PCR原理及應(yīng)用

1、 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, pcr)，是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。pcr又稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性dna序列體外引物定向酶促擴增法，它可將極微量的靶dna在數(shù)小時內(nèi)特異地擴增上百萬倍。 70年代初，kleppe等人就提出了pcr的工作原理。saiki（1985）和mullis（1986）兩家研究室分別用改進(jìn)的kleppe法獲得了大量染色體dna單拷貝基因。當(dāng)時的pcr技術(shù)須在每次變性和退火后，擴增反應(yīng)前重新加入dna聚合酶。 1988年，由于在pcr系統(tǒng)引入了熱穩(wěn)定的taq dna聚合酶，這是從水生棲熱菌（thermus aq

2、uaticus）中提取的耐熱dna聚合酶。多次循環(huán)后的taq dna聚合酶仍然具有活性，因此反應(yīng)體系自動往復(fù)多次地進(jìn)行對所需的dna的片段的酶促合成，使反應(yīng)產(chǎn)物按指數(shù)增長，所以命名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。pcrpcr基本原理基本原理 pcr是一種選擇性體外擴增dna或rna的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(denaturation):目的雙鏈dna片段在94下解鏈; (2) 退火(annealing):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(extension): dna模板引物結(jié)合物在taq dna聚合酶的作用下，以dntp為反應(yīng)原料，靶序列

3、為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補的鏈。 pcr的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使dna擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的dna 擴增量可用計算。 c代表dna片段擴增后的拷貝數(shù)，表示擴增開始時dna模板數(shù)，p表示平均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。pcrpcr的反應(yīng)動力學(xué)的反應(yīng)動力學(xué) 反應(yīng)初期，靶序列dna片段的增加呈指數(shù)形式，隨著pcr產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的dna 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” 這種效應(yīng)稱平臺期，平臺期受pcr 擴增效率、dna聚合酶的種類和活性及

4、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素的影響。 pcrpcr擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈個引物鏈55端之間，是需要擴增的特定片段。端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的dnadna為模板，為模板，引物是從引物是從33端開始延伸，端開始延伸， 其其55端是固定的，端是固定

5、的，3 3 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長長產(chǎn)物片段產(chǎn)物片段”。pcrpcr擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物 進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈新合成的鏈(即即“長產(chǎn)物片段長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時，結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時， 由于新鏈模板的由于新鏈模板的5端序列是固定的，端序列是固定的， 這就等于這次延伸的這就等于這次延伸的片段片段3端被固定了止點，端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短

6、一致的“短產(chǎn)物片段短產(chǎn)物片段”。不難看出不難看出“短產(chǎn)物片段短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而而“長產(chǎn)物長產(chǎn)物片段片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計，幾乎可以忽略不計， 這使得這使得pcr的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純dna片段片段供分析與檢測用。供分析與檢測用。 pcr反應(yīng)的特點n引物與模板引物與模板dna特異正確的結(jié)合特異正確的結(jié)合n堿基配對原則堿基配對原則ntaq dna聚合酶合成反應(yīng)的忠實性聚合酶合成反應(yīng)的忠實性n靶基因的特異性與保守性。靶基因的特異性與保守性。靈敏度高靈敏度高pcrpcr反應(yīng)特點

7、反應(yīng)特點pcrpcr產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10(pg=10- 12- 12) )量級的起始待測模板擴增到微克量級的起始待測模板擴增到微克( (g=10g=10-6 -6) )水平。能從水平。能從100100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，毒的檢測中，pcrpcr的靈敏度可達(dá)的靈敏度可達(dá)3 3個個pfu(pfu(空斑形成空斑形成單位單位) )；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3 3個細(xì)菌。個細(xì)菌。 pcr反應(yīng)用耐高溫的反應(yīng)用耐高溫的taq dna聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加聚合酶

8、，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在好后，即在dna擴增儀上進(jìn)行變性擴增儀上進(jìn)行變性-退火退火-延伸反應(yīng)，一般在延伸反應(yīng)，一般在24 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析。小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析。 pcrpcr反應(yīng)特點反應(yīng)特點簡單、快速簡單、快速不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，dna dna 粗制粗制品及總品及總rnarna均可作為擴增模板。可直接用臨床均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的活組織等粗制的dnadna擴增檢測。擴增檢測。 pcrpcr反應(yīng)特點反應(yīng)

9、特點對標(biāo)本的純度要求低對標(biāo)本的純度要求低pcrpcr反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化pcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系引物引物dntpdntpmgmg2+2+taqtaq聚合酶聚合酶模板模板反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 引物設(shè)計的引物設(shè)計的3 3條基本原則：條基本原則：引物與模板的序列要緊密互補引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物不能在模板的非目的位點引發(fā)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)dnadna聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)( (即即錯配錯配) )。 pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系引物引物 引物的長度一般為引物的長度一般為15-30 bp，常用的是，

10、常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大，但不應(yīng)大于于38bp，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于，不適于taq dna聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，個以上的連續(xù)堿基，如如ggg或或ccc，也會使錯誤引發(fā)機率增加。，也會使錯誤引發(fā)機率增加。 引物引物3端的末位堿基對端的末位堿基對taq酶的酶的dna合成效率有較大的影響。不合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在

11、錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為a的錯的錯配效率明顯高于其他配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿端使用堿基基a。另外，兩條引物。另外，兩條引物33端若互補，或者單條引物自身形成發(fā)夾結(jié)端若互補，或者單條引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致構(gòu)也可能導(dǎo)致pcr反應(yīng)失敗。反應(yīng)失敗。pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系引物設(shè)計注意事項引物設(shè)計注意事項5端序列對端序列對pcr影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物。影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物?？稍谝镌O(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密

12、碼子、可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等缺失或插入突變位點以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等. . 通常應(yīng)通常應(yīng)在在55端限制酶位點外再加端限制酶位點外再加1-21-2個保護堿基。個保護堿基。簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子, , 例如選用只有一種密碼子例如選用只有一種密碼子的的met, 3met, 3端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。產(chǎn)物。兩引物間最好不存在兩引物間最好不存在4 4個連續(xù)堿基的同源性或互補性個連續(xù)堿基的同源

13、性或互補性引物序列的引物序列的gc含量一般為含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)，因為應(yīng)，因為gcgc含量決定了含量決定了dnadna雙鏈的解鏈溫度（雙鏈的解鏈溫度（tmtm）。另外，上下游）。另外，上下游引物的引物的gc含量不能相差太大。含量不能相差太大。 pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系引物設(shè)計注意事項引物設(shè)計注意事項 引物所對應(yīng)模板位置序列的引物所對應(yīng)模板位置序列的tm值在值在72左右可使復(fù)性條件最佳。左右可使復(fù)性條件最佳。tm值的計算有多種方法，如按公式值的計算有多種方法，如按公式tm4( (g+c) )2( (a+t) )，在，在oligo軟件中使

14、用的是最鄰近法軟件中使用的是最鄰近法( (the nearest neighbor method) ) 。 g值是指值是指dna雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端端g值較低（絕對值不超過值較低（絕對值不超過9），而），而5端和中間端和中間g值相對較高的引物。引物的值相對較高的引物。引物的3端的端的g值過高，容易在值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)dna聚合反應(yīng)。聚合反應(yīng)。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5

15、kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使pcr反應(yīng)不能正常進(jìn)行。反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 對引物的修飾一般是在對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入入pcr產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系引物設(shè)計注意事項引物設(shè)計注意事項一般一般pcr反應(yīng)中的引物終濃度為反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/l。引物過多會。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外過低則降

16、低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計分光光度計, 可精確計算引物濃度可精確計算引物濃度, 在在1cm光程比色杯光程比色杯中中,260nm下下,引物濃度可按下式計算：引物濃度可按下式計算：x mol/l od260/ a(16000)+c(70000)+g(12000)+t(9600) x: 引物摩爾濃度引物摩爾濃度, a、c、g、t: 引物中引物中4種不同堿基個數(shù)。種不同堿基個數(shù)。 引物濃度計算引物濃度計算pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系模板模板模板核酸的量與純化程度，是pcr成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的dna純化方法通常

17、采用sds和蛋白酶k來消化處理標(biāo)本。sds的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，sds 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶k能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與dna結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于pcr反應(yīng)。 pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系模板的提取方法模板的提取方法pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系pcr反應(yīng)體系pcrpcr反應(yīng)體系反應(yīng)體系擴增效率擴增效率pcr擴增產(chǎn)物的分析擴增產(chǎn)物的分析 n凝膠電泳分析凝膠電泳分析 (1) 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用通常應(yīng)用

18、12%的瓊脂糖的瓊脂糖 凝凝 膠，膠， 供檢測用。供檢測用。 (2) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）：）：610%聚聚 丙烯酰胺凝膠丙烯酰胺凝膠 電泳分離效果較瓊脂糖好電泳分離效果較瓊脂糖好n酶切分析酶切分析 n分子雜交分子雜交 n測序測序 功能 引物設(shè)計引物設(shè)計限制性內(nèi)切酶位點分析限制性內(nèi)切酶位點分析dnadna基序基序(motif)(motif)查找查找同源性分析同源性分析常規(guī)常規(guī)pcrpcr技術(shù)及幾類技術(shù)及幾類pcrpcr新技術(shù)新技術(shù)q熱啟動熱啟動pcrqtouch-down pcrqrt-pcrq簡并引物簡并引物pcrq巢氏巢氏pcrq反向反向pcrq不對稱不對稱p

19、crq原位原位pcrq連接酶鏈反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)qrace-pcrqaflpq免疫免疫pcr(immunopcr(immuno-pcr)-pcr) 熱啟動pcr是除了好的引物設(shè)計之外，提高pcr特異性最重要的方法之一。盡管taq dna聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行pcr反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于dna工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動pcr尤為有效。 限制taq dna聚

20、合酶活性的常用方法是在冰上配制pcr反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的pcr儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。 熱啟動熱啟動pcr熱啟動通過抑制一種基本成分延遲熱啟動通過抑制一種基本成分延遲dna合成，直到合成，直到pcr儀達(dá)到變性溫度。儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入包括延緩加入taq dna聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板

21、和緩沖液，物理地隔離開。在熱循或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 platinum dna聚合酶對于自動熱啟動聚合酶對于自動熱啟動pcr來說方便高效。來說方便高效。platinum taq dna聚合酶的成分為復(fù)合有抗聚合酶的成分為復(fù)合有抗taq dna聚合酶單克隆抗體的重組聚合酶單克隆抗體的重組taq dna聚聚合酶。

22、此酶在常溫下活性被封閉，要在合酶。此酶在常溫下活性被封閉，要在94 95下加熱數(shù)分鐘才能夠恢復(fù)下加熱數(shù)分鐘才能夠恢復(fù)酶活性。酶活性。同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動的同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動的taq dna聚合酶相比，聚合酶相比，platinum酶不需酶不需要在要在94延時保溫（延時保溫（10到到15分鐘）以激活聚合酶。使用分鐘）以激活聚合酶。使用platinumtaq dna聚聚合酶，在合酶，在94進(jìn)行進(jìn)行2分鐘就可以恢復(fù)分鐘就可以恢復(fù)90的的taq dna聚合酶活性。聚合酶活性。熱啟動熱啟動pcr touch-down pcr又稱降落又稱降落pcr。即。即選定一個溫度范圍，選定一個溫度范圍，如如503

23、5 ，每，每降降1-2 進(jìn)行進(jìn)行1-2個個循環(huán)，然后在循環(huán)，然后在50度度下進(jìn)行下進(jìn)行15個個循環(huán)。循環(huán)。 touch-down的的原理原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴增出來，其濃步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴增。條帶優(yōu)先被擴增。 選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的tm值高出值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減度，然后每個循環(huán)遞減1-2度

24、度touch-down pcrlow copy of targeted dna; high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers; rt-pcr using oligo-dt. touch-down pcr的應(yīng)用范圍的應(yīng)用范圍 rt-pcrrna的多聚酶反應(yīng)（的多聚酶反應(yīng)（rt-pcr）是以）是以rna 為模板，聯(lián)合逆為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription，rt）與）與pcr，可用于檢測單個細(xì)，可用于檢測單個細(xì)胞或少數(shù)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于細(xì)胞中少于10個拷貝的個拷貝的r

25、na模板。模板。 rna擴增包括兩個步驟：擴增包括兩個步驟：在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成rna的互補的互補cdna加熱后加熱后cdna與與rna鏈解離，然后與另一引物退火，并由鏈解離，然后與另一引物退火，并由dna聚聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶合酶催化引物延伸生成雙鏈靶dna， 最后擴增靶最后擴增靶dnadouble strand cdnaaaaaatttttrtaaaaatttttrtrtaaaaatttttoligo dt primer is bound to mrnareverse transcriptase (rt) copies f

26、irst cdna strandreverse transcriptase digests and displaces mrna and copies second strand of cdnart-pcra. double strand dnab. denature9650c. anneal primers50d. polymerase binds72taqtaqrt-pcrcdnacdna第二鏈的合成方法有以下幾種第二鏈的合成方法有以下幾種: : (1) (1) 自身引導(dǎo)法自身引導(dǎo)法 合成的單鏈合成的單鏈cdnacdna 3 3 端能夠形成一短的端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu), ,這就為

27、第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物, ,當(dāng)?shù)谝绘満袭?dāng)?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的成反應(yīng)產(chǎn)物的dna:rnadna:rna雜交鏈變性后利用大腸桿菌雜交鏈變性后利用大腸桿菌dnadna聚合酶聚合酶 klenowklenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cdnacdna第二鏈第二鏈, ,最后用對單鏈特異性最后用對單鏈特異性的的s1s1核酸酶消化該環(huán)核酸酶消化該環(huán), ,即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用難控制反應(yīng)，而且用s1s1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將導(dǎo)核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于致對應(yīng)于mrna 5m

28、rna 5端序列出現(xiàn)缺失和重排端序列出現(xiàn)缺失和重排, ,因而該方法目前很因而該方法目前很少使用。少使用。 (2) (2) 置換合成法置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的生的cdna:mrnacdna:mrna雜交鏈不用堿變性雜交鏈不用堿變性, ,而是在而是在dntpdntp存在下存在下, ,利用利用rnarna酶酶h h在雜交鏈的在雜交鏈的mrnamrna鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列rnarna引物引物, ,使之成為合成第二鏈的引物使之成為合成第二鏈的引物, ,在大腸桿菌在大腸桿菌dnadna聚合酶聚合酶的

29、的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3 3個主要優(yōu)點個主要優(yōu)點: (1) : (1) 非常有效非常有效; ; (2) (2) 直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物, ,無須進(jìn)一步處理和純化無須進(jìn)一步處理和純化; (3) ; (3) 不必使用不必使用s1s1核酸酶來切割雙鏈核酸酶來切割雙鏈cdnacdna中的單鏈發(fā)夾環(huán)。中的單鏈發(fā)夾環(huán)。rt-pcrrt-pcr優(yōu)化條件優(yōu)化條件模板模板 ：作為模板的：作為模板的rna分子必須是完整的，并且不含分子必須是完整的，并且不含dna、蛋白和其、蛋白和其他雜質(zhì)。他雜質(zhì)。rna中即使含有最微量的中即使含有最微量的dna，經(jīng)擴增后也會出

30、現(xiàn)非特異性，經(jīng)擴增后也會出現(xiàn)非特異性擴增；蛋白若未除干凈，與擴增；蛋白若未除干凈，與rna結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和pcr；殘留的；殘留的rnase極易將模板極易將模板rna降解掉。降解掉。逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶：1)1)目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒禽類成髓細(xì)胞病毒(amv)(amv)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的moloneymoloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒鼠白血病病毒(mlv)(mlv)反轉(zhuǎn)錄酶。反

31、轉(zhuǎn)錄酶。amvamv反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基若干種酶活性的多肽亞基, ,這些活性包括依賴于這些活性包括依賴于rnarna的的dnadna合合成成, ,依賴于依賴于dnadna的的 dnadna合成以及對合成以及對dna:rnadna:rna雜交體的雜交體的rnarna部分部分進(jìn)行內(nèi)切降解進(jìn)行內(nèi)切降解(rna(rna酶酶h h活性活性) )。mlvmlv反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽亞基亞基, ,兼?zhèn)湟蕾囉诩鎮(zhèn)湟蕾囉趓narna和依賴于和依賴于dnadna的的dnadna合成活性合成活性, ,但降解但降解rnadnarnadna雜交體中的雜交體中的

32、rnarna的能力較弱的能力較弱, ,且對熱的穩(wěn)定性較且對熱的穩(wěn)定性較amvamv反轉(zhuǎn)錄酶差。反轉(zhuǎn)錄酶差。2)普通逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溫度為普通逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溫度為37-42度，然而一些有豐富二級結(jié)構(gòu)的度，然而一些有豐富二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜模板或者高復(fù)雜模板或者高gc含量的模板在常溫下擴增困難，需要將逆轉(zhuǎn)錄含量的模板在常溫下擴增困難，需要將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行改善擴增。對于較高的反應(yīng)溫度，建議使反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行改善擴增。對于較高的反應(yīng)溫度，建議使用用cmaster-rt酶，該酶在酶，該酶在37-60度的溫度范圍內(nèi)都能保持良好的度的溫度范圍內(nèi)都能保持良好的活性，使用活性，使用cmaster-rt酶

33、，可以增加反應(yīng)產(chǎn)量，還可以增加逆酶，可以增加反應(yīng)產(chǎn)量，還可以增加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特異性。因為，對于使用基因特異性引物（轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特異性。因為，對于使用基因特異性引物（gsp）進(jìn)行）進(jìn)行cdna合成時，較高的反應(yīng)溫度允許使用合成時，較高的反應(yīng)溫度允許使用tm值較高的基因特異性引值較高的基因特異性引物。物。taq酶酶 普通的普通的taq酶擴增能力很強但是錯配率高，雖然高產(chǎn)但是最酶擴增能力很強但是錯配率高，雖然高產(chǎn)但是最大只能大只能 擴增擴增3-5kb的片段；而本身帶有校讀功能的高保真酶有很高的的片段；而本身帶有校讀功能的高保真酶有很高的保真度，不易出錯，可擴增較長的片段，但是產(chǎn)量偏低。保真度，不易出錯

34、，可擴增較長的片段，但是產(chǎn)量偏低。triplemaster酶則是一個高保真的混合酶酶則是一個高保真的混合酶在保留在保留taq酶的高聚合能酶的高聚合能力，保證高產(chǎn)的同時，還有效降低了力，保證高產(chǎn)的同時，還有效降低了taq的錯配率，大大提高了保真的錯配率，大大提高了保真性。性。rt-pcr buffer 引物：引物：(1)(1)上下游引物設(shè)計在跨內(nèi)含子的兩個外顯子的上下游引物設(shè)計在跨內(nèi)含子的兩個外顯子的33端和下一個端和下一個外顯子的外顯子的55端，這樣不會在基因組上擴出來。端，這樣不會在基因組上擴出來。(2)(2)設(shè)計在兩個離得遠(yuǎn)設(shè)計在兩個離得遠(yuǎn)的外顯子上，這樣從基因組和的外顯子上，這樣從基因組

35、和cdnacdna上得到的片段長度不一樣，可以上得到的片段長度不一樣，可以一引兩用一引兩用。random 9mers適用于長的及具有hairpin構(gòu)造的rna。適用于rrna、mrna、trna等所有rna的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (用random 9mers合成cdna后，任何特異性的primer pair都可用于pcr反應(yīng))。oligo dt-adaptor primer適用于具有poly(a)+ tail的rna。注: 原核生物的rna、真核生物的rrna及trna (某些種類真核生物的mrna)不具有poly(a) tail。本primer設(shè)計巧妙，反轉(zhuǎn)錄效率高。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，用m13 prime

36、r m4可進(jìn)行3-race。一步法：一步法： 利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、taq酶、酶、4種種dntp 直接進(jìn)行直接進(jìn)行mrna反轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄與pcr擴增。發(fā)現(xiàn)擴增。發(fā)現(xiàn)taq酶酶不僅具有不僅具有dna多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以重作用在同一體系中直接以mrna為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后pcr擴擴增，從而使增，從而使mrna的的pcr步驟更為簡化。所需樣品量減少到最低限步驟更為簡化。所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢

37、測非常有利。用一步法擴增可檢測出總度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴增可檢測出總rna中中小于小于1ng的低豐度的低豐度mrna。該法可用于低豐度。該法可用于低豐度mrna的的cdna文庫文庫的構(gòu)建及特異的構(gòu)建及特異cdna的克隆，并有可能與的克隆，并有可能與taq酶的測序技術(shù)相組合，酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。rt-pcr一步法和兩步法一步法和兩步法兩步法：由于單管反應(yīng)時兩步法：由于單管反應(yīng)時rt和和pcr都不能在最佳條件下都不能在最佳條件下進(jìn)行并且進(jìn)行并且 容易相互干擾，常只適

38、宜用基因特異引物擴增容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴增較短的基因，及定量較短的基因，及定量pcr。兩步法則是將。兩步法則是將rt和和pcr分別分別進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點，更為靈進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些gc含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個基因的者是未知模板，以及多個基因的rt-pcr。rt-pcr一步法和兩步法一步法和兩步法兼并引物兼并引物pcr（degenerate primer）密碼子的密碼子的簡并簡并性性氨基酸密碼子數(shù)氨基酸密碼子數(shù)、簡并引物是簡并引物是指代表編

39、碼單個氨基酸所有不同堿基可能指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。性的不同序列的混合物。簡并度越低，產(chǎn)物特異性越簡并度越低，產(chǎn)物特異性越強。設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇簡并性小的氨基酸，并避強。設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇簡并性小的氨基酸，并避免引物免引物33末端簡并，末端簡并，因為因為3 3端最后端最后3 3個堿基的退火足以個堿基的退火足以在錯誤位點起始在錯誤位點起始pcrpcr；次黃嘌呤可以同所有的堿基配；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。對，降低引物的退火溫度。兼并引物兼并引物pcr（degenerate primer）巢氏巢氏pcr（nested pcr） 巢氏巢氏

40、pcr需要兩到三對引物，一般采用需要兩到三對引物，一般采用第一套引物擴增第一套引物擴增15-30個循環(huán)，再用擴增個循環(huán)，再用擴增dna片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴增片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴增15-30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級結(jié)構(gòu)個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴增。套式引物卻很少擴增。套式引物pcr減少了引物非特異性退火，從而減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。增加了特異性擴增，提高了擴增效率。 若將套若將套式式pcr的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（25-30bp），同時縮短內(nèi)引物長度（

41、），同時縮短內(nèi)引物長度（15-17bp），使外引物先在），使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫擴增，然后改換至三溫循環(huán)，使高退火溫度下復(fù)性，做雙溫擴增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴內(nèi)引物在外引物擴增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。反向反向pcr（inverse pcr） 反向反向pcr的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的dna，也就，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)

42、合成dna。反向。反向pcr可用于研究與已知可用于研究與已知dna區(qū)段相連接的未知染區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又稱為染色體步移。這時選擇的引物雖然與色體序列，因此又稱為染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心核心dna兩末端序列互補，但引物兩末端序列互補，但引物3端是相互反向的。端是相互反向的。 反向反向pcr的操作流程：擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品的操作流程：擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品dna，然后用，然后用dna連接酶連接成一個環(huán)狀分子，通過反向連接酶連接成一個環(huán)狀分子，通過反向pcr擴增引物的上游片段和下游片段。擴增引物的上游片段和下游片段。選擇多種限制性內(nèi)切酶，基本準(zhǔn)則是選擇不能

43、在選擇多種限制性內(nèi)切酶，基本準(zhǔn)則是選擇不能在非酶切位點切斷靶非酶切位點切斷靶dnadna的酶。裂解核心區(qū)的內(nèi)切的酶。裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向酶使反向pcrpcr只能擴增引物所定模板只能擴增引物所定模板( (依賴于引物依賴于引物) )的上游或下游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩側(cè)序的上游或下游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩側(cè)序列都擴增列都擴增 southernsouthern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向及反向pcrpcr的片段的末端片段的片段的末端片段 大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，所以往往需要

44、兩組到三組嵌套引物所以往往需要兩組到三組嵌套引物反向反向pcr（inverse pcr）不對稱不對稱pcr（asymmetric pcr） 不對稱不對稱pcrpcr的基本原理是采用不等量的引物產(chǎn)生大量的的基本原理是采用不等量的引物產(chǎn)生大量的單鏈單鏈dnadna（ss ss-dna-dna）。這兩種引物分別稱為限制性引物與）。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為非限制性引物；其最佳比例一般為1 1：501501：100100，關(guān)鍵是，關(guān)鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利于限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利于ss ss- -dnadna。 不對稱不對

45、稱pcrpcr反應(yīng)過程：一般來說，在不對稱反應(yīng)過程：一般來說，在不對稱pcrpcr反應(yīng)中，反應(yīng)中，在在 開始的開始的20-2520-25個循環(huán)中，兩個比率不對稱的擴增引物產(chǎn)生個循環(huán)中，兩個比率不對稱的擴增引物產(chǎn)生出雙鏈出雙鏈dnadna，當(dāng)限量的那個引，當(dāng)限量的那個引 物耗光后，隨后的物耗光后，隨后的5-105-10個循個循環(huán)就產(chǎn)生出環(huán)就產(chǎn)生出ssdnassdna。 產(chǎn)生的產(chǎn)生的ds-dnads-dna與與ss ss-dna-dna由于分子量不同，可以通過電由于分子量不同，可以通過電泳分離。泳分離。 一般對一般對100l pcr反應(yīng)體系而言，當(dāng)引物比率反應(yīng)體系而言，當(dāng)引物比率為為50pmo:0

46、.5pmol，經(jīng)過，經(jīng)過30個循環(huán)個循環(huán) 后，大約可產(chǎn)后，大約可產(chǎn)生生1-3pmol的的ssdna。ssdna的產(chǎn)量可用下列幾的產(chǎn)量可用下列幾種方法來估計種方法來估計:a)在在ss-dna合成過程中，摻入合成過程中，摻入32p-dntp。取。取10%的反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)過瓊脂的反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)過瓊脂 糖電泳分離后，放糖電泳分離后，放射自顯影。射自顯影。b)取取5%的反應(yīng)物來走的反應(yīng)物來走 膠，轉(zhuǎn)移到膜上，并用與膠，轉(zhuǎn)移到膜上，并用與ssdna互補的寡核苷酸為探針雜交?；パa的寡核苷酸為探針雜交。 不對稱不對稱pcrssdna產(chǎn)物量產(chǎn)物量n解決不對稱解決不對稱pcr反應(yīng)擴增效率低的方法：反應(yīng)擴增效率低的方法

47、：n增加增加pcr循環(huán)的次數(shù)循環(huán)的次數(shù)n在最后五個循環(huán)中多加在最后五個循環(huán)中多加tab聚合聚合 酶酶(2u)n試一下相反的不對稱引物比率。有時，試一下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不相反的不對稱引物比率可能給出不 同產(chǎn)同產(chǎn)量的量的ssdna。in situ pcr 原位原位pcr就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行pcr反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的位雜交和高度特異敏感的pcr技術(shù)的優(yōu)技術(shù)的優(yōu)點，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的點，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)一項有較大潛力的新技術(shù).

48、 原位原位pcr是是hasse等于等于1990年建立的，實驗用的年建立的，實驗用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等等.其基本方法為其基本方法為固定組織或細(xì)胞固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶.蛋白酶蛋白酶k消化處消化處理理:用用60ug/ml的蛋白酶的蛋白酶k將固定好的組織細(xì)胞片將固定好的組織細(xì)胞片55消化處理消化處理2h后，后，962min以滅活蛋白酶以滅活蛋白酶k.

49、pcr擴增擴增:在組織細(xì)胞片上，加在組織細(xì)胞片上，加pcr反應(yīng)液，反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進(jìn)行板上，進(jìn)行pcr循環(huán)擴增循環(huán)擴增.有的基因擴增儀帶有的基因擴增儀帶有專門用于原位有專門用于原位pcr的裝置的裝置.雜交雜交:pcr擴增擴增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交交.顯微鏡觀察結(jié)果顯微鏡觀察結(jié)果.n原位原位pcr既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機于分子和細(xì)胞水平

50、上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實用價值用價值.其特異性和敏感性高于一般的其特異性和敏感性高于一般的pcr. 原位原位pcr 連接酶鏈反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)(ligase(ligase chain reaction chain reaction，lcr)lcr)，是一種新，是一種新的的dnadna體外擴增和檢測技術(shù)，主要用于點突變的研究及靶基因體外擴增和檢測技術(shù)，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增的擴增. . 連接酶鏈反應(yīng)是連接酶鏈反應(yīng)是backman1997backman1997年為檢出靶基因序列中的點年為檢出靶基因序列中的點突變而設(shè)計發(fā)明，并申

51、報了專利突變而設(shè)計發(fā)明，并申報了專利.1988.1988年年landegrenlandegren也進(jìn)行了也進(jìn)行了該項研究該項研究.1988.1988年年backmanbackman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申報專利，報專利，19911991年年backmanbackman和和baranybarany分別用耐熱分別用耐熱dnadna連接酶進(jìn)行連接酶進(jìn)行了了lcrlcr試驗試驗. .耐熱耐熱dnadna連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴增和免除了不斷補充酶的繁接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴增和免除了不斷

52、補充酶的繁瑣程序瑣程序. .連接酶鏈反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)(ligase(ligase chain reaction chain reaction，lcr)lcr) lcrlcr的基本原理為利用的基本原理為利用dnadna連接酶連接酶. .特異地將雙鏈特異地將雙鏈dnadna片片段連接，經(jīng)變性段連接，經(jīng)變性- -退火退火- -連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴增序列大量擴增. .其程序為其程序為: :在模在模dnadna、dnadna連接酶、寡核苷酸引連接酶、寡核苷酸引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下(9

53、4(9495)95)使使dnadna變性，雙鏈打開，然后降溫退火變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65)(65)，引物與，引物與之互補的模板之互補的模板dnadna結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補，相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補，dnadna連接酶即可連連接酶即可連接封閉這一缺口，則接封閉這一缺口，則lcrlcr反應(yīng)的三步驟反應(yīng)的三步驟( (變性變性- -退火退火- -連接連接) )就就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴增

54、板，使更多的寡核苷酸被連接與擴增. .若連接處的靶序列有若連接處的靶序列有點突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空點突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物物. .連接酶鏈反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)(ligase(ligase chain reaction chain reaction，lcr)lcr)ligase chain reaction (lcr)ligase chain reaction (lcr)denaturation 70cannealing and ligat

55、ion 40cdenaturation 70cligase chain reaction (lcr) lcrlcr的引物是兩對分別互補的引物，引物長度為的引物是兩對分別互補的引物，引物長度為20202626個，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，個，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，lcrlcr識別點突變的特異性高于識別點突變的特異性高于pcrpcr，其特異性首先取，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性的特異性.lcr.lcr連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(tm)(tm)，因而識別單核苷酸錯配的特異性極高，因而識別單核苷酸錯配的特異性極高. .lcrlcr的擴增效率與的擴增效率與pcrpcr相當(dāng)，用耐熱連接酶做相當(dāng)，用耐熱連接酶做lcrlcr只用兩個溫度循環(huán)，只用兩個溫度循環(huán)，94min94min變性和變性和6565復(fù)性并復(fù)性并連接，循環(huán)連接，循環(huán)3030次左右次左右. .其產(chǎn)物的檢測也較方便靈敏其產(chǎn)物的檢測也較方便靈敏. .目前該方法主要用點突變的研究與檢測