LOGOD絲氨酸的毛細(xì)管電泳非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究

1、logo創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金資助項(xiàng)目答辯創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金資助項(xiàng)目答辯d-d-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳- -非接觸式電導(dǎo)非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究分離檢測研究專業(yè)：化學(xué)工程與工藝專業(yè)：化學(xué)工程與工藝導(dǎo)師：謝天堯?qū)煟褐x天堯 副教授副教授報告人：韋昱報告人：韋昱 07306407logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)及討論討論研究方案研究方案研究背景研究背景選題選題意義意義結(jié)論結(jié)論logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u選題意義選題意義 d-絲氨酸是哺

2、乳動物腦內(nèi)nmda型谷氨酸受體(nr1/nr2型)的輔助激動劑，在動物的大腦中一生都維持著很高的濃度；腦內(nèi)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞都含有d-絲氨酸并且具有特異的生物合成、胞外釋放、攝取和降解途徑。 d-絲氨酸作為一種重要的膠質(zhì)細(xì)胞遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)突觸可塑性、感覺信息傳遞、神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)興奮性毒性等生理及病理過程,并逐漸成為阿爾采末病(ad)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的治療靶點(diǎn)。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u研究背景研究背景 如何分離檢測如何分離檢測d-絲氨酸？絲氨酸？ 針對其外消旋體的拆分已開發(fā)了優(yōu)先結(jié)晶法、形成非對映體立體異構(gòu)

3、體結(jié)晶法、酶促法、色譜法（包括：液相色譜、氣相色譜、薄層色譜、配位色譜、離子交換色譜）毛細(xì)管電泳法和萃取法等。 存在的問題：存在的問題： 絲氨酸由于其結(jié)構(gòu)簡單，分離難度較大，且沒有紫外或熒光吸收，常需衍生后才可得到檢測。 如何建立如何建立d-ser有效檢測的快速方法，大大降低檢測成本，有效檢測的快速方法，大大降低檢測成本，仍是分析工作者面臨的具有挑戰(zhàn)性的課題。仍是分析工作者面臨的具有挑戰(zhàn)性的課題。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u研究背景研究背景 高效毛細(xì)管電泳（hpce）是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液

4、相分離分析技術(shù)，因具有低耗、快速、高效、環(huán)境友好等特點(diǎn)而成為新興的手性分離分析中極具吸引力的分析方法。非接觸電導(dǎo)檢測是近年來出現(xiàn)的新的檢測技術(shù)，對于缺乏紫外-可見吸收基團(tuán)氨基酸則無須先作衍生化處理,可以進(jìn)行直接檢測。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u研究方案研究方案 本課題提出采用高效毛細(xì)管電泳本課題提出采用高效毛細(xì)管電泳-非接觸式非接觸式電導(dǎo)法，電導(dǎo)法，以銅以銅-l-精氨酸作為配體交換選擇精氨酸作為配體交換選擇劑，與羥丙基甲基纖維素（劑，與羥丙基甲基纖維素（hpmc）構(gòu)成二）構(gòu)成二元手性選擇體系，元手性選擇體系，建立快速、靈敏

5、和低成本建立快速、靈敏和低成本的的d-絲氨酸的分離分析新方法。絲氨酸的分離分析新方法。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u分離分析原理分離分析原理 毛細(xì)管電泳是以高壓直流電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行淌度和分配行為上的差異為上的差異而實(shí)現(xiàn)高效，快速的新型液相分離分析技術(shù)；而非接觸式電導(dǎo)檢測器是近年發(fā)展起來的一種新型電導(dǎo)檢測方法。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分 儀器和試劑 手性選擇體系的選擇 最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

6、線性范圍、重現(xiàn)性、檢出限測定logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u儀器儀器ces2008型毛細(xì)管電泳儀型毛細(xì)管電泳儀logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 氫氧化鈉(naoh，廣州化學(xué)試劑廠，分析純)、檸檬酸(cit，廣州化學(xué)試劑廠，分析純)、乙酸銅(cu(ch3coo)2h2o，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純)、羥丙基甲基纖維素(hpmc，山東赫達(dá)股份有限公司，分析純)、d,l-絲氨酸、l-絲氨酸(d,l-ser、l-ser，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公

7、司，層析純)、l-精氨酸(l-arg，上海伯奧生物科技有限公司，層析純)。所用水為超純水。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u手性選擇體系的選擇手性選擇體系的選擇僅用cu()絲氨酸對映體未能達(dá)到分離cu()+ l-arg分離度rs=1.6cu()-l-arg+hpmc分離度rs=2.1logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u手性選擇體系的選擇手性選擇體系的選擇圖1 兩種不同的手性選擇體系對分離度的影響fig. 1 the effect of two different c

8、hiral selectors on the resolutiona.cu()-l-arg b. cu()-l-arg-hpmc26.027.028.029.030.031.0-150-100-50050signal/mvut/mindla27.028.029.030.031.032.033.0-10-50510dlbsignal/mvt/minlogod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u銅離子濃度對分離度的影響銅離子濃度對分離度的影響圖2 cu()濃度對分離度的影響fig.2 the effect of cu() concentrati

9、on on the resolution本實(shí)驗(yàn)選擇本實(shí)驗(yàn)選擇cu()的最佳濃度為的最佳濃度為2.5mmol/l。2.02.22.42.62.81.61.82.02.2rsc/mmol l-1logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究ul-精氨酸濃度對分離度的影響精氨酸濃度對分離度的影響圖3 l-精氨酸濃度對分離度的影響fig.3 the effect of l-arg concentration on the resolution本實(shí)驗(yàn)選擇本實(shí)驗(yàn)選擇l-精氨酸的最佳濃度為精氨酸的最佳濃度為5.0 mmol/l。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電

10、泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究uhpmchpmc濃度對分離度的影響濃度對分離度的影響圖4 hpmc濃度對分離度的影響fig.4 the effect of hpmc concentration on the resolution因此，本實(shí)驗(yàn)選擇因此，本實(shí)驗(yàn)選擇hpmc最佳濃度為最佳濃度為10 mg/l。051015201.41.61.82.02.22.42.6rsc/mg l-1logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u緩沖溶液的組成、濃度及緩沖溶液的組成、濃度及ph的影響的影響 naoh-cit

11、體系在非接觸電導(dǎo)檢測法中有良好的基線和靈敏的響應(yīng)，但緩沖溶液濃度太高易引起基線漂移。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檸檬酸濃度對對映體分離的影響很大，濃度太低，絲氨酸不出峰；濃度太高，水峰提前，對映體也得不到分離，見下表。 表1 檸檬酸濃度對分離度的影響 故實(shí)驗(yàn)選擇cit濃度為0.4 mmol/l。ccit (mmol/l)0.20.40.60.81.0resolution(rs)-2.31.8-logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u緩沖溶液的組成、濃度及緩沖溶液的組成、濃度及ph的影響的影響固定檸檬酸濃度后，加入naoh以調(diào)節(jié)運(yùn)行液的ph。在24

12、mmol/l濃度范圍內(nèi)考察naoh濃度對分離度的影響，見表2。表2 naoh濃度對分離度的影響故實(shí)驗(yàn)選擇naoh濃度為3.0 mmol/l。cnaoh(mmol/l)2.02.43.03.44.0resolution(rs)0.91.62.41.91.9logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u緩沖溶液的組成、濃度及緩沖溶液的組成、濃度及ph的影響的影響 圖5 ph對分離度的影響 fig.5 the effect of ph on the resolutionlogod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接

13、觸式電導(dǎo)分離檢測研究1電動進(jìn)樣電動進(jìn)樣對離子組分存在進(jìn)樣歧視2重力重力進(jìn)樣進(jìn)樣無進(jìn)樣歧視無進(jìn)樣歧視3擴(kuò)散進(jìn)樣擴(kuò)散進(jìn)樣進(jìn)樣具雙向性，有進(jìn)樣歧視u進(jìn)樣方式的選擇進(jìn)樣方式的選擇故故本本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用重力進(jìn)樣采用重力進(jìn)樣。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u進(jìn)樣方式的選擇進(jìn)樣方式的選擇圖6 進(jìn)樣時間對分離度的影響fig.6 the effect of injection time on the resolution進(jìn)樣時間為進(jìn)樣時間為60s時分離度最高，時分離度最高，rs=2.6。logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電

14、導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u進(jìn)樣方式的選擇進(jìn)樣方式的選擇此外，進(jìn)樣時間還對峰高及峰面積有較大影響，見表3。表3 進(jìn)樣時間的影響故實(shí)驗(yàn)選擇cit濃度為0.4 mmol/l。進(jìn)樣時間進(jìn)樣時間（s）304050607080100120峰高l-ser4955748410010513964d-ser51689210912212917082峰面積l-ser10611460211926832916296245701444d-ser11021683268833843354346850651850logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u分離

15、電壓的選擇分離電壓的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了分離電壓從10kv至15kv對絲氨酸對映體分離的影響，見表4。表4 分離電壓對遷移時間和分離度的影響故實(shí)驗(yàn)選擇cit濃度為0.4 mmol/l。working voltage (kv)1012131415resolution(rs)2.62.32.01.81.6migrating time of d-ser(min)48.832.726.523.521.8logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究運(yùn)行液體系：運(yùn)行液體系：3.0 mmol/l naoh+0.4 mmol/l cit+2.5 mmol/l

16、cu(ac)2+5.0 mmol/l l-arg+10.0 mg/l hpmc（ph=9.67）重力進(jìn)樣，進(jìn)樣時間為60s分離電壓為13kv 最佳實(shí)驗(yàn)條件最佳實(shí)驗(yàn)條件logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u線性范圍與檢出限線性范圍與檢出限圖7 d-絲氨酸線性校正曲線圖表表5 5 線性范圍與檢出限線性范圍與檢出限 待測組分待測組分回歸方程回歸方程相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)線性范圍線性范圍（mg/l）檢出限檢出限（mg/l）d-絲氨酸y=-123.8+ 981.9xr= 0.99991100 0.5logod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-

17、非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u重現(xiàn)性測定重現(xiàn)性測定在相同條件下，d-ser以3 mg/l的濃度重復(fù)進(jìn)樣4次，測其重現(xiàn)性，見表6。表6 重現(xiàn)性測定結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)證明本方法具有較高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性。序號序號1234rsd/%遷移時間（min）23.124.722.623.33.9峰面積24002473261626805.0logou實(shí)際樣品分析實(shí)際樣品分析圖8 d-絲氨酸小鼠脊髓樣品hpce-c4d譜圖fig.8 the electropherogram of d-ser in rat spinal cord d-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測

18、研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究-4.10.04.18.312.416.520.724.828.933.1-40-200204060d-serinesignal/mvt/minlogod-絲氨酸的毛細(xì)管電泳絲氨酸的毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究非接觸式電導(dǎo)分離檢測研究u拆分機(jī)理初步探討拆分機(jī)理初步探討 在緩沖溶液中，銅離子與l-精氨酸以1 2形成三元絡(luò)合物：l-arg+cu() (l-arg)cul-arg+(l-arg)cu() cu(l-arg)2 當(dāng)絲氨酸對映體進(jìn)入緩沖系統(tǒng)時，d-ser和l-ser分別取代一分子的l-arg,形成兩種不同的三元絡(luò)合物:l-ser+cu(l-arg)2 (l-arg)c