第四組琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制

1、琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制實驗目的實驗原理器材與試劑實驗步驟實驗目的實驗目的:(1) 學習動物的處死與組織勻漿的方法。(2) 學習離心機的使用方法。(3) 理解酶的競爭抑制原理。2021-11-24背景介紹背景介紹琥珀酸脫氫酶是位于動物細胞線粒體內膜上的一種氧化酶，它直接與電子傳遞鏈相連，是呼吸鏈的標志酶，亦即線粒體或細胞內三羧酸循環(huán)的一種標志酶。在體內，該酶可使琥珀酸脫下的氫進入FADH2呼吸鏈，通過一系列傳遞體最后傳遞給氧而生成水。當在缺氧的條件下可用甲烯藍(藍色)作為受氫體時,甲烯藍被氫還原成甲烯白(無色),其反應如下：甲烯藍，又名亞甲藍，美藍甲烯藍，又名亞甲藍，美藍實驗原理實驗原理:競爭

2、性抑制是指分子結構與底物相似的抑制劑可與底物競爭性結合酶的活性中心，抑制酶的活力。競爭性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例。 草酸與琥珀酸的分子結構相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。在體內，琥珀酸脫下的2H 經電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結合生成水，并釋放出能量。在體外則可用甲烯藍（藍色）作為受氫體，甲烯藍接受琥珀酸脫下的2H 而被還原為甲烯白（無色）。在甲烯蘭含量一定的條件下，藍色消退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活力，因此，可依據(jù)藍色消退時間來判斷該酶活力被抑制的程度。競爭性抑制的機理競爭性抑制的機理 競爭性抑制劑往往是酶的底物

3、類似物或反應產物； 抑制劑與酶的結合部位（活性中心）與底物與酶的結合部位相同； 抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減?。?動力學參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例注意：結合在酶的同一部位以及結構類似并不是競爭性抑制的必要條件，抑制劑結合的部位阻礙底物和酶的結合，即產生空間位阻也可以造成競爭性抑制。 離心技術離心技術:離心技術是利用物體高速旋轉時產生強大的離心力，使置于旋轉體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達到濃縮或與其他顆粒分離之目的。這里的懸浮顆粒往往是指制成懸浮狀態(tài)的細胞、細胞器、病毒和生物大分子等。離心機轉子

4、高速旋轉時，當懸浮顆粒密度大于周圍介質密度時，顆粒離開軸心方向移動，發(fā)生沉降；如果顆粒密度低于周圍介質的密度時，則顆粒朝向軸心方向移動而發(fā)生漂浮。離心力和相對離心力離心力和相對離心力 溶液中的固相顆粒做圓周運動時產生一個向外離心力，其定義為：F = m2r式中：F 為離心力的強度； m 為沉降顆粒的有效質量； 為離心轉子轉動的角速度，其單位為rad/s；r 為離心半徑(cm)，即轉子中心軸到沉降顆粒之間的距離。很顯然，離心力隨著轉速和顆粒質量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。離心力通常以相對離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計算公式如下：F

5、cf = 1.119105(h)2rg可以看出，在同一轉速下，由于f 的不同，F(xiàn)cf相差會很大，實際應用時一般取平均值。在離心實驗的報告中，F(xiàn)cf、r 平均、離心時間t 和液相介質等條件都應表示出來，因為它們都與樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系。顯然Fcf是一個只與離心機相關的參數(shù)，而與樣品并無直接的關系。離心方法分類離心方法分類:1.差速離心法差速離心法:通過逐步增加相對離心力，使一個非均相混合液內形狀不同的大小顆粒分步沉淀。2.密度梯度離心法：密度梯度離心法：1）速度區(qū)帶離心法2）預制梯度等密度離心法3）自成梯度等密度離心法3.沉降平衡離心法沉降平衡離心法:根據(jù)被分離物質的浮力密度差別進行分離，

6、所用的介質起始密度約等于被分離物質的密度，介質在離心過程中形成密度梯度，被分離物質沉降或上浮到達與之密度相等的介質區(qū)域中停留并形成區(qū)帶。離心工具離心工具:離心機(centrifuge)是實施離心技術的裝置。離心機的種類很多，按照使用目的，可兩類，即制備型離心機和分析型離心機。前者主要用于分離生物材料，每次分離樣品的容量比較大，后者則主要用于研究純品大分子物質，包括某些顆粒體如核蛋白體等物質的性質，每次分析的樣品容量很小，根據(jù)待測物質在離心場中的行為(可用離心機中的光學系統(tǒng)連續(xù)地監(jiān)測)，能推斷其純度、形狀和相對分子質量等性質。兩類離心機由于用途不同，故其主要結構也有差異。通常所使用的離心機根據(jù)轉

7、子轉速大小的不同可分為低速離心機、高速離心機和超速離心機三類。超速離心機高速離心機低速離心機實驗器材與試劑實驗器材與試劑:（一）器材小白鼠，研缽，手術剪，手術鑷子，移液管，可調式移液器，10ml離心管，低速離心機（二）試劑1. pH=7.4的磷酸緩沖液2. 0.25%琥珀酸鈉溶液3. 0.5%草酸鈉溶液4. 0.01%甲烯藍溶液5. 0.9生理鹽水實驗操作實驗操作:1.肝糜液的制備:取小白鼠1只，頸椎脫臼法處死。剖腹將肝臟全部取出，置于研缽中，用生理鹽水洗凈肝臟中的血液。用剪刀剪碎肝臟，充分研碎至糊狀，然后分批加入少量磷酸緩沖液，邊加邊磨，共加入7ml。攪勻后倒入圓底離心管中，離心約3min(

8、3000r/min)。將上清液倒入一支試管中備用，此即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液。2.另取中試管5支，標號，按下表操作。表表5-5 琥珀酸脫氫酶活力的測定琥珀酸脫氫酶活力的測定試劑試劑/ml123450.25%琥珀酸鈉溶液0.500.502.000.500.5%草酸鈉溶液0.500.500.502.00蒸餾水2.002.001.50肝糜液1.001.001.001.001.00甲烯藍0.200.200.200.200.20注：甲烯藍的量可以根據(jù)肝糜液制備情況進行調整搖勻，靜置于37的水浴中(此后再勿搖動)，注意觀察各管的顏色變化。記錄各管顏色消退的順序和時間，并分析原因。震蕩褪色的反應液，觀察實驗現(xiàn)象并分析產生該現(xiàn)象的原因。注意事項注意事項:1.本實驗成敗的關鍵是肝糜液的制備的質量。肝臟一定要充分研磨至糊狀，以使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液里。2.離心時注意離心管一定要精確平衡，并將重要相等的離心管對稱放置3.離心結束后拿取離心管時動作要輕柔，不要振蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁思考題思考題:1:為什么反應開始后，反應液必須靜止，不能再搖動?2:本實驗為何選擇肝臟來提取琥珀酸脫氫酶？本實驗成功的關鍵是什么？3：抑制劑還可以選用什么物質？4：利用本實驗的數(shù)據(jù)，說明酶競爭性抑制的特點？5：本試驗在設計上存在某些缺陷，指出存在