細胞生物學_翟中和第三章

1、細胞生物學細胞生物學第一節(jié)第一節(jié) 細胞形態(tài)結構的觀察方法細胞形態(tài)結構的觀察方法一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡第二節(jié)第二節(jié) 細胞組分的分析方法細胞組分的分析方法一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物二、細胞內核酸、蛋白質、糖與脂質等成分的顯示方法二、細胞內核酸、蛋白質、糖與脂質等成分的顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細胞內特異核酸序列的定位與定性四、細胞內特異核酸序列的定位與定性五、應用放射自顯影技術研究生物大分子在細胞內的合成動態(tài)五、應

2、用放射自顯影技術研究生物大分子在細胞內的合成動態(tài)六、定量細胞化學分析技術六、定量細胞化學分析技術第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)二、細胞工程二、細胞工程第四節(jié)用于細胞生物學研究的模式生物第四節(jié)用于細胞生物學研究的模式生物細胞生物學第一節(jié)第一節(jié) 細胞形態(tài)結構的觀察方法細胞形態(tài)結構的觀察方法光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。細胞生物學一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡（一）普通光學顯微鏡（一）普通光學顯微鏡1、構成： 照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng) 機械裝置2、原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。細

3、胞生物學細胞生物學細胞生物學3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。R=0.61/NA其中其中為入射光線波長；為入射光線波長；NA：為鏡口率為鏡口率 sin/2，n=介質折射率；=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？細胞生物學表一、幾種介質的折射率表一、幾種介質的折射率細胞生物學顯微鏡的幾個光學特點：顯微鏡的幾個光學特點：制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.781.651.78，所用介質的折，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。射率越接近玻璃的越好。sin /2sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1 1；介質為空氣，鏡口率

4、一般為；介質為空氣，鏡口率一般為0.050.950.050.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.51.5。普通光線的波長為普通光線的波長為400700nm400700nm，分辨力數(shù)值不會小于，分辨力數(shù)值不會小于.2m.2m，人眼的分辨力為人眼的分辨力為0.2mm,0.2mm,因此顯微鏡的最大設計倍數(shù)為因此顯微鏡的最大設計倍數(shù)為1000X1000X。細胞生物學（二）相差和微分干涉顯微技術（二）相差和微分干涉顯微技術干涉干涉: :兩列頻率相同的光波在兩列頻率相同的光波在空中相遇時發(fā)生疊加，在某些空中相遇時發(fā)生疊加，在某些區(qū)域總加強，在另外一些區(qū)域區(qū)域總加

5、強，在另外一些區(qū)域總減弱，出現(xiàn)明暗相間的條紋總減弱，出現(xiàn)明暗相間的條紋或者是彩色條紋的現(xiàn)象叫做光或者是彩色條紋的現(xiàn)象叫做光的干涉。的干涉。細胞生物學相差顯微鏡相差顯微鏡把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。1 1、環(huán)形光闌（、環(huán)形光闌（annular diaphragmannular diaphragm）：位于光源）：位于光源與聚光器之間。

6、與聚光器之間。2 2、相位板（、相位板（annular phaseplateannular phaseplate）：物鏡中加）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲光的相位推遲1/41/4。細胞生物學細胞生物學用途：觀察未經染色的玻片標本用途：觀察未經染色的玻片標本細胞生物學微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡 19521952年，年，NomarskiNomarski發(fā)明，微分干涉發(fā)明，微分干涉顯微鏡是以平面偏振光為光源，光顯微鏡是以平面偏振光為光源，光線經棱鏡折射后分成兩束，在不同線經棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經過樣品的相鄰部位，然后經

7、時間經過樣品的相鄰部位，然后經過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小差別就會轉化樣品中厚度上的微小差別就會轉化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造成了標本的人為三維立體感，類似成了標本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。大理石上的浮雕。 微分干涉顯微微分干涉顯微鏡適于研究活細胞中較大的細胞器，鏡適于研究活細胞中較大的細胞器，如果接上錄像裝置可以記錄活細胞如果接上錄像裝置可以記錄活細胞中的顆粒以及細胞器的運動。中的顆粒以及細胞器的運動。 細胞生物學（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡 特點：光源為紫外線，波特點：光源為紫外線，波長較短

8、，分辨力高于普通長較短，分辨力高于普通顯微鏡；顯微鏡；有兩個特殊的濾光片；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式照明方式通常為落射式。細胞生物學細胞生物學用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green細胞生物學（四）激光共聚焦掃描顯微境（四）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSMLaser

9、confocal scanning microscope, LCSM用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細胞樣品的立體結構。能顯示細胞樣品的立體結構。分辨力是普通光學顯微鏡的分辨力是普通光學顯微鏡的3 3倍。倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。成立體圖像。細胞生物學laser confocal scanning microscope, LCSM細胞生物學細胞生物學LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (

10、green) and the nucleus (blue)細胞生物學(五五)熒光共振能量轉移技術熒光共振能量轉移技術 CFPCFP的的發(fā)射發(fā)射光譜與光譜與YFPYFP的的吸收吸收光譜有相當?shù)闹毓庾V有相當?shù)闹丿B，當它們足夠接近時，用疊，當它們足夠接近時，用CFPCFP的吸收波長激的吸收波長激發(fā)，發(fā)，CFPCFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉移至移至YFPYFP的發(fā)色基團上，所以的發(fā)色基團上，所以CFPCFP的發(fā)射熒光將的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是減弱或消失，主要發(fā)射將是YFPYFP的熒光。的熒光。 細胞生物學細胞生物學應用應用: :1 1、檢測酶活性

11、變化、檢測酶活性變化 2 2、關于膜蛋白的研究、關于膜蛋白的研究 3 3、細胞膜受體之間相互作用、細胞膜受體之間相互作用4 4、細胞內分子之間相互作用、細胞內分子之間相互作用 細胞生物學( (六六) )熒光漂白恢復技術熒光漂白恢復技術FRAP (FRAP (光漂白后熒光恢復光漂白后熒光恢復) )就是在光漂白后對樣本確定就是在光漂白后對樣本確定區(qū)中的熒光恢復。區(qū)中的熒光恢復。FRAPFRAP是由沒有漂白的熒光團由周圍進是由沒有漂白的熒光團由周圍進入漂白區(qū)入漂白區(qū)FRAPFRAP的運動引起的。的運動引起的。FRAPFRAP用于測量用于測量2-2-維或維或3-3-維維分子運動的力度。分子運動包括膜或

12、活細胞內用熒光標分子運動的力度。分子運動包括膜或活細胞內用熒光標明的分子的擴散、轉移或其他類型的運動。明的分子的擴散、轉移或其他類型的運動。 細胞生物學二、電子二、電子顯微鏡顯微鏡（一）電（一）電子顯微鏡子顯微鏡的基本知的基本知識識1 1、電子、電子顯微鏡與顯微鏡與光學顯微光學顯微鏡的基本鏡的基本區(qū)別區(qū)別細胞生物學不同光線的波長不同光線的波長細胞生物學、電子顯微鏡的分辨本領和有效放大倍數(shù)、電子顯微鏡的分辨本領和有效放大倍數(shù)：是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率：是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電鏡分辨率受電鏡分辨率受制樣技術制樣技術的影響。的影響。細胞生物學、電子顯微鏡的基本構造、電子顯微鏡的基本構造

13、）電子束照明系統(tǒng)）電子束照明系統(tǒng)）成像系統(tǒng)）成像系統(tǒng)）真空系統(tǒng)）真空系統(tǒng)）記錄系統(tǒng)）記錄系統(tǒng)細胞生物學（二）、主要電鏡制樣技術介紹（二）、主要電鏡制樣技術介紹1 1、超薄切片技術、超薄切片技術電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅僅40-50nm40-50nm的超薄切片，的超薄切片，(1)(1)固定：固定：通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水(2)(2)包埋：包埋：環(huán)氧樹脂包埋環(huán)氧樹脂包埋(3)切片：切片：以熱膨脹或螺旋推進的方式切片以熱膨脹或螺旋推進的方式切片(4)染色：染色：重金屬（鈾、鉛）

14、鹽染色形成明暗的黑白圖象重金屬（鈾、鉛）鹽染色形成明暗的黑白圖象細胞生物學細胞生物學細胞生物學2 2、負染技術、負染技術用重金屬鹽用重金屬鹽( (如磷如磷鎢酸鎢酸) )對鋪展在載對鋪展在載網上的樣品染色；網上的樣品染色；吸去染料，干燥吸去染料，干燥后，樣品凹陷處后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地鹽，而凸的出地方沒有染料沉積，方沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達果，分辨力可達1.5nm1.5nm左右。左右。Negative Stained Actin細胞生物學3 3、冰凍蝕刻、冰凍蝕刻 freeze-freeze-etchingetching亦稱冰凍斷

15、裂。亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴升溫后，冰升華，暴露出了斷面結構。向露出了斷面結構。向斷裂面上噴涂一層蒸斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為膜剝下來，此膜即為復膜（復膜（replicareplica）。）。細胞生物學、電鏡三維重構技術、電鏡三維重構技術對樣品在不同的傾角拍照，得到圖片經處理對樣品在不同的傾角拍照，得到圖片經處理后而展現(xiàn)的電子密度圖。后而展現(xiàn)的電子密度圖。電鏡三維重構技術與電鏡三維重構技術與X-X-射線晶體衍射技術及核射線晶體衍射技術

16、及核磁共振磁共振 分析技術相結合，是當前結構生物學分析技術相結合，是當前結構生物學（Structural BiologyStructural Biology）（主要研究生物大分）（主要研究生物大分子空間結構及其相互關系）的主要實驗手段。子空間結構及其相互關系）的主要實驗手段。細胞生物學、掃描電鏡技術、掃描電鏡技術2020世紀世紀6060年代問世，用來觀察標本表面結構。年代問世，用來觀察標本表面結構。分辨力為分辨力為610nm610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm0.2mm，掃描電，掃描電鏡的有效放

17、大倍率為鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X0.2mm/10nm=20000X。細胞生物學Scanning electron microscope（ SEM）細胞生物學工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。描圖像。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標

18、本在固定、脫水為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。下發(fā)出次級電子信號。細胞生物學掃描電子顯微鏡原理掃描電子顯微鏡原理細胞生物學細胞生物學人類精子人類精子細胞生物學三、掃描隧道顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscopescanning tunneling microscope，原理：原理：根據(jù)隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個根據(jù)隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓納米的高

19、度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向為分辨率：橫向為0.10.2nm0.10.2nm，縱向可達，縱向可達0.001nm0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。細胞生物學掃描隧道顯微鏡原理掃描隧道顯微鏡原理細胞生物學第二

20、節(jié)第二節(jié) 細胞組分的分析方法細胞組分的分析方法一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物轉速為轉速為1025kr/min1025kr/min的離心機稱為高速離心機。的離心機稱為高速離心機。轉速轉速25kr/min25kr/min，離心力，離心力89K89K者稱為超速離心機。者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉速可達目前超速離心機的最高轉速可達100000r/min100000r/min，離心力，離心力超過超過500Kg500Kg。 細胞生物學超速離心技術：超速離心技術：用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。用途：分離大小相差懸殊的細

21、胞和細胞器。沉降順序：核沉降順序：核線粒體線粒體溶酶體與過氧化物溶酶體與過氧化物酶體酶體內質網與高基體內質網與高基體核蛋白體。核蛋白體。可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。心再行分離純化。 細胞生物學細胞生物學密度梯度離心密度梯度離心用介質在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，用介質在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。的作用使細胞分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質：氯化

22、銫、蔗糖、多聚蔗糖。常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細胞的介質要求：分離活細胞的介質要求：1 1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2 2）PHPH中性或易調為中性；中性或易調為中性；3 3）濃度大時滲透壓不大；）濃度大時滲透壓不大；4 4）對細胞無毒。）對細胞無毒。細胞生物學Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation細胞生物學二、細胞內核酸、蛋白質、糖與脂質等成分的顯示方法二、細胞內核酸、蛋白質、糖與脂質等成分的顯示方法、DNADNA經經1N1N鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打鹽酸

23、水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與基與SchiffSchiff試劑反應。試劑反應。SchiffSchiff試劑是由堿性品紅和偏重亞試劑是由堿性品紅和偏重亞硫酸鈉相作用，形成無色的品紅液，當無色品紅與醛基結硫酸鈉相作用，形成無色的品紅液，當無色品紅與醛基結合形成紫紅色的化合物。因此凡有合形成紫紅色的化合物。因此凡有DNADNA的地方，都能顯示的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色。、四氧化鋨與不飽和的脂肪酸反應呈黑色，證明脂肪滴的、四氧化鋨與不飽和的脂肪酸反應呈黑色，證明脂肪滴的存在，蘇丹存在，蘇

24、丹使脂滴呈深紅使脂滴呈深紅、蛋白質定性：米倫反應，重氮反應、蛋白質定性：米倫反應，重氮反應 細胞生物學三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性( (一一) )免疫熒光技術免疫熒光技術將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進行標記，試劑與標本中相將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進行標記，試劑與標本中相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的熒光素，這種免疫應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的熒光素，這種免疫技術，稱為免疫熒光素技術。技術，稱為免疫熒光素技術。常用的標記物有熒光素和酶。常用的標記物有熒光素和酶。免疫熒光法（免疫熒光法（immunofluorescent techniqueimmuno

25、fluorescent technique）：常用的螢）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標免疫法（酶標免疫法（enzyme-labeled antibody methodenzyme-labeled antibody method）：常用）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。細胞生物學間接法原理示意圖細胞生物學補體結合法原理示意圖細胞生物學( (二二) )免疫電鏡技術免疫電鏡技術又稱為又稱為免疫細胞化學技術免疫

26、細胞化學技術是在是在免疫組織化學技術免疫組織化學技術的基的基礎上發(fā)展起來的，它是利用抗原與抗體特異性結合的礎上發(fā)展起來的，它是利用抗原與抗體特異性結合的原理，在超微結構水平上定位、定性及半定量抗原的原理，在超微結構水平上定位、定性及半定量抗原的技術方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、技術方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細胞結構與功能的關系及其在病理情況下所發(fā)生研究細胞結構與功能的關系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術主要經歷了的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術主要經歷了鐵蛋白標記技術、酶標記技術以及膠體金標記技術三鐵蛋白標記技術、酶標記技術以及膠體

27、金標記技術三個主要發(fā)展階段。個主要發(fā)展階段。 細胞生物學鐵蛋白標記技術鐵蛋白標記技術適用于細胞膜表面抗原的定位，適用于細胞膜表面抗原的定位，由于其分子量較大，不易穿透細胞膜，定位細胞由于其分子量較大，不易穿透細胞膜，定位細胞內抗原較為困難。鐵蛋白對電鏡包埋劑的非特異內抗原較為困難。鐵蛋白對電鏡包埋劑的非特異性吸附很強，不適用于包埋后免疫標記，使其應性吸附很強，不適用于包埋后免疫標記，使其應用受到一定限制。用受到一定限制。 細胞生物學酶標記免疫電鏡技術酶標記免疫電鏡技術是將酶（主要是過氧化物酶）與是將酶（主要是過氧化物酶）與抗體相交聯(lián)，抗原抗體反應后，加底物顯示酶的活性抗體相交聯(lián)，抗原抗體反應后

28、，加底物顯示酶的活性部位，酶反應產物經部位，酶反應產物經OsO4OsO4處理變?yōu)榫哂幸欢娮用芴幚碜優(yōu)榫哂幸欢娮用芏鹊匿~黑，可在電鏡下觀察。過氧化物酶的相對分子度的鋨黑，可在電鏡下觀察。過氧化物酶的相對分子量較小，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經處理的細胞膜，量較小，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經處理的細胞膜，可用于細胞內抗原的定位。但是酶反應產物比較彌可用于細胞內抗原的定位。但是酶反應產物比較彌散，因此分辨率不如顆粒性標記物高。散，因此分辨率不如顆粒性標記物高。 細胞生物學膠體金標記免疫電鏡技術膠體金標記免疫電鏡技術是目前應用最廣的免疫電鏡標記物，是目前應用最廣的免疫電鏡標記物，該技術是將膠體金作為抗體

29、的標記物，用于細胞表面和細該技術是將膠體金作為抗體的標記物，用于細胞表面和細胞內多種抗原的精確定位。膠體金主要具有以下幾個優(yōu)點：胞內多種抗原的精確定位。膠體金主要具有以下幾個優(yōu)點：（1 1）膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活）膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯改變，可制備抗體性不發(fā)生明顯改變，可制備抗體- -膠體金、蛋白膠體金、蛋白A-A-膠體金、膠體金、卵白素卵白素- -膠體金、植物凝集素膠體金、植物凝集素- -膠體金等用于免疫電鏡；（膠體金等用于免疫電鏡；（2 2）在電鏡下金顆粒電子密度高、圓形且界線清晰，易于辨認，在電鏡下金顆粒電子密度高、圓形且界線清

30、晰，易于辨認，定位比酶反應物更精確；（定位比酶反應物更精確；（3 3）膠體金標記物易于制備，并）膠體金標記物易于制備，并可以根據(jù)需要制備大小不同（可以根據(jù)需要制備大小不同（1 1150nm150nm）的膠體金，因此）的膠體金，因此可進行免疫電鏡的雙重或多重標記；（可進行免疫電鏡的雙重或多重標記；（4 4）金顆粒能發(fā)射強）金顆粒能發(fā)射強烈的二次電子，是掃描電鏡的理想標記物；（烈的二次電子，是掃描電鏡的理想標記物；（5 5）膠體金經）膠體金經過銀顯影增強后，金顆粒外周吸附大量銀顆粒而呈現(xiàn)黑色過銀顯影增強后，金顆粒外周吸附大量銀顆粒而呈現(xiàn)黑色或黑褐色，因此也能用于光學顯微鏡觀察。此外，膠體金或黑褐色

31、，因此也能用于光學顯微鏡觀察。此外，膠體金還能用于冷凍蝕刻標本的免疫標記。還能用于冷凍蝕刻標本的免疫標記。 細胞生物學四、細胞內特異核酸序列的定位與定性四、細胞內特異核酸序列的定位與定性具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結合，形成適當條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNADNA-DNA，DNA-RNADNA-RNA或或RNA-RNARNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。（一）原位雜交（一）原位雜交

32、（in situin situ hybridization hybridization）用于檢測染色體上的特殊用于檢測染色體上的特殊DNADNA序列。最初是使用帶放序列。最初是使用帶放射性的射性的DNADNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。細胞生物學（二）（二）SouthernSouthern雜交雜交是體外分析特異是體外分析特異DNADNA序列的方法，操作時先用限制性序列的方法，操作時先用限制性內切酶將核內切酶將核DNADNA或線粒體或線粒體DNADNA切成切成DNADNA片段，經凝膠電片段，經凝膠電泳分離后，轉移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，泳分離后，轉移到醋酸

33、纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。苷序列。將將 R N AR N A 轉 移 到 薄 膜 上 ， 用 探 針 雜 交 ， 則 稱 為轉 移 到 薄 膜 上 ， 用 探 針 雜 交 ， 則 稱 為NorthernNorthern雜交雜交。細胞生物學五、應用放射自顯影技術五、應用放射自顯影技術研究生物大分子在細胞內的合成動態(tài)研究生物大分子在細胞內的合成動態(tài)用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。位、排出以及合

34、成、更新、作用機理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，經原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，經過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經放射性過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經放射性曝光，使乳膠感光。曝光，使乳膠感光。一般用一般用1414C C和和3 3H H標記。常用標記。常用3 3H-TDRH-TDR來顯示來顯示DNADNA，用，用3 3H-UDRH-UDR顯示顯示RNARNA；用；用3 3H H氨基酸研究蛋白質，用氨基酸研究蛋白質，用3 3H H甘露糖、甘露糖、3 3H H巖藻巖藻糖研究多糖。糖研究多糖。1414C C半衰期為半衰期為57305

35、730年，年，3 3H H為為12.512.5年。年。細胞生物學六、定量細胞化學分析技術六、定量細胞化學分析技術（一）流式細胞術（一）流式細胞術用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送發(fā)出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據(jù)這些性質分選入計算機處理，輸出統(tǒng)

36、計結果，并可根據(jù)這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%99%。包被細胞的液。包被細胞的液流 稱 為 鞘 液 ， 所 用 儀 器 稱 為 流 式 細 胞 計 （流 稱 為 鞘 液 ， 所 用 儀 器 稱 為 流 式 細 胞 計 （ f l o w f l o w cytometercytometer）。）。細胞生物學細胞生物學（二）顯微分光光度測定技術（二）顯微分光光度測定技術細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲

37、線。曲線。可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。和定量測定。細胞生物學七、七、PCR PCR 技術技術PCRPCR即：即：polymerase chain reactionpolymerase chain reaction。反應體系：樣品反應體系：樣品DNADNA；引物（；引物（primerprimer），約），約15-2015-20個核苷酸；個核苷酸；4 4種種dNTPdNTP；Tag DNATag DNA聚合酶，來自于嗜聚合酶，來自于嗜熱水生菌熱水生菌Thermus aquaticusThermus aquaticus，最適作用

38、溫度，最適作用溫度75807580，短時間在短時間在9595下不失活。緩沖體系和下不失活。緩沖體系和MgMg2+2+。反應過程：變性：約反應過程：變性：約90-9590-95；復性：約；復性：約6060左左右；延伸：右；延伸：70-7570-75；重復；重復 “變性變性復性復性延伸延伸” 過程過程20-3020-30次循環(huán)。次循環(huán)。細胞生物學PCR原理細胞生物學第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（群體培養(yǎng)（mass culturemass culture）：將含有一定數(shù)量細胞的懸）：將

39、含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluenceconfluence）后形成均勻的單細胞層；后形成均勻的單細胞層；克隆培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)（clonal cultureclonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。為克隆。轉鼓培養(yǎng)法：為制取細胞產品而設計，大容量旋轉轉鼓培養(yǎng)法：為制取細胞產品而設計，大容量旋轉培養(yǎng)，使培養(yǎng)的細胞始終處于懸浮狀態(tài)之中。培養(yǎng)，使培養(yǎng)的細胞始終處于懸浮狀態(tài)之中。 細胞生物學原

40、代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary cultureprimary culture）：即：培養(yǎng)直接來）：即：培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移到另自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（PassagePassage）。）。細胞株（細胞株（cell straincell strain）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。出的具有特定性質或標志的細胞群。細胞系細胞系（cell linecell line）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程

41、中發(fā)生突變或轉化的細胞，可無限繁殖。群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉化的細胞，可無限繁殖。 克?。寺。╟loneclone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。細胞生物學細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP20骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠實驗室中常用的幾種細胞系實驗室中常用的幾種細胞系細胞生物學（二）植物細胞培養(yǎng)（二

42、）植物細胞培養(yǎng)1.1. 外植體培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產生愈傷組織。用于研究植物：誘發(fā)產生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。代謝產物。2.2. 懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進行產業(yè)化大規(guī)模細胞培：適合于進行產業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產物。養(yǎng)，制取植物代謝產物。3.3. 原生質體培養(yǎng)原生質體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點： 比較容易攝取外來的遺傳物質，如比較容易攝取外來的遺傳物質，如DNADNA； 便于進行細胞融合，形成雜交細胞；便于進行細胞融合，形成雜交細胞； 適宜條件下可產生細胞壁

43、，經誘導分化成完適宜條件下可產生細胞壁，經誘導分化成完整植株。整植株。4.4. 單倍體培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。植株。細胞生物學Animal Cell Culture細胞生物學二、細胞工程二、細胞工程（一）細胞融合（一）細胞融合通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（細胞的過程稱為細胞融合（cell fusioncell fusion）或細胞雜交。）或細胞雜交。同核體同核體：相同基因型的細胞融合而成。：相同基因型的細胞融合而成。異核體：異核體：不同基因型

44、的細胞融合而成。不同基因型的細胞融合而成。自發(fā)融合：自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合。異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合。誘導細胞融合的方法：誘導細胞融合的方法：生物方法（仙臺病毒、副流感病毒生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒和新城雞瘟病毒 ）、化學方法（聚乙二醇）、化學方法（聚乙二醇PEGPEG）、物理方）、物理方法（電擊和激光）。法（電擊和激光）。細胞生物學單克隆抗體技術單克隆抗體技術正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分

45、泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人體。于是英國人KohlerKohler和和Milstein 1975Milstein 1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術，獲單克隆抗體技術，獲19841984年諾貝爾獎。年諾貝爾獎。細胞生物學（三）細胞拆合與顯微操作技術（三）細胞拆合與顯微操作技術、物理法：、物理法：用機械方法或短光波把細胞核去掉或使用機械方法或短光波把細胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他細胞的核，注入之失活，然后用微吸管吸取其他細胞的核，注入

46、去核的細胞質中，組成新的雜交細胞。去核的細胞質中，組成新的雜交細胞。、化學法、化學法：用細胞松弛素：用細胞松弛素B B處理細胞，細胞出現(xiàn)排處理細胞，細胞出現(xiàn)排核現(xiàn)象，再結合離心技術，將細胞拆分為核體和核現(xiàn)象，再結合離心技術，將細胞拆分為核體和胞質體兩部分，由于核體外表包有一層細胞質膜胞質體兩部分，由于核體外表包有一層細胞質膜和少量的胞漿，因而在和少量的胞漿，因而在PEGPEG或仙臺病毒的介導下，或仙臺病毒的介導下，核體可與另一胞質體融合，形成重組細胞。核體可與另一胞質體融合，形成重組細胞。細胞生物學第四節(jié)用于細胞生物學研究的模式生物第四節(jié)用于細胞生物學研究的模式生物生物學家通過對選定的生物物種

47、進行科學研究，生物學家通過對選定的生物物種進行科學研究，用于揭示某種具有用于揭示某種具有普遍規(guī)律普遍規(guī)律的生命現(xiàn)象，此時，這的生命現(xiàn)象，此時，這種被選定的生物物種就是模式生物。比如，孟德爾種被選定的生物物種就是模式生物。比如，孟德爾在揭示生物界遺傳規(guī)律時選用豌豆作為實驗材料，在揭示生物界遺傳規(guī)律時選用豌豆作為實驗材料，而摩根選用果蠅作為實驗材料，在他們的研究中，而摩根選用果蠅作為實驗材料，在他們的研究中，豌豆和果蠅就是研究生物體遺傳規(guī)律的模式生物。豌豆和果蠅就是研究生物體遺傳規(guī)律的模式生物。 細胞生物學模式生物的特點有模式生物的特點有: :1)1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群。生理特征能

48、夠代表生物界的某一大類群。2)2)容易獲得并易于在實驗室內飼養(yǎng)繁殖。容易獲得并易于在實驗室內飼養(yǎng)繁殖。3)3)容易進行實驗操作容易進行實驗操作, ,特別是遺傳學分析。特別是遺傳學分析。4)4)個體較小個體較小, ,生長繁殖快生長繁殖快。生命科學研究中常用的模式生物有：生命科學研究中常用的模式生物有：病毒，細菌，酵母，原生動物，黏菌，蛙，海膽，病毒，細菌，酵母，原生動物，黏菌，蛙，海膽，線蟲，果蠅，斑馬魚，小鼠線蟲，果蠅，斑馬魚，小鼠細胞生物學、病毒：、病毒：）特點：）特點：結構簡單（殼體和核酸）結構簡單（殼體和核酸）進入細胞才能進行復制進入細胞才能進行復制）應用：）應用：適合遺傳操作，進行有關

49、生物大分子之間的相互作適合遺傳操作，進行有關生物大分子之間的相互作用，基因表達調空腫瘤的發(fā)生和防治等研究。用，基因表達調空腫瘤的發(fā)生和防治等研究。作為外源基因的載體，用于蛋白質功能的研究以及作為外源基因的載體，用于蛋白質功能的研究以及腫瘤的基因治療腫瘤的基因治療細胞生物學、細菌、細菌）特點：）特點：細菌培養(yǎng)方便，生長快，細菌培養(yǎng)方便，生長快，基因結構簡單，突變株的誘變和分離、鑒定容易基因結構簡單，突變株的誘變和分離、鑒定容易轉基因技術成熟，進行基因定位簡便易行。轉基因技術成熟，進行基因定位簡便易行。）應用：）應用：轉基因技術。轉基因技術?；虻谋磉_調控基因的表達調控細胞生物學、酵母、酵母）特點

50、）特點是單細胞生物是單細胞生物, ,可在基本培養(yǎng)基上生長可在基本培養(yǎng)基上生長, ,可通過改可通過改變物理或化學環(huán)境完全控制其生長變物理或化學環(huán)境完全控制其生長在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均可生長在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均可生長, ,并可在實驗并可在實驗條件下控制單倍體和二倍體之間的相互轉換條件下控制單倍體和二倍體之間的相互轉換, ,這對這對其基因功能的研究十分有利其基因功能的研究十分有利有將近有將近31%31%編碼蛋白質的基因或編碼蛋白質的基因或ORFORF與哺乳動物編與哺乳動物編碼蛋白質的基因有高度的同源性碼蛋白質的基因有高度的同源性細胞生物學）應用：）應用：細胞周期調控，細胞周期調控，P34P34cdc28 cdc28 突變，細胞停留在突變，細胞停留在G G1 1/S/S P34P34cdc2cdc2突變，細胞停留在突變，細胞停留在G G/S /S 利用酵母基因突變?yōu)榛虮磉_調控，膜泡運輸，細利用酵母基因突變?yōu)榛虮磉_調控，膜泡運輸，細胞分化，衰老等研究領域提供研究材料胞分化，衰老等研究領域提供研究材料細胞生物學、線蟲、線蟲）特點）特點: :通身透明通身透明, ,長不過長不過1mm1mm身體中所有細胞能被逐個盤點并各歸其