀察： 菌落形態(tài)觀察和個(gè)體形態(tài)觀察，這里主要指?jìng)€(gè)體形態(tài)的觀察。 1. 結(jié)合油鏡的使用，觀察三張細(xì)菌染色片（球狀菌、桿狀菌、和螺旋狀菌），邊觀察邊繪圖。 2. 看示范鏡：觀察雙球菌、四聯(lián)球菌，并繪圖。四、實(shí)驗(yàn)步驟第9頁(yè)/共108頁(yè)思 考 題 油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？ 使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？ 鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？第10頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的革蘭氏染色第11頁(yè)/共10

6、8頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握細(xì)菌的革蘭氏染色 進(jìn)一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù) 觀察和識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造第12頁(yè)/共108頁(yè) 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成存在差異，因此不同細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色有不同的反應(yīng)（陽(yáng)性和陰性）： 革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多脂類，肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，當(dāng)以95%酒精脫色時(shí)，脂類被溶解除去，使得細(xì)胞壁空隙變大，肽聚糖因95%酒精處理，其孔徑會(huì)縮小，但由于肽聚糖含量較少，細(xì)胞壁孔徑縮小有限，使得結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物被95%酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，并被隨后的紅色復(fù)染劑染成紅色； 革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，脂類含量少，經(jīng)95%酒精脫色處理后，肽聚糖層的孔徑縮

7、小，通透性降低，使得結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物很難被95%酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，呈現(xiàn)紫色。二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第13頁(yè)/共108頁(yè)顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，吸水紙，染色缸等。染色劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液，盧（路）哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液。菌種：哈氏弧菌和鰻弧菌24h普通海水瓊脂斜面28培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌24h牛肉膏瓊脂斜面28培養(yǎng)物。三、實(shí)驗(yàn)材料第14頁(yè)/共108頁(yè) 革蘭氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水

8、沖洗至無(wú)紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。 4. 脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。 5. 復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 6. 鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。四、實(shí)驗(yàn)步驟第15頁(yè)/共108頁(yè)思考題 要得到正確的革蘭氏染色結(jié)果必須注意哪些操作？關(guān)鍵在哪幾步？為什么？第16頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及人體表面的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及人體表面的微生物檢查微生物檢查第17頁(yè)/共108頁(yè) 認(rèn)識(shí)細(xì)菌分布的廣泛性； 掌握對(duì)菌落識(shí)別； 懂得無(wú)菌操作的重要性。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?8頁(yè)/共108頁(yè) 每一菌體在適宜條件

9、下，經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞分裂可形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞集合體，稱為菌落。 由于不同細(xì)菌其個(gè)體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理和生化等特征不同，當(dāng)一個(gè)菌體經(jīng)分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈現(xiàn)其固有的特點(diǎn)。 通過(guò)合適的方法，將自然環(huán)境中的微生物接種到平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后觀察平板上的菌落，就可以檢查環(huán)境中及人體細(xì)菌的數(shù)量和類型。二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第19頁(yè)/共108頁(yè) 無(wú)菌試管，無(wú)菌吸管，無(wú)菌空培養(yǎng)皿，細(xì)菌計(jì)數(shù)器，蠟筆，玻片，消毒牙簽，酒精燈，接種環(huán)，無(wú)菌棉拭子等。 瓊脂平板培養(yǎng)基，高層瓊脂培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水，2碘酒，75乙醇，普通瓊脂平板，血瓊脂平板，革蘭氏染色劑。 水樣，泥土，空氣和人體。三、實(shí)驗(yàn)材料第20頁(yè)/共

10、108頁(yè) 1、正常人體的細(xì)菌檢查 皮膚細(xì)菌的檢查 （1）將手指在平板上按一下；取一根頭發(fā)，用無(wú)菌鑷子貼放在平板上。 （2）平板培養(yǎng)、觀察四、實(shí)驗(yàn)步驟第21頁(yè)/共108頁(yè) 咽部細(xì)菌的檢查 （1）用無(wú)菌棉拭子蘸取咽部分泌的液體，然后將該棉拭子在血瓊脂平板一端涂抹，接下來(lái)用接種環(huán)以涂抹處為起點(diǎn)，在平板上畫之字形圖案進(jìn)行分離。 （2）將血瓊脂平板置37培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1824h，挑選不同菌落作革蘭氏染色，鏡檢。四、實(shí)驗(yàn)步驟第22頁(yè)/共108頁(yè) 牙垢中細(xì)菌的檢查 （1）用消毒牙簽剔牙垢少許，置于玻片中央。 （2）加少許生理鹽水將牙垢混勻，涂成薄層，用酒精燈干燥固定。 （3）革蘭氏染色，鏡撿。四、實(shí)驗(yàn)步驟第

11、23頁(yè)/共108頁(yè) 2、空氣中細(xì)菌的檢查 （1）取4個(gè)無(wú)菌操作制備的瓊脂平板，將3個(gè)分別置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)、走廊、窗臺(tái)等位置，并打開皿蓋放置1530min后，蓋好皿蓋；另外1個(gè)不打開皿蓋作為對(duì)照。 （2）將上述4個(gè)瓊脂平板置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h。四、實(shí)驗(yàn)步驟第24頁(yè)/共108頁(yè) 3. 水中細(xì)菌的檢查 （1）十倍梯度稀釋 （2）稀釋水樣與培養(yǎng)基混合倒平板 （3）培養(yǎng)、觀察。四、實(shí)驗(yàn)步驟第25頁(yè)/共108頁(yè) 對(duì)各種來(lái)源的樣品進(jìn)行對(duì)比，如平板菌落數(shù)和菌落類型等？ 飯前為何要洗手？ 如何防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴(kuò)散方面？思考題第26頁(yè)/共108頁(yè)實(shí) 驗(yàn) 四 培養(yǎng)基的配制與滅菌第27頁(yè)/共108頁(yè)一、

12、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。 2.掌握培養(yǎng)基和無(wú)菌水的制備方法。 3.掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。第28頁(yè)/共108頁(yè) 培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長(zhǎng)代謝的需要配制成的一種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足微生物生長(zhǎng)發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素以及某些特需的微量元素外還應(yīng)具有適宜的酸堿度pH值、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。 二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第29頁(yè)/共108頁(yè)(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10NaOH溶液、l0鹽酸溶液、瓊脂、水(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、pH試紙、試管、分裝漏

13、斗、棉花。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱。三、實(shí)驗(yàn)材料第30頁(yè)/共108頁(yè) 一、玻璃器皿的洗滌和包裝 清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。 棉塞的制作 包裝培養(yǎng)皿和移液管等。 2-1棉塞制作方法2-2移液管滅菌前的包裝四、實(shí)驗(yàn)步驟第31頁(yè)/共108頁(yè)二、培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 （一）培養(yǎng)基配方： 牛肉膏2.5g 蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、瓊脂10.0g、自來(lái)水500mL、pH7.27.4。 （二）操作步驟： 1. 取一個(gè)1000mL燒杯，裝500mL蒸餾水。 2. 按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a. 前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分 b. 蛋白

14、胨、肉膏可加熱促進(jìn)溶解 c. 加熱過(guò)程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補(bǔ)充因蒸發(fā)而損失的水量。第32頁(yè)/共108頁(yè) 3. 調(diào)pH值：用10 NaOH調(diào)pH至7.27.4，用精密pH試紙對(duì)照。 4.過(guò)濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。 5. 分裝：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染(見(jiàn)圖23)。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面（圖24）。分裝入錐形瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的3/53/5為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/

15、3為宜滅菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。 7. 滅菌備用：滅菌條件：1210C（相當(dāng)蒸汽壓力0.103MPa）培養(yǎng)基滅菌后必須在37下恒溫培養(yǎng)24h，確定無(wú)菌生長(zhǎng)，方可使用。第33頁(yè)/共108頁(yè)圖 例圖23培養(yǎng)基分裝 圖24 斜面制作第34頁(yè)/共108頁(yè) 三、稀釋水的制備 1.取一個(gè)250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶?jī)?nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。 2.另取5支18mm180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。 無(wú)菌稀釋水為微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。第35頁(yè)/

16、共108頁(yè) 四、滅菌 加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。 干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器 干熱滅菌的操作方法 a. 將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至160并維持2h； b. 把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到50左右，才能將物品取出。第36頁(yè)/共108頁(yè)濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法 高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下： 1. 滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。 2. 將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。 注意：器物不能裝得太滿。 3. 接通電源，進(jìn)行加熱。 4. 排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計(jì)指示溫度為100時(shí)關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時(shí)關(guān)閉排氣閥。第37頁(yè)/共108頁(yè)

17、 5. 當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為121)即開始滅菌，使其維持1530min。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2) ，延長(zhǎng)時(shí)間。 6. 滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。 7. 待培養(yǎng)基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無(wú)菌生長(zhǎng)則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。?8頁(yè)/共108頁(yè)間歇滅菌法： 即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅菌。 操作方法： a. 待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100煮沸3060min，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。 b.

18、在每?jī)纱握糁笾g，將物品（指培養(yǎng)基）放在37恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)殺滅。 c. 第三次蒸煮之后基本無(wú)菌，但為了確保無(wú)菌仍要放在 37恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無(wú)菌才能使用。第39頁(yè)/共108頁(yè) 過(guò)濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行除菌。用于除菌的濾器：a.蔡氏濾器，b.注射器裝置濾器第40頁(yè)/共108頁(yè) 1.配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么? 2.培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培 養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌檢查？ 3.3.高壓蒸汽滅菌

19、中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才能打開鍋蓋? 思考題第41頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)第42頁(yè)/共108頁(yè) 1.掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。 2.掌握幾種接種技術(shù)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?3頁(yè)/共108頁(yè) 無(wú)菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)10套、無(wú)菌移液管1mL2支、10mL1支。 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無(wú)菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。二、實(shí)驗(yàn)材料第44頁(yè)/共108頁(yè)一、細(xì)菌的純種分離 三、實(shí)驗(yàn)步驟第45頁(yè)/共1

20、08頁(yè)(一)稀釋平板法 1. 取樣 用無(wú)菌錐形瓶到現(xiàn)場(chǎng)取一定量的湖水，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。 2. 稀釋水樣 將1瓶90mL和5管9mL無(wú)菌水排列好，用記號(hào)筆依次編上101、 102、103、104、105、106。在無(wú)菌操作條件下，用10mL的無(wú)菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號(hào)為101無(wú)菌水(內(nèi)含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為101濃度的菌液。用1mL無(wú)菌移液管吸取1mL 101濃度的菌液于編號(hào)為102無(wú)菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為102濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到106 。第46頁(yè)/共108頁(yè)稀釋液的制備10mL試樣 90mL蒸餾水第4

21、7頁(yè)/共108頁(yè) 3. 平板的制作 取10套無(wú)菌培養(yǎng)皿編號(hào)， 104、105、106各3個(gè)，另一個(gè)為空氣對(duì)照。 取1支1mL無(wú)菌移液管從濃度小的菌液開始，以106、105、104為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。第48頁(yè)/共108頁(yè) 加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。 a:皿法皿法

22、b:倒平倒平板板第49頁(yè)/共108頁(yè) 取對(duì)照無(wú)菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。第50頁(yè)/共108頁(yè) 1. 平板制作：將融化并冷至約50的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。 2. 劃線：用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果。第51頁(yè)/共108頁(yè)平板劃線分離的劃線方法 左：連續(xù)劃線法（1，2依次劃線的起點(diǎn)）右：分區(qū)劃線法（1

23、，2，3，4依次劃線的起點(diǎn)）第52頁(yè)/共108頁(yè) 接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。 接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。第53頁(yè)/共108頁(yè) 左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時(shí)向上) 。右手將棉塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。 右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過(guò)火滅菌。 將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無(wú)名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍?shī)A在手中，然后讓試管口緩緩過(guò)火焰。123第

24、54頁(yè)/共108頁(yè) 將已灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。45678第55頁(yè)/共108頁(yè)1.液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液)：用接種環(huán)挑取斜面菌種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅滅菌。2.穿刺接種法(從斜面菌種接入(半)固體培養(yǎng)基)：用接種針經(jīng)火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后

25、穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。第56頁(yè)/共108頁(yè)1.稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法2.倒平板：將融化并冷至50左右的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板3.用無(wú)菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)志樣品液于平板上，換上無(wú)菌玻璃刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻4.將培養(yǎng)皿正擺在恒溫箱中，調(diào)節(jié)一定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。如果培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落。第57頁(yè)/共108頁(yè)（四）液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基 接種工具：無(wú)菌移液管和無(wú)菌滴管 移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌 用無(wú)菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接 到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即

26、可。第58頁(yè)/共108頁(yè) 1. 斜面接種取菌前為什么要將灼燒過(guò)的接種針在無(wú)菌培養(yǎng)基上沾一下？ 2.2.用一根無(wú)菌移液管接種幾種濃度的水樣時(shí)，應(yīng)從哪個(gè)濃度開始？為什么？思考題第59頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)六 微生物細(xì)胞的計(jì)數(shù)第60頁(yè)/共108頁(yè) 1. 1.了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù)原理。 2 2、掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?1頁(yè)/共108頁(yè) 測(cè)定微生物數(shù)量方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，又稱血球計(jì)數(shù)板，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。二

27、、實(shí)驗(yàn)的基本原理第62頁(yè)/共108頁(yè)血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造第63頁(yè)/共108頁(yè)血球計(jì)數(shù)板的計(jì)算方法 血球計(jì)數(shù)板上刻有一長(zhǎng)寬各為1 1毫米的方形大格，其體積為0.1mm0.1mm3 3。計(jì)數(shù)板有兩種刻度，一種是每大格分為1616個(gè)中格，而每中格又分2525個(gè)小格，每大格為16162525小格=400=400小格，而另一種，則是每大格分為2525個(gè)中格，而每中格又分為1616個(gè)小格，則每大格為252516=40016=400小格（計(jì)數(shù)板上的標(biāo)識(shí)為XBXBK25K25） 計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格（即100個(gè)小格）的酵母菌數(shù)。如果使用25 格

28、16格規(guī)格的計(jì)數(shù)室除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。(6)當(dāng)遇到位于大格線上的酵母菌，一般只計(jì)數(shù)大方格的上方和左方線上的酵母細(xì)胞(或只計(jì)數(shù)下方和右方線上的酵母細(xì)胞)。第64頁(yè)/共108頁(yè)計(jì)數(shù)公式 (1)1625的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式： 酵母細(xì)胞數(shù)ml=（100小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù) 100）40010000稀釋倍數(shù) (2)25x16的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式： 酵母細(xì)胞數(shù)ml=（80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)80）40010000稀釋倍數(shù)第65頁(yè)/共108頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)器材 顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酵母菌液、蓋玻片、吸管、吸水紙。第66頁(yè)/共108頁(yè)操作步驟1. 1. 鏡檢計(jì)數(shù)室

29、 對(duì)計(jì)數(shù)板進(jìn)行鏡檢。若有污物，則用自來(lái)水沖洗，用電吹風(fēng)吹干后 才能 進(jìn)行計(jì)數(shù)。2. 2. 加樣品 在血球計(jì)數(shù)板上蓋上蓋玻片, , 用滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴, ,菌液會(huì)自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，靜置5 5分鐘。3. 3. 計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室的位置，再換高倍鏡計(jì)數(shù)。 2525個(gè)中格的取計(jì)數(shù)板四角和中間位置的五個(gè)中方格計(jì)菌數(shù)。重復(fù)計(jì)2-32-3次，取其平均值，按公式計(jì)算每毫升酵母菌液中菌體的個(gè)數(shù)。4.4.清洗血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)后將血球計(jì)數(shù)板用自來(lái)水沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌干凈為止。第67頁(yè)/共108頁(yè)結(jié)果記錄 第一個(gè)第一個(gè)

30、中格中格第二個(gè)第二個(gè)中格中格第三個(gè)第三個(gè)中格中格第四個(gè)第四個(gè)中格中格第五個(gè)第五個(gè)中格中格第一次第一次測(cè)測(cè) 定定第二次第二次測(cè)測(cè) 定定第三次第三次測(cè)測(cè) 定定平平 均均第68頁(yè)/共108頁(yè) 1. 1.使用血球計(jì)數(shù)板應(yīng)注意什么問(wèn)題? ? 2. 2.試分析影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差來(lái)源并提出改進(jìn)措施思考題第69頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定第70頁(yè)/共108頁(yè) 1. 1.了解大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線特征和繁殖規(guī)律，并學(xué)會(huì)繪制生長(zhǎng)曲線； 2. 2. 學(xué)習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?1頁(yè)/共108頁(yè) 將少量細(xì)菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的

31、條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，所繪制的曲線叫生長(zhǎng)曲線。它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)規(guī)律。 細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度，并將所測(cè)的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線，二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第72頁(yè)/共108頁(yè) 722型分光光度計(jì)，恒溫振蕩搖床，無(wú)菌試管，無(wú)菌吸管等。 LB液體培養(yǎng)基。 大腸桿菌。三、實(shí)驗(yàn)材料第73頁(yè)/共108頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 250mL三角瓶11個(gè)，分別編號(hào)為0、1.5、3、4、6、8、10、1

32、2、14、16、20h。 2.大腸桿菌接入盛有50mL LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。 3. 分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間將三角瓶取出，立即于4條件下貯存，待所有培養(yǎng)結(jié)束時(shí)一同測(cè)定OD值。第74頁(yè)/共108頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)步驟 4. 將未接種的LB液體培養(yǎng)基倒入比色杯中，選用600nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)零點(diǎn)，作為空白對(duì)照，并對(duì)不同時(shí)間培養(yǎng)液從0h起依次進(jìn)行測(cè)定，對(duì)濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其OD值在0.100.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測(cè)得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。第75頁(yè)/共108頁(yè) 如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長(zhǎng)曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同?兩者各有什么缺點(diǎn)？ 次生禮謝產(chǎn)物的大量

33、積累在哪個(gè)時(shí)期?根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多?思考題第76頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 細(xì)菌的生理生化反應(yīng)細(xì)菌的生理生化反應(yīng)大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)第77頁(yè)/共108頁(yè)1、證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子的水解能力不同，從而說(shuō)明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2、掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。3、了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用。4、掌握通過(guò)糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。5、了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?8頁(yè)/共108頁(yè)1、微生物對(duì)生物大分子的分解利用淀粉水解：淀粉酶油脂水解：脂肪

34、酶明膠液化：蛋白酶石蕊牛乳試驗(yàn)：產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、胨化、酸凝固等。產(chǎn)酸：溴甲酚紫指示劑大腸桿菌：產(chǎn)氣腸桿菌：產(chǎn)氣：杜氏小管檢測(cè)大腸桿菌：產(chǎn)氣腸桿菌：二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第79頁(yè)/共108頁(yè)IMViC試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)： 甲基紅試驗(yàn)（M.R.試驗(yàn)）： 伏-普試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇試驗(yàn)）： 檸檬酸鹽試驗(yàn)：色氨酸酶：色氨酸吲哚對(duì)二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（紅色）大腸桿菌：產(chǎn)氣腸桿菌：產(chǎn)酸能力：強(qiáng)，甲基紅變紅；弱：甲基紅不變色大腸桿菌：陽(yáng)性產(chǎn)氣腸桿菌：陰性葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇2,3-丁二醇乙酰甲基甲醇OH二乙酰精氨酸的胍基紅色化合物大腸桿菌：陽(yáng)性產(chǎn)氣腸桿菌：陰性能否利用檸檬酸作為碳源大腸桿菌：陰性產(chǎn)氣腸桿菌：陽(yáng)性第

35、80頁(yè)/共108頁(yè)1、菌種：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），普通變形桿菌（Proteus vularis），產(chǎn)氣腸桿菌。2、培養(yǎng)基：固體油脂培養(yǎng)基，固體淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基試管，石蕊牛奶試管，尿素瓊脂試管、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3支，普通變形桿菌（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管） ，蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基，醋酸鉛培養(yǎng)基。3、溶液或試劑：革蘭氏染色用盧氏碘液（Lugols iodine solution），甲基紅指示劑，40% KOH，5% -萘酚，乙醚，吲哚試劑等。 4、儀器或

36、其他用具：無(wú)菌平板，無(wú)菌試管，接種環(huán)，接種針，試管架。三、實(shí)驗(yàn)材料第81頁(yè)/共108頁(yè)1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗(yàn)n 淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基平板菌種：大腸桿菌和枯草芽孢桿菌方法：平板上劃“十”字接種注意：接種前在平板底部作記號(hào)；“十”字不要太大n 油脂水解試驗(yàn)培養(yǎng)基：油脂培養(yǎng)基平板菌種：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌方法：平板上劃折線接種注意：接種前在平板底部作記號(hào)n 明膠液化試驗(yàn)培養(yǎng)基：試管明膠培養(yǎng)基菌種：大腸桿菌或 產(chǎn)氣腸桿菌方法：穿刺接種注意：20培養(yǎng)n 石蕊牛乳試驗(yàn)培養(yǎng)基：試管石蕊牛乳培養(yǎng)基（2支）菌種：粘乳產(chǎn)堿菌或銅綠假單胞菌方法：斜面劃線接種注意：觀察結(jié)構(gòu)注意牛乳產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固、

37、胨化現(xiàn)象是連續(xù)出現(xiàn)的。四、實(shí)驗(yàn)步驟第82頁(yè)/共108頁(yè)1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗(yàn)2、糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝杜氏小管）（各3支）菌種：大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌方法：分別接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基四、實(shí)驗(yàn)步驟第83頁(yè)/共108頁(yè)1、細(xì)菌水解大分子物質(zhì)試驗(yàn)2、糖發(fā)酵試驗(yàn)3、IMViC試驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)步驟第84頁(yè)/共108頁(yè)IMViC試驗(yàn)第85頁(yè)/共108頁(yè)1、不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？2、假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？3、為什么大腸桿菌的甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？這個(gè)試驗(yàn)與伏普試驗(yàn)最初底物與最終產(chǎn)物有何異同之處

38、？4、說(shuō)明在硫化氫試驗(yàn)中醋酸鉛的作用，可以用哪種化合物代替醋酸鉛？ 思考題第86頁(yè)/共108頁(yè)實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九菌種的保藏菌種的保藏第87頁(yè)/共108頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)和掌握菌種保藏的基本原理; 2. 比較和掌握幾種不同菌種保藏的方法。第88頁(yè)/共108頁(yè) 微生物個(gè)體微小、代謝活躍、生長(zhǎng)繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異，被其他雜菌污染，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此，菌種的長(zhǎng)期保藏對(duì)任何微生物學(xué)工作者都很重要，也是非常必要的。人為地創(chuàng)造低溫、缺氧、干燥、缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等不良條件，抑制微生物的生長(zhǎng)、繁殖，使其處于休眠狀態(tài)，從而可以較長(zhǎng)時(shí)間保持菌種不死亡和不變異。二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第89頁(yè)/共108頁(yè) 幾

39、種常用的保藏方法： 1、傳代培養(yǎng)法 保藏的菌種通過(guò)斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放。 可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟來(lái)進(jìn)一步延長(zhǎng)保存期。 2、載體法 使生長(zhǎng)合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第90頁(yè)/共108頁(yè) 3、懸液法 將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。 4、冷凍法 使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。 此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護(hù)

40、劑的使用。 5、真空干燥法 這類方法包括冷凍真空干燥法和L干燥法。 冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。 L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在1020C范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。二、實(shí)驗(yàn)的基本原理第91頁(yè)/共108頁(yè) 試管，棉塞，研體，燒杯，pH試紙，干燥器，高壓滅菌鍋，干燥箱，培養(yǎng)箱，真空泵，接種針，超凈工作臺(tái)，酒精燈，火柴，凍存管，安瓿管，吸管。 甘油，液體石蠟，干冰，培養(yǎng)基等。 哈氏弧菌。三、實(shí)驗(yàn)材料第92頁(yè)/共108頁(yè)1 1、斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），

41、置4C4C冰箱中包藏。 保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2 24 4個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。四、實(shí)驗(yàn)步驟第93頁(yè)/共108頁(yè) 2、液體石蠟保藏法 將無(wú)菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。 將試管直立，置低溫或室溫下保存。 此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4冰箱存放。四、實(shí)驗(yàn)步驟第94頁(yè)/共108

42、頁(yè) 4、砂土管保藏法 （1）河砂處理 取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來(lái)水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過(guò)篩，棄去粗顆粒，備用。（）土壤處理 取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過(guò)篩，粗顆粒部分丟掉。 (3)砂土混合 處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要 而 用 其 他 比 例 ， 甚 至 可 全 部 作 砂 或 土 ) 均 勻 后 ， 裝 入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，最后烘干。

43、 四、實(shí)驗(yàn)步驟第95頁(yè)/共108頁(yè) (4)無(wú)菌檢查 每10支砂土管隨機(jī)抽1支，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長(zhǎng)，所有砂土管則需重新滅菌，再作無(wú)菌試驗(yàn)，直至證明無(wú)菌后方可使 用。 (5)菌懸液的制備 取生長(zhǎng)健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無(wú)菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。 (6)分裝樣品 每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入05ml菌懸液(剛剛使砂土潤(rùn)濕為宜)， 用接種針拌勻。 (7)干燥 將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。 (8)保存 置4冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛、 效果較好，可保存幾年時(shí)間，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。第96頁(yè)/共108頁(yè)5、冷凍真空干燥法 （1）凍干管的準(zhǔn)備：中性硬制玻璃，烘干