細菌分離與鑒定方ppt課件

1、細菌分別與鑒定方法細菌分別與鑒定方法 嗜水氣單胞菌分別鑒定嗜水氣單胞菌分別鑒定分別方法分別方法細菌的生長情況察看細菌的生長情況察看氧化酶實驗氧化酶實驗AHM鑒別培育鑒別培育吲哚實驗吲哚實驗革蘭氏染色法革蘭氏染色法糖發(fā)酵實驗糖發(fā)酵實驗脫脂奶平板實驗酪蛋白胨化實驗脫脂奶平板實驗酪蛋白胨化實驗分別方法分別方法用途用途:在檢查含兩種或兩種以上的待檢資料如肝、脾、在檢查含兩種或兩種以上的待檢資料如肝、脾、腎、心、肌肉等中的某種細菌時，須先將待腎、心、肌肉等中的某種細菌時，須先將待檢資料進展分別培育。常用的分別培育方法是檢資料進展分別培育。常用的分別培育方法是瓊脂平皿分區(qū)劃線法，是借劃線將混雜的細菌瓊脂平

2、皿分區(qū)劃線法，是借劃線將混雜的細菌在瓊脂平皿外表分散開來，使個別的細菌能固在瓊脂平皿外表分散開來，使個別的細菌能固定在某一點，經(jīng)培育生長繁衍后構(gòu)成單個菌落，定在某一點，經(jīng)培育生長繁衍后構(gòu)成單個菌落，以到達分別獲得純種細菌的目的。以到達分別獲得純種細菌的目的。分別方法分別方法詳細操作方法如下：詳細操作方法如下：點燃酒精燈，右手執(zhí)筆式握持接種環(huán)見圖點燃酒精燈，右手執(zhí)筆式握持接種環(huán)見圖1，在酒精燈火焰上，在酒精燈火焰上燒灼接種環(huán)，待冷，取待測菌液一環(huán)。燒灼接種環(huán)，待冷，取待測菌液一環(huán)。左手抓握瓊脂培育基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿左手抓握瓊脂培育基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿

3、的蓋略抬起一些，進展接種見圖的蓋略抬起一些，進展接種見圖2?；蛘撸瑢⑵矫蟮纳w留在。或者，將平皿的蓋留在實驗臺上，盡量直立平皿接近酒精燈火焰，右手持接種環(huán)在瓊脂實驗臺上，盡量直立平皿接近酒精燈火焰，右手持接種環(huán)在瓊脂外表的一端即外表的一端即1區(qū)，約占整個平皿的區(qū)，約占整個平皿的1/61/5涂布，劃線時，涂布，劃線時，接種環(huán)與瓊脂外表呈接種環(huán)與瓊脂外表呈 3040的角度悄然接觸，利用腕力動作，的角度悄然接觸，利用腕力動作，切忌劃破瓊脂外表。燒灼接種環(huán)，待冷后，將接種環(huán)經(jīng)過切忌劃破瓊脂外表。燒灼接種環(huán)，待冷后，將接種環(huán)經(jīng)過1區(qū)劃區(qū)劃線數(shù)次，在線數(shù)次，在2區(qū)作延續(xù)劃線，各線條間隔要小，但不能重疊。劃區(qū)

4、作延續(xù)劃線，各線條間隔要小，但不能重疊。劃滿平皿的滿平皿的1/51/4區(qū)域，劃完區(qū)域，劃完2區(qū)不需燒灼接種環(huán)，繼續(xù)經(jīng)過區(qū)不需燒灼接種環(huán)，繼續(xù)經(jīng)過2區(qū)區(qū)數(shù)次，在數(shù)次，在3區(qū)作延續(xù)劃線，如此反復(fù)至劃完好個平皿如圖區(qū)作延續(xù)劃線，如此反復(fù)至劃完好個平皿如圖3。 圖1 接種環(huán)的握持方法圖2 平皿的握持方法1區(qū)4區(qū)3區(qū)2區(qū)圖3 劃線分別的方法 左：分區(qū) 右：培育后的結(jié)果分別方法分別方法 接種終了，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號接種終了，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號筆注明標(biāo)本稱號、接種時間、接種者等。然后將筆注明標(biāo)本稱號、接種時間、接種者等。然后將平皿的底朝上，放置在平皿的底朝上，放置在37孵箱內(nèi)孵育

5、孵箱內(nèi)孵育24h。 取出后察看瓊脂外表的菌落分布情況見圖取出后察看瓊脂外表的菌落分布情況見圖3，留意察看最后留意察看最后12區(qū)內(nèi)能否分別出單個菌落，并區(qū)內(nèi)能否分別出單個菌落，并察看記錄菌落特征如菌落大小、外形、透明度、察看記錄菌落特征如菌落大小、外形、透明度、色素等情況。色素等情況。 爛鰓病病原菌平板劃線分別：爛鰓病病原菌平板劃線分別： 取病魚鰓絲一小塊，置于滴有無菌水的載玻取病魚鰓絲一小塊，置于滴有無菌水的載玻片的邊緣，片的邊緣，10分鐘，用接種環(huán)蘸水，在胰胨瓊脂培分鐘，用接種環(huán)蘸水，在胰胨瓊脂培育基上劃線。育基上劃線。 腸炎病病原菌劃線分別：腸炎病病原菌劃線分別： 用用70%酒精棉球擦拭魚

6、體，無菌條件下，取酒精棉球擦拭魚體，無菌條件下，取病魚的肝或脾或腎或心于普通營養(yǎng)瓊脂基劃線分別。病魚的肝或脾或腎或心于普通營養(yǎng)瓊脂基劃線分別。 赤皮病病原菌劃線分別：赤皮病病原菌劃線分別： 用刀片刮除病灶腐爛部分后用接種環(huán)掛取病用刀片刮除病灶腐爛部分后用接種環(huán)掛取病料，在普通營養(yǎng)瓊脂培育基上平板劃線。料，在普通營養(yǎng)瓊脂培育基上平板劃線。28培育培育24h。細菌的生長情況察看細菌的生長情況察看原理原理 細菌于適宜條件下在不同的培育基上生長，細菌于適宜條件下在不同的培育基上生長，其生長形狀不同。不同細菌在同一種培育基中生其生長形狀不同。不同細菌在同一種培育基中生長，生長特點也不一樣。這些區(qū)別稱之為

7、培育特長，生長特點也不一樣。這些區(qū)別稱之為培育特征，是鑒別細菌和細菌分類的根據(jù)之一。征，是鑒別細菌和細菌分類的根據(jù)之一。 把細菌接種在固體培育基上，在適宜的條件把細菌接種在固體培育基上，在適宜的條件下經(jīng)過一定時間的培育，在培育基外表或內(nèi)部下經(jīng)過一定時間的培育，在培育基外表或內(nèi)部構(gòu)成肉眼可見的有一個細菌大量繁衍后而成的集構(gòu)成肉眼可見的有一個細菌大量繁衍后而成的集團，稱之為菌落。不同細菌的菌落大小、光濁度、團，稱之為菌落。不同細菌的菌落大小、光濁度、色澤均有其特征。色澤均有其特征。普通瓊脂平板牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g氯化氯化鈉NaCL 5.0g磷酸二氫鉀KH2PO4 1.0g瓊脂 15

8、.0g蒸餾水 1000mL混勻，加熱溶解，調(diào)PH至7.6分裝，112kPa高壓滅菌15min，冷卻至45傾注滅菌平板。直徑90cm平皿每皿傾入1520ml培育基，培育基過少，劃線分別時細菌的營養(yǎng)較少，菌落生長過小，菌落形狀不易察看，培育基也易于枯燥，不易在數(shù)天內(nèi)對菌落形狀進展察看。 含糖培育基滅菌條件115，1015分鐘 普通培育基滅菌條件121，1520分鐘細菌的生長情況察看細菌的生長情況察看 在無菌平皿中，倒入溶化后在無菌平皿中，倒入溶化后50普通營養(yǎng)瓊脂培育基，每普通營養(yǎng)瓊脂培育基，每皿約皿約 20毫升，程度靜置待凝固。用接種環(huán)挑去待分別菌毫升，程度靜置待凝固。用接種環(huán)挑去待分別菌株分區(qū)

9、劃線，株分區(qū)劃線，28培育培育24h。 菌落形狀察看：菌落形狀察看： 大小：以毫米計。大小：以毫米計。 外形：圓形、不規(guī)那么形、放射狀等。外形：圓形、不規(guī)那么形、放射狀等。 外表：光滑、粗糙、圓環(huán)狀、乳突狀等。外表：光滑、粗糙、圓環(huán)狀、乳突狀等。 邊緣：整齊、波形、鋸齒狀等。邊緣：整齊、波形、鋸齒狀等。 色素：有顏色，顏色，能否可溶等。色素：有顏色，顏色，能否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。透明度：透明、半透明、不透明。 嗜水氣單胞菌菌落為光滑、微凸、圓整、無色或嗜水氣單胞菌菌落為光滑、微凸、圓整、無色或淡黃色，有特殊芳香氣味。淡黃色，有特殊芳香氣味。氧化酶實驗氧化酶實驗原理原理 氧化

10、酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，系由細胞色色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，系由細胞色素素a和和a3所組成，普通僅存于需氧菌和兼性所組成，普通僅存于需氧菌和兼性厭氧菌中，它使細菌能利用氧作為氫的最終厭氧菌中，它使細菌能利用氧作為氫的最終受體，使分子氧復(fù)原為過氧化氫，過氧化氫受體，使分子氧復(fù)原為過氧化氫，過氧化氫的積累會有毒性，固本實驗的陽性菌，不僅的積累會有毒性，固本實驗的陽性菌，不僅需氧而且能產(chǎn)生過氧化氫酶。氧化酶并不是需氧而且能產(chǎn)生過氧化氫酶。氧化酶并不是直接與試劑起反響，而是先使細胞色素直接與試劑起反響，而是先使細胞色素c氧氧化，然后此氧

11、化型細胞色素化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反響，因此本實驗實踐也是氧化，產(chǎn)生顏色反響，因此本實驗實踐也是測定細胞色素測定細胞色素c能否存在。能否存在。氧化酶實驗氧化酶實驗 試劑試劑 1%鹽酸二甲基對苯二胺水溶液或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液或1%二鹽酸四甲基對苯二胺水二鹽酸四甲基對苯二胺水溶液。溶液。 方法方法 在干凈的培育皿中放一張濾紙，滴上二甲基對本二胺的在干凈的培育皿中放一張濾紙，滴上二甲基對本二胺的1%水水溶液，僅使濾紙潮濕即可，不可過濕。用白金絲接種環(huán)不可用溶液，僅使濾紙潮濕即可，不可過濕。用白金絲接種環(huán)不可用鎳鉻絲取鎳鉻絲取1824小時的菌苔，涂抹在潮

12、濕的濾紙上，在小時的菌苔，涂抹在潮濕的濾紙上，在10s內(nèi)內(nèi)涂抹菌苔現(xiàn)紅色者這為陽性，涂抹菌苔現(xiàn)紅色者這為陽性，(四甲基對本二胺呈藍色四甲基對本二胺呈藍色)，1060s現(xiàn)紅色者為延遲反響，現(xiàn)紅色者為延遲反響，60s以上現(xiàn)紅色者不計，按陰性處置。以上現(xiàn)紅色者不計，按陰性處置。 嗜水氣單胞菌為陽性。嗜水氣單胞菌為陽性。氧化酶實驗氧化酶實驗本卷須知本卷須知二甲基對本二胺溶液易于氧化，普通于冰箱二甲基對本二胺溶液易于氧化，普通于冰箱中儲存兩周。如溶液顏色轉(zhuǎn)紅褐色，那么中儲存兩周。如溶液顏色轉(zhuǎn)紅褐色，那么不宜運用。不宜運用。鐵、鎳等金屬可催化二甲基對苯二胺呈紅色，鐵、鎳等金屬可催化二甲基對苯二胺呈紅色，故

13、不宜用以上資料取菌苔。如無白金絲，故不宜用以上資料取菌苔。如無白金絲，可用玻棒或滅菌牙簽取菌苔涂抹?？捎貌０艋驕缇篮炄【ν磕āＴ跒V紙上滴加試液已剛剛潮濕為宜。如濾紙在濾紙上滴加試液已剛剛潮濕為宜。如濾紙過濕，妨礙空氣與菌苔接觸，延伸顯色時過濕，妨礙空氣與菌苔接觸，延伸顯色時間，呵斥假陰性。間，呵斥假陰性。AHM鑒別培育鑒別培育AHM為為Aeromonas Hydrophila Medium 的縮寫。的縮寫。用于可疑氣單胞菌菌落的鑒定。用于可疑氣單胞菌菌落的鑒定。AHM鑒別培育基鑒別培育基成分成分蛋白胨蛋白胨 5.0g酵母提取物酵母提取物 3.0g 胰蛋白胨胰蛋白胨 10.0gL-鹽酸鳥氨酸

14、鹽酸鳥氨酸 5.0g甘露醇甘露醇 1.0g肌醇肌醇 10.0g硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉Na2S2O35H2O 0.4g枸椽酸鐵胺枸椽酸鐵胺 0.5g溴甲酚紫溴甲酚紫 0.02g瓊脂瓊脂 3.0g蒸餾水蒸餾水 1000mL制法制法 將各種成分除溴甲酚紫外溶化于將各種成分除溴甲酚紫外溶化于1升水中，調(diào)升水中，調(diào)pH6.7，參與溴甲酚紫，混，參與溴甲酚紫，混勻煮沸。分裝于勻煮沸。分裝于13100mm試管，每管試管，每管 5.0ml，于，于121，滅菌，滅菌15分鐘。溴分鐘。溴甲酚紫的有效甲酚紫的有效pH范圍范圍5.26.8，顏色變化：黃紫，顏色變化：黃紫AHM鑒別培育鑒別培育方法方法以接種針挑取可疑菌落

15、，穿刺接種達于管底，以接種針挑取可疑菌落，穿刺接種達于管底，置置352培育培育1824h，如反響不一定，如反響不一定，可繼續(xù)培育可繼續(xù)培育1824h。氣單胞菌典型反響為培育基管底部為變黃，氣單胞菌典型反響為培育基管底部為變黃，在接近于試管頂部有紫色帶出現(xiàn)。此闡明在接近于試管頂部有紫色帶出現(xiàn)。此闡明反由于甘露醇陽性，肌醇陰性，鳥氨酸脫反由于甘露醇陽性，肌醇陰性，鳥氨酸脫羧酶陰性鳥氨酸脫羧產(chǎn)生腐胺，可使培羧酶陰性鳥氨酸脫羧產(chǎn)生腐胺，可使培育基由酸變堿。有時僅在試管頂端部有育基由酸變堿。有時僅在試管頂端部有細微變黑，此闡明是因分解半胱氨酸產(chǎn)生細微變黑，此闡明是因分解半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫所致。沿穿刺線全

16、部呈混濁狀，闡硫化氫所致。沿穿刺線全部呈混濁狀，闡明該菌具有動力。明該菌具有動力。吲哚實驗吲哚實驗原理原理 細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(靛基質(zhì)靛基質(zhì))，經(jīng)與試劑中的經(jīng)與試劑中的 對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。哚而呈紅色。培育基培育基 1%蛋白胨水水溶液：調(diào)蛋白胨水水溶液：調(diào)pH7.27.6，分裝于，分裝于1/31/4試管，試管，115蒸汽滅菌蒸汽滅菌30分鐘。分鐘。Kovacs 試劑試劑對二甲基氨基苯甲醛對二甲基氨基苯甲醛 5.0g 戊醇戊醇 75gml 濃鹽酸濃鹽酸 25ml吲哚實驗吲哚實驗方法方法將

17、新穎的菌種接種與上述培育基中，將新穎的菌種接種與上述培育基中，28培育培育24 h。沿管壁漸漸參與沿管壁漸漸參與35mm高的高的Kovacs試劑于培育液試劑于培育液外表，在液層界面發(fā)生紅色，即為陽性反響。假設(shè)外表，在液層界面發(fā)生紅色，即為陽性反響。假設(shè)顏色不明顯，可加顏色不明顯，可加45滴乙醚至培育基，搖動，使滴乙醚至培育基，搖動，使乙醚分散于液體中，將培育液靜置片刻，待乙醚浮乙醚分散于液體中，將培育液靜置片刻，待乙醚浮至液面后，在加吲哚試劑。如培育液中有吲哚時，至液面后，在加吲哚試劑。如培育液中有吲哚時，吲哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反響，吲哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反

18、響，那么顏色明顯。那么顏色明顯。嗜水氣單胞菌吲哚實驗陽性嗜水氣單胞菌吲哚實驗陽性革蘭氏染色法革蘭氏染色法 由丹麥病理學(xué)家Christain Gram創(chuàng)建，用于細菌分類學(xué)研討。 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)建的，用于細菌分類學(xué)研討。革蘭氏染色法是細菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。 革蘭氏染色法可將一切的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G-兩大類。革蘭氏染色法根本原理革蘭氏染色法根本原理 用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。中性染料是前

19、兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。 因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料如美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等使其著色。當(dāng)細菌分解糖類產(chǎn)酸使培育基pH下降時，細菌所帶正電荷添加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。革蘭氏染色原理革蘭氏染色原理革蘭氏染色過程：結(jié)晶紫初染革蘭氏染色過程：結(jié)晶紫初染 碘液碘液 媒染媒染 95%乙醇乙醇 脫色脫色 番紅花紅番紅花紅 復(fù)染。復(fù)染。初染：當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，一切細菌都被染成初染劑的初染：當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，一切細菌都被染成初染劑的藍紫色。藍紫色。媒染：碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合

20、成結(jié)晶紫一碘媒染：碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而加強了染料與細菌的結(jié)合力。的復(fù)合物，從而加強了染料與細菌的結(jié)合力。脫色：當(dāng)用脫色劑處置時，兩類細菌的脫色效果是不同脫色：當(dāng)用脫色劑處置時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌結(jié)晶紫的。革蘭氏陽性細菌結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而碘的復(fù)合物不易被洗脫而保管在細胞內(nèi)，革蘭氏陰性菌結(jié)晶紫保管在細胞內(nèi)，革蘭氏陰性菌結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來。容易被洗脫出來。復(fù)染：革蘭氏陽性細菌仍保管初染時的顏色，呈紫色。復(fù)染：革蘭氏陽性細菌仍保管初染時的顏色，呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏染

21、色法原理革蘭氏染色法原理 革蘭氏染色法之所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰革蘭氏染色法之所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的構(gòu)造和組成不同決議的。性，是由這兩類細菌細胞壁的構(gòu)造和組成不同決議的。 細菌細胞壁的構(gòu)造細菌細胞壁的構(gòu)造G菌：細胞壁主要由肽聚糖構(gòu)成的網(wǎng)狀構(gòu)造組成，細胞壁菌：細胞壁主要由肽聚糖構(gòu)成的網(wǎng)狀構(gòu)造組成，細胞壁厚，構(gòu)造致密，類脂質(zhì)含量低，用脫色劑處置后，肽聚糖厚，構(gòu)造致密，類脂質(zhì)含量低，用脫色劑處置后，肽聚糖脫水而孔徑減少，通透性降低，故革蘭氏染色后細菌仍保脫水而孔徑減少，通透性降低，故革蘭氏染色后細菌仍保管初染時的顏色，呈紫色。管初染時的顏色，呈紫色

22、。G菌：其細胞壁肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，類脂含量高，故菌：其細胞壁肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，類脂含量高，故脫色時，類脂質(zhì)被乙醇脫色時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用番紅花紅碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用番紅花紅復(fù)染后，細菌被染上復(fù)染劑的顏色，即紅色。復(fù)染后，細菌被染上復(fù)染劑的顏色，即紅色。革蘭氏染色法革蘭氏染色法資料資料嗜水氣單胞菌，葡萄球菌嗜水氣單胞菌，葡萄球菌革蘭氏染色液；載玻片；顯微鏡等。革蘭氏染色液；載玻片；顯微鏡等。方法方法涂片：涂片：1取載玻片一張，試凈。取載玻片一張，試凈。 2用滅菌的接種

23、環(huán)取生理鹽水一滴，放于載玻片的中央如被檢資料是液體，可不用滅菌的接種環(huán)取生理鹽水一滴，放于載玻片的中央如被檢資料是液體，可不加生理鹽水。加生理鹽水。 3左手斜持菌種管，右手將菌種管棉塞稍加轉(zhuǎn)動，以便拔下。左手斜持菌種管，右手將菌種管棉塞稍加轉(zhuǎn)動，以便拔下。4右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌后，用右手小指拔開菌種管棉塞，管口經(jīng)過火焰，用右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌后，用右手小指拔開菌種管棉塞，管口經(jīng)過火焰，用接種環(huán)取少量菌切不可過多。接種環(huán)取少量菌切不可過多。5管口再經(jīng)過火焰，塞好棉塞。管口再經(jīng)過火焰，塞好棉塞。6將接種環(huán)上的細菌加到載玻片的水滴內(nèi)，磨勻，涂成直徑約將接種環(huán)上的細菌加到載玻片的水滴內(nèi)，磨勻，

24、涂成直徑約1厘米大小的薄薄菌膜。厘米大小的薄薄菌膜?？菰铮簩⒉Ｆ糜诳諝庵校蛊渥匀豢菰?。枯燥：將玻片置于空氣中，使其自然枯燥。固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，經(jīng)過火焰固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，經(jīng)過火焰2-3次固定以不燙手為宜次固定以不燙手為宜枯燥后將涂片在火焰上漸漸經(jīng)過三次，其目的是使細菌粘于玻片上，染色和沖水時不易枯燥后將涂片在火焰上漸漸經(jīng)過三次，其目的是使細菌粘于玻片上，染色和沖水時不易零落；且細菌為蛋白質(zhì)，被熱凝固后可堅持完好形狀。零落；且細菌為蛋白質(zhì)，被熱凝固后可堅持完好形狀。固定時經(jīng)過火焰固定時經(jīng)過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。次即可，不可過熱，以載玻片不燙手

25、為宜。革蘭氏染色法革蘭氏染色法染色：初染染色：初染 媒染媒染 脫色脫色 復(fù)染復(fù)染初染：加草酸結(jié)晶紫染液于標(biāo)本上，使其覆滿標(biāo)本，染初染：加草酸結(jié)晶紫染液于標(biāo)本上，使其覆滿標(biāo)本，染12分鐘，水洗。分鐘，水洗。媒染：滴加碘液沖去殘水，并堅持碘液覆蓋媒染：滴加碘液沖去殘水，并堅持碘液覆蓋1分鐘，水洗。分鐘，水洗。脫色：加脫色：加95%酒精于玻片上來回流動，傾去酒精。如此反復(fù)酒精于玻片上來回流動，傾去酒精。如此反復(fù)23次約次約30秒。秒。水洗。水洗。 或用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加或用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95的乙醇脫色，直至流出的乙醇

26、無紫色。約的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色。約2030秒鐘，立刻用水沖凈酒精立秒鐘，立刻用水沖凈酒精立刻水洗。刻水洗。復(fù)染：加番紅花紅沙黃液、稀釋復(fù)紅等，染約復(fù)染：加番紅花紅沙黃液、稀釋復(fù)紅等，染約1分鐘。水洗、枯燥。分鐘。水洗、枯燥。鏡檢：枯燥后用顯微鏡察看。革蘭氏陰性菌成紅色。革蘭氏陽性均呈紫色。鏡檢：枯燥后用顯微鏡察看。革蘭氏陰性菌成紅色。革蘭氏陽性均呈紫色。以分散開的細菌革蘭氏染色反響為準(zhǔn)。過于密集的細菌染色后經(jīng)常呈假陽性。以分散開的細菌革蘭氏染色反響為準(zhǔn)。過于密集的細菌染色后經(jīng)常呈假陽性。同法在同一載玻片上以大腸桿菌和葡萄球菌混合紙片，作革蘭氏染色對比。同法在同一載玻片上以大腸桿菌和

27、葡萄球菌混合紙片，作革蘭氏染色對比。革蘭氏染色法革蘭氏染色法 革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)厲掌握酒精脫色程度，如脫色過革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)厲掌握酒精脫色程度，如脫色過度，那么陽性菌被誤染為陰性菌。此外，菌齡也影響染色度，那么陽性菌被誤染為陰性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培育時間過長，或已死及部分自行溶解，結(jié)果，如陽性菌培育時間過長，或已死及部分自行溶解，都常呈陰性反響。都常呈陰性反響。 結(jié)果與思索結(jié)果與思索 在他所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和葡萄球菌被染在他所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和葡萄球菌被染成何種顏色？它們是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌？成何種顏色？它們是革蘭氏陽性菌還是

28、革蘭氏陰性菌？ 作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃重？其染色成敗的關(guān)作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃重？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？鍵一步是什么？ 當(dāng)他對一株未知菌進展革蘭氏染色時，怎樣能保證他的染當(dāng)他對一株未知菌進展革蘭氏染色時，怎樣能保證他的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？ G+ G-另一判別方法：取另一判別方法：取40ul 3%NaOH滴加于干凈的載滴加于干凈的載波片上，用接種環(huán)刮去平板單個菌苔適量，在波片上，用接種環(huán)刮去平板單個菌苔適量，在NaOH滴上滴上研磨研磨40S，用接種環(huán)挑起，假設(shè)有拉絲景象，那么為，用接種環(huán)挑起，假設(shè)有拉絲景象，那么為G-，否那么為否那么為

29、G+糖發(fā)酵實驗糖發(fā)酵實驗原理原理各種細菌因含有發(fā)酵不同糖類的酶，所以分解糖類的才各種細菌因含有發(fā)酵不同糖類的酶，所以分解糖類的才干各不一樣，有的能分解多種糖類，有的僅能分解干各不一樣，有的能分解多種糖類，有的僅能分解12中糖類，還有不能分解。細菌分解多糖類，如中糖類，還有不能分解。細菌分解多糖類，如淀粉、菊糖等，因其分子較大，不能進入細菌細胞，淀粉、菊糖等，因其分子較大，不能進入細菌細胞，必需被細菌分泌的胞外酶水解后，才干為細菌吸收必需被細菌分泌的胞外酶水解后，才干為細菌吸收利用。雙糖也要胞外酶水解為單糖后被細菌所利用。利用。雙糖也要胞外酶水解為單糖后被細菌所利用。細菌利用的單糖主要有葡萄糖、

30、果糖等，細菌發(fā)酵細菌利用的單糖主要有葡萄糖、果糖等，細菌發(fā)酵葡萄糖可產(chǎn)生丙酮酸，生成乳酸、琥珀酸、甲酸、葡萄糖可產(chǎn)生丙酮酸，生成乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸等有機酸，并生成醇類和氣體乙酸等有機酸，并生成醇類和氣體CO2和和H2。細菌分解糖類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可因菌種的不同而細菌分解糖類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可因菌種的不同而異，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的那么僅產(chǎn)酸，故可利用異，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的那么僅產(chǎn)酸，故可利用此特點以鑒別細菌。此特點以鑒別細菌。糖發(fā)酵實驗糖發(fā)酵實驗培育基培育基蛋白胨蛋白胨 5.0g溴甲酚紫溴甲酚紫0.04% 15 ml蒸餾水蒸餾水1000mL,調(diào)調(diào)PH至至7.4,分裝，每瓶分裝，每瓶100

31、ml每每100ml蛋白胨水中分別參與葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、蛋白胨水中分別參與葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷及水楊苷七葉苷及水楊苷1.0g，充分溶解，分裝試管，充分溶解，分裝試管，106.44kPa高壓滅菌高壓滅菌10min。方法方法以幼齡斜面培育物分別接種上述發(fā)酵管，以幼齡斜面培育物分別接種上述發(fā)酵管，28培育培育24 h。凡實驗管顏色從紫色變?yōu)辄S色，闡明細菌可發(fā)。凡實驗管顏色從紫色變?yōu)辄S色，闡明細菌可發(fā)酵該種糖類，判為陽性。酵該種糖類，判為陽性。 嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上5種糖類。種糖類。脫脂奶平板實驗酪蛋白胨化實驗脫脂奶平板實驗酪蛋白胨化實驗原理原理大部分細菌無直接分解蛋白質(zhì)的才干，多是利用蛋大部分細菌無直接分解蛋白質(zhì)的才干，多是利用蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，如蛋白胨和氨基酸等為其氮白質(zhì)的分解產(chǎn)物，如蛋白胨和氨基酸等為其氮源。源。細菌分解蛋白質(zhì)是依賴于蛋白酶和肽酶的作用，前細菌分解蛋白質(zhì)是依賴于蛋白酶和肽酶的作用，前者為胞外酶，能水解蛋白質(zhì)為多肽和簡單的肽，者為胞外酶，能水解蛋白質(zhì)為多肽和簡單的肽，有時可釋放出少量氨基酸，其功用是使不能吸有時可釋放出少量氨基酸，其功用是使不能吸收的蛋白量變?yōu)榭梢酝溉刖毎麅?nèi)的多肽或氨收的蛋白量變?yōu)榭梢酝?/p>