氨基酸含量的測定-茚三酮比色法

1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 氨基酸含量的測定氨基酸含量的測定（茚三酮比色法）（茚三酮比色法）1. 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白質(zhì)、多肽、凡含有自由氨基的化合物，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在堿性溶液中與水合茚三氨基酸（脯氨酸除外）在堿性溶液中與水合茚三酮共熱時，產(chǎn)生酮共熱時，產(chǎn)生紫色化合物紫色化合物，最大吸收波長在，最大吸收波長在570nm處，在一定濃度范圍內(nèi)，顏色深淺與氨基處，在一定濃度范圍內(nèi)，顏色深淺與氨基酸含量成正比，可用比色法進(jìn)行測定。酸含量成正比，可用比色法進(jìn)行測定。 氨基酸與茚三酮的反應(yīng)分兩個步驟：氨基酸與茚三酮的反應(yīng)分兩個步驟：2. 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑實(shí)驗(yàn)材料、儀

2、器與試劑材料：材料：醬油醬油儀器：儀器：可見分光光度計(jì)，分析天平，容量可見分光光度計(jì)，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度試管。瓶，移液管，具塞刻度試管。試劑：試劑：茚三酮、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、茚三酮、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（異亮氨酸）。磷酸氫二鈉、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（異亮氨酸）。3. 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（1）樣品的處理：）樣品的處理：準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取0.5mL醬油于醬油于100mL燒杯中，加入燒杯中，加入5g活性炭和活性炭和50mL蒸餾水，置于蒸餾水，置于80水浴鍋中，保持半小時后過濾，用蒸餾水將濾渣水浴鍋中，保持半小時后過濾，用蒸餾水將濾渣清洗數(shù)遍，收集濾液于清洗數(shù)遍，收集濾液

3、于100mL容量瓶中，定容至容量瓶中，定容至刻線，搖勻備用?？叹€，搖勻備用。各種試劑加到比色管后混勻，于電爐上沸水浴各種試劑加到比色管后混勻，于電爐上沸水浴15min，取出冷卻至室，取出冷卻至室溫后加水至溫后加水至10mL刻度線，靜置刻度線，靜置15min后，在后，在570nm處測定吸光度，處測定吸光度，以氨基酸含量以氨基酸含量(g)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制管號管號1234567氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液/mL00.50.60.70.80.91.0水水/mL1.61.11.00.90.80.70.6磷酸鹽

4、緩沖液磷酸鹽緩沖液/mL0.40.40.40.40.40.40.4茚三酮茚三酮/mL0.40.40.40.40.40.40.4氨基酸含量氨基酸含量/g0100120140160180200 按上表加樣后混勻，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟進(jìn)行按上表加樣后混勻，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在相同條件下測定樣品的吸光度，并在標(biāo)實(shí)驗(yàn)，在相同條件下測定樣品的吸光度，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出氨基酸含量微克數(shù)。準(zhǔn)曲線上查出氨基酸含量微克數(shù)。（3）樣品測定）樣品測定管號管號891011樣品溶液樣品溶液/mL00.50.50.5水水/mL1.61.11.11.1磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液/mL0.40.40.40.4茚三酮茚三酮/m

5、L0.40.40.40.44. 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算5. 說明及注意事項(xiàng)說明及注意事項(xiàng)（1）該法是微量法，對氨基酸的最低檢出量可）該法是微量法，對氨基酸的最低檢出量可達(dá)達(dá)0.5g，其其靈敏度高，重現(xiàn)性好。，其其靈敏度高，重現(xiàn)性好。（2）脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，）脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，最大吸收波長在最大吸收波長在440nm處。處。（3）通常采用的樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱取粉碎）通常采用的樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品后的樣品5g10g或吸取液體樣品或吸取液體樣品5mL10mL，置于燒杯中，加入置于燒杯中，加入50mL蒸餾水和蒸餾水和5g左右的活性炭，左右的活性炭，加熱煮沸，過濾。用加熱煮沸，過濾。用30mL40mL熱水洗滌活性熱水洗滌活性炭，收集濾液于炭，收集濾液于100mL容量瓶中，加水至刻度線，容量瓶中，加水至刻度線，搖勻備用。搖勻備用。6. 思考題思考題（1