酶的作用機理6

1、 五五. . 酶作用的調(diào)節(jié)原理酶作用的調(diào)節(jié)原理 ( (一一) ) 共價調(diào)節(jié)共價調(diào)節(jié) 1.1.不可逆的共價調(diào)節(jié)不可逆的共價調(diào)節(jié) 這種調(diào)節(jié)通常又稱為這種調(diào)節(jié)通常又稱為酶原激活酶原激活, ,酶在體內(nèi)合成出酶在體內(nèi)合成出來的只是它的無活性的前體，經(jīng)過蛋白酶的催化作來的只是它的無活性的前體，經(jīng)過蛋白酶的催化作用，構(gòu)像發(fā)生變化，才能變成有活性的酶。該活化用，構(gòu)像發(fā)生變化，才能變成有活性的酶。該活化過程，是生物體內(nèi)的一種調(diào)控機制。這種調(diào)控機制過程，是生物體內(nèi)的一種調(diào)控機制。這種調(diào)控機制的特點是由無活性的酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶是不可的特點是由無活性的酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶是不可逆轉(zhuǎn)的。逆轉(zhuǎn)的。胰蛋白酶原的激活胰蛋

2、白酶原的激活 (1) (1) 腸道蛋白消化酶腸道蛋白消化酶 胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶腸激酶腸激酶六肽六肽+ +胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原彈性蛋白酶原彈性蛋白酶原羧肽酶原羧肽酶原有活性的酶有活性的酶（2 2） 纖溶作用纖溶作用鏈激酶鏈激酶纖溶酶原纖溶酶原復(fù)合體復(fù)合體纖溶酶纖溶酶纖溶蛋白凝塊纖溶蛋白凝塊可溶性分可溶性分解產(chǎn)物解產(chǎn)物激酶釋放肽激酶釋放肽或尿激酶或尿激酶不可逆共價調(diào)節(jié)的特點不可逆共價調(diào)節(jié)的特點: : 酶原激活過程有聯(lián)級放大作用酶原激活過程有聯(lián)級放大作用 酶原激活是不可逆的酶原激活是不可逆的 這類酶通過其他酶對其多肽鏈上某些基團進行可這類酶通過其他酶對其多肽鏈上某些基團進行

3、可逆的共價修飾，使其在活性與非活性之間轉(zhuǎn)變，從逆的共價修飾，使其在活性與非活性之間轉(zhuǎn)變，從而調(diào)節(jié)酶活性，這種酶稱為共價調(diào)節(jié)酶。而調(diào)節(jié)酶活性，這種酶稱為共價調(diào)節(jié)酶。2.2.可逆的共價調(diào)節(jié)酶可逆的共價調(diào)節(jié)酶 目前發(fā)現(xiàn)目前發(fā)現(xiàn)很多很多種酶被翻譯后都要進行共價修飾，種酶被翻譯后都要進行共價修飾，其中一部分處于分支代謝途徑，成為對代謝流量起其中一部分處于分支代謝途徑，成為對代謝流量起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶和限速酶。調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶和限速酶。 共價調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能量，共價調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能量，機制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它們常受激素機制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它

4、們常受激素甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人注目。注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g關(guān)鍵酶（限速酶）關(guān)鍵酶（限速酶）P2反應(yīng)類型反應(yīng)類型 共價修飾共價修飾 被修飾的氨基酸殘基被修飾的氨基酸殘基共共價價修修飾飾反反應(yīng)應(yīng)的的類類型型磷酸化磷酸化腺苷酰化腺苷?；蜍挣；蜍挣；疶yr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化甲基化GluS-腺苷腺苷-MetS-腺苷腺苷-同型同型 Cys蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O第一類：第一類：Ser/Thr型型第二類：第二類：Tyr

5、型型第一類：第一類：Ser/Thr型型第二類：第二類：Tyr型型 腎上腺素腎上腺素腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶腺苷酸環(huán)化酶腺苷酸環(huán)化酶ATPcAMP蛋白激酶蛋白激酶蛋白激酶蛋白激酶磷酸化酶激酶磷酸化酶激酶磷酸化酶激酶磷酸化酶激酶糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶a a( (磷酸化磷酸化) )糖原糖原(Gn(Gn) )Pi糖原合酶糖原合酶a a ( (非磷酸化非磷酸化) )糖原合酶糖原合酶b b ( (磷酸化磷酸化) ) 第一信使第一信使第二信使第二信使 1010-6-6 mol/L mol/L糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶b b( (非磷酸化）非磷酸化）1- P -1- P -葡萄糖葡萄糖5mmol/L1010-

6、8 -8 - 10- 10-10-10 mol/L mol/L從腎上腺素到從腎上腺素到1-1-P P葡萄糖信號放葡萄糖信號放大了大了5050萬倍！萬倍！糖原糖原UDP-G腎上腺素對糖原磷酸化酶腎上腺素對糖原磷酸化酶和糖原合成酶的作用和糖原合成酶的作用（1 1）磷酸化酶）磷酸化酶 這類酶分別由其他酶催化，酶分子接受這類酶分別由其他酶催化，酶分子接受磷酸基或脫去磷酸基，酶活性發(fā)生改變。磷酸基或脫去磷酸基，酶活性發(fā)生改變。磷酸化酶磷酸化酶b b（無活性）（無活性）PP2H2O2ATP2Pi2ADP磷酸化酶磷酸化酶a a（有活性）（有活性）磷酸化酶激酶磷酸化酶激酶磷蛋白磷酸酶磷蛋白磷酸酶 酶分子上接受

7、修飾的氨基酸為：酶分子上接受修飾的氨基酸為：TyrTyr、SerSer、ThrThr。（2 2）腺苷酰化與脫腺苷?；┫佘挣；c脫腺苷酰化 這種調(diào)節(jié)在細(xì)菌中有著十分重要的作用這種調(diào)節(jié)在細(xì)菌中有著十分重要的作用 谷氨酰胺合成酶催化：谷氨酰胺合成酶催化：12PPi12PiOHE () 1212ATP12ADPOAMPE () 12ATAT高活性高活性低活性低活性Glu + NH3 + ATPGln + ADP + PiAT: 谷氨酰胺合成酶腺苷?；D(zhuǎn)移酶谷氨酰胺合成酶腺苷?；D(zhuǎn)移酶谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶l 谷氨酰氨合成酶是一種共價調(diào)節(jié)酶，它由谷氨酰氨合成酶是一種共價調(diào)節(jié)酶，它由1212個亞基

8、構(gòu)成，在其它酶的作用下，它們受個亞基構(gòu)成，在其它酶的作用下，它們受ATPATP轉(zhuǎn)來的腺苷酰基的共價修飾，或脫去腺苷酰基轉(zhuǎn)來的腺苷?；墓矁r修飾，或脫去腺苷?；{(diào)節(jié)該酶的活性。而調(diào)節(jié)該酶的活性。l 谷氨酰氨合成酶接受了谷氨酰氨合成酶接受了AMPAMP的修飾后，活性的修飾后，活性降低，脫去這種修飾后，活性增高，這主要取降低，脫去這種修飾后，活性增高，這主要取決于氨平衡決于氨平衡NHNH4 4+ +/Gln/Gln，NHNH4 4高時，傾向于脫腺苷高時，傾向于脫腺苷酰化，反之酰化，反之GlnGln高時，腺苷酰化占主要地位。高時，腺苷酰化占主要地位。 可逆共價調(diào)節(jié)的特點可逆共價調(diào)節(jié)的特點: : 通過

9、共價修飾改變酶活性通過共價修飾改變酶活性 有聯(lián)級放大作用有聯(lián)級放大作用 共價修飾是可逆的共價修飾是可逆的（二）通過（二）通過酶分子酶分子解離聚合進行調(diào)節(jié)解離聚合進行調(diào)節(jié) 在酶活力的別構(gòu)調(diào)節(jié)中，常伴有酶分子在酶活力的別構(gòu)調(diào)節(jié)中，常伴有酶分子的解離和聚合，調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)，這種酶分子的解離和聚合，調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)，這種酶分子中的中的Protein-ProteinProtein-Protein相互作用是體內(nèi)調(diào)節(jié)相互作用是體內(nèi)調(diào)節(jié)酶活力的重要方式。酶活力的重要方式。 乙酰輔酶乙酰輔酶A A羧化酶是脂肪酸合成途徑中的第一個酶，羧化酶是脂肪酸合成途徑中的第一個酶，當(dāng)有檸檬酸鹽存在時引起亞基聚合，此酶有活力；當(dāng)有檸

10、檬酸鹽存在時引起亞基聚合，此酶有活力；除去檸檬酸或加乙酰除去檸檬酸或加乙酰CoACoA和軟脂酰和軟脂酰CoACoA時則引起酶解時則引起酶解聚，使活力下降。聚，使活力下降。原體原體檸檬酸檸檬酸（有活性）（有活性）多聚體（多聚體（BCCP BC CT R)BCCP BC CT R)n.n.（BCBC、BCCPBCCP、CTCT、R R）（無活性）（無活性）（無活性）（無活性）以色列以色列 阿夫拉姆阿夫拉姆赫什科赫什科 美國美國 歐文歐文羅斯羅斯 以色列以色列 阿龍阿龍切哈諾沃切哈諾沃 20042004年度的諾貝爾化學(xué)獎年度的諾貝爾化學(xué)獎頒發(fā)給三位發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)節(jié)頒發(fā)給三位發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解機理的科

11、學(xué)家。蛋白質(zhì)降解機理的科學(xué)家。 （三）通過（三）通過蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子降解的調(diào)節(jié)降解的調(diào)節(jié) 泛素多肽（泛素多肽（UbiquitinUbiquitin）由由7676個氨基酸組成，它最個氨基酸組成，它最初是從小牛的胰臟中分離出來的。它就像標(biāo)簽一樣，初是從小牛的胰臟中分離出來的。它就像標(biāo)簽一樣，被貼上標(biāo)簽的蛋白質(zhì)就會被運送到細(xì)胞內(nèi)的被貼上標(biāo)簽的蛋白質(zhì)就會被運送到細(xì)胞內(nèi)的“垃圾處垃圾處理廠理廠”，在那里被降解。，在那里被降解。1.E11.E1負(fù)責(zé)激活泛素分子負(fù)責(zé)激活泛素分子, ,這個反應(yīng)需要這個反應(yīng)需要ATPATP能量。能量。2.2.泛素分子被激活后就被運送到泛素分子被激活后就被運送到E2E2上，上

12、，E2E2負(fù)責(zé)負(fù)責(zé) 把泛素分子結(jié)合在需要降解的蛋白質(zhì)上。把泛素分子結(jié)合在需要降解的蛋白質(zhì)上。泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解機理泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解機理:3.E33.E3能辨認(rèn)需要被降解的蛋白質(zhì)，并與之結(jié)合。能辨認(rèn)需要被降解的蛋白質(zhì)，并與之結(jié)合。E2E2將將 泛素分子交給降解蛋白質(zhì)。泛素分子交給降解蛋白質(zhì)。4.4.降解降解蛋白質(zhì)被運送到細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體中降解。蛋白質(zhì)被運送到細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體中降解。5.5.經(jīng)過蛋白酶體的處理，蛋白質(zhì)就被切成由經(jīng)過蛋白酶體的處理，蛋白質(zhì)就被切成由7-97-9個個 氨基酸組成的短肽。氨基酸組成的短肽。去泛素化酶去泛素化酶 泛素化修飾循環(huán)泛素化修飾循環(huán) （三）別構(gòu)調(diào)節(jié)（三）別構(gòu)調(diào)節(jié)

13、別構(gòu)調(diào)節(jié)別構(gòu)調(diào)節(jié)allostericallosteric regulation regulation：酶分：酶分子的別構(gòu)部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)子的別構(gòu)部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象的改變，進而改變酶活性狀態(tài)，合后發(fā)生構(gòu)象的改變，進而改變酶活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)。稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)。 由別構(gòu)酶起作用調(diào)節(jié)代謝過程稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。由別構(gòu)酶起作用調(diào)節(jié)代謝過程稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。1. 1. 別構(gòu)酶別構(gòu)酶 別構(gòu)酶也稱變構(gòu)酶。這種酶除了有活性中心外，別構(gòu)酶也稱變構(gòu)酶。這種酶除了有活性中心外，還有別構(gòu)中心，當(dāng)別構(gòu)效應(yīng)物非共價結(jié)合到別構(gòu)中心還有別構(gòu)中心，當(dāng)別構(gòu)效應(yīng)物非共價結(jié)合到別構(gòu)中心上時，酶分子構(gòu)象

14、發(fā)生改變，從而改變酶活力。上時，酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶活力。活性中心活性中心別構(gòu)中心別構(gòu)中心別構(gòu)激活別構(gòu)激活別構(gòu)抑制別構(gòu)抑制別構(gòu)抑制和別構(gòu)激活別構(gòu)抑制和別構(gòu)激活 當(dāng)別構(gòu)效應(yīng)物與酶結(jié)合，大大有利于后續(xù)當(dāng)別構(gòu)效應(yīng)物與酶結(jié)合，大大有利于后續(xù)分子與酶的結(jié)合，使酶的活力增加，稱為別構(gòu)分子與酶的結(jié)合，使酶的活力增加，稱為別構(gòu)激活，也稱為正協(xié)同；反之，稱為別構(gòu)抑制，激活，也稱為正協(xié)同；反之，稱為別構(gòu)抑制，或負(fù)協(xié)同。細(xì)胞可以通過酶的別構(gòu)使酶活力升或負(fù)協(xié)同。細(xì)胞可以通過酶的別構(gòu)使酶活力升高或降低以調(diào)節(jié)代謝。高或降低以調(diào)節(jié)代謝。別構(gòu)效應(yīng)物（別構(gòu)效應(yīng)物（ allostericallosteric effec

15、toreffector）分為：）分為： 正效應(yīng)物正效應(yīng)物 positive effectorpositive effector 負(fù)效應(yīng)物負(fù)效應(yīng)物 negative effectornegative effector別構(gòu)效應(yīng)物：別構(gòu)效應(yīng)物：（1 1）激素；）激素；（2 2）底物、產(chǎn)物或代謝途徑的最終產(chǎn)物；）底物、產(chǎn)物或代謝途徑的最終產(chǎn)物；（3 3）與該代謝酶系有關(guān)的輔酶及核苷酸類化）與該代謝酶系有關(guān)的輔酶及核苷酸類化 合物。合物。 別構(gòu)效應(yīng)：酶分子的別構(gòu)部位與某些化合別構(gòu)效應(yīng)：酶分子的別構(gòu)部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，進物可逆地非共價結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，進而活性改變而活性改變。

16、別構(gòu)酶的特點：別構(gòu)酶的特點：（1 1）有多個亞基，都是）有多個亞基，都是寡聚酶寡聚酶。（2 2）活性中心和別構(gòu)中心位于酶蛋白的不同部位，或）活性中心和別構(gòu)中心位于酶蛋白的不同部位，或 處在不同亞基上，或在同一亞基上的不同部位。處在不同亞基上，或在同一亞基上的不同部位。（3 3）活性中心負(fù)責(zé)對底物的）活性中心負(fù)責(zé)對底物的結(jié)合與催化結(jié)合與催化，別構(gòu)中心，別構(gòu)中心 則負(fù)責(zé)則負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)酶的反應(yīng)速度調(diào)節(jié)酶的反應(yīng)速度。（4 4）不遵循米氏方程）不遵循米氏方程 =V max SKm + S對對SS作圖，得到作圖，得到“ “ S ”S ”曲線，而不是雙曲線。曲線，而不是雙曲線。2. 2. 別構(gòu)調(diào)節(jié)有下述幾種作用

17、方式：別構(gòu)調(diào)節(jié)有下述幾種作用方式：（1 1）酶活力的反饋和前饋控制）酶活力的反饋和前饋控制 反饋（反饋（feedbackfeedback）是指反應(yīng)系統(tǒng)中最終產(chǎn)）是指反應(yīng)系統(tǒng)中最終產(chǎn)物對物對初始步驟的酶活力初始步驟的酶活力的控制作用?？煞值目刂谱饔??？煞譃檎答伜拓?fù)反饋。為正反饋和負(fù)反饋。 正反饋：終產(chǎn)物可以正反饋：終產(chǎn)物可以激活初始步驟的酶激活初始步驟的酶 負(fù)反饋：終產(chǎn)物可以負(fù)反饋：終產(chǎn)物可以抑制初始步驟的酶抑制初始步驟的酶 前前 饋：在反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)物饋：在反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)物對后續(xù)反對后續(xù)反 應(yīng)酶應(yīng)酶的控制作用。的控制作用。P1S0P2E1E2Pn+1E0+ or - 反饋反饋+ or -

18、 前饋前饋- 酮丁酸酮丁酸E1E2酮甲戊酸酮甲戊酸ThrIle反饋抑制反饋抑制E1: 蘇氨酸脫胺酶蘇氨酸脫胺酶例例1： 前饋和反饋前饋和反饋 CTPCTP利用率低，利用率低，CTPCTP濃度高，抑制天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰濃度高，抑制天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的活力。酶的活力。 反饋、前饋是細(xì)胞中一種很巧妙的代謝調(diào)節(jié)方式。反饋、前饋是細(xì)胞中一種很巧妙的代謝調(diào)節(jié)方式?？杀苊夥磻?yīng)中，反應(yīng)物、產(chǎn)物過多積累和浪費，對可避免反應(yīng)中，反應(yīng)物、產(chǎn)物過多積累和浪費，對生物體原料和能源的合理利用具有重要意義。生物體原料和能源的合理利用具有重要意義。例例2：E反饋抑制反饋抑制嘧啶核苷酸生物合成嘧啶核苷酸生物合成Asp + + 氨

19、甲酰磷酸氨甲酰磷酸CTP氨甲酰天氨甲酰天冬氨酸冬氨酸 + + Pi（代謝中利用）（代謝中利用）正前饋正前饋G-6-P多時，激活糖原合酶，促進糖原合成多時，激活糖原合酶，促進糖原合成G-6-PGG-1-PUDPG合合E糖原糖原糖原糖原例例3：l 同促效應(yīng)（同促效應(yīng)（homotropichomotropic effect effect）：底物）：底物分子本身就是別構(gòu)酶的效應(yīng)物。（底物與酶分子本身就是別構(gòu)酶的效應(yīng)物。（底物與酶結(jié)合的協(xié)同作用）。結(jié)合的協(xié)同作用）。l 異促效應(yīng)（異促效應(yīng)（heterotropicheterotropic）：非底物分子）：非底物分子的效應(yīng)物對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用。（如的效應(yīng)物

20、對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用。（如ATPATP與與CTPCTP競爭天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的調(diào)節(jié)部位，競爭天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的調(diào)節(jié)部位，高水平高水平ATPATP可阻止可阻止CTPCTP對酶的抑制）。對酶的抑制）。(2) (2) 其他形式的別構(gòu)調(diào)節(jié)其他形式的別構(gòu)調(diào)節(jié) 有一些別構(gòu)酶還受核苷酸類化合物的調(diào)節(jié)，有一些別構(gòu)酶還受核苷酸類化合物的調(diào)節(jié)，如酵解和如酵解和TCATCA中一些酶活性可因中一些酶活性可因ATPATP、ADPADP、AMPAMP的存在而抑制或激活。的存在而抑制或激活。F-6-P + ATPF-1, 6-BP + ADP磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-+ATP、檸檬酸檸檬酸長鏈脂肪酸長鏈脂肪酸ADPAMP別

21、構(gòu)酶的動力學(xué)曲線別構(gòu)酶的動力學(xué)曲線3. 3. 別構(gòu)酶動力學(xué)別構(gòu)酶動力學(xué)符合米氏方程符合米氏方程酶的雙曲線酶的雙曲線正協(xié)同別構(gòu)酶正協(xié)同別構(gòu)酶的的S S型曲線型曲線負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶的雙曲線的雙曲線VS 正協(xié)同的別構(gòu)酶結(jié)合底物或變構(gòu)劑后，構(gòu)正協(xié)同的別構(gòu)酶結(jié)合底物或變構(gòu)劑后，構(gòu)像的變化使酶對底物的親合力大大增強。像的變化使酶對底物的親合力大大增強。 負(fù)協(xié)同的別構(gòu)酶與變構(gòu)抑制劑結(jié)合后，在底負(fù)協(xié)同的別構(gòu)酶與變構(gòu)抑制劑結(jié)合后，在底物濃度較低的范圍內(nèi)酶活性增加較快，但底物物濃度較低的范圍內(nèi)酶活性增加較快，但底物濃度升高后，催化速率并不顯著增加，這意味濃度升高后，催化速率并不顯著增加，這意味著高濃度的底

22、物并不能形成高濃度的產(chǎn)物。著高濃度的底物并不能形成高濃度的產(chǎn)物。米氏酶米氏酶正協(xié)同正協(xié)同負(fù)協(xié)同負(fù)協(xié)同ab正正米米負(fù)負(fù)別構(gòu)酶與米氏酶反應(yīng)速度比較別構(gòu)酶與米氏酶反應(yīng)速度比較 底物濃度從底物濃度從 a a 變化到變化到 b bSVB: B: 正協(xié)同別構(gòu)正協(xié)同別構(gòu) 酶的酶的S S形曲線形曲線 = 90% S = 9 =10% S = 3= 3S 9S 390%Vmax3 6 950%100%SAB= 81 S 9 S 0.11A: A: 非調(diào)節(jié)酶非調(diào)節(jié)酶 = 90% S = 9 =10% S = 0.11別構(gòu)酶動力學(xué)曲線別構(gòu)酶動力學(xué)曲線別構(gòu)酶的判別方法：別構(gòu)酶的判別方法：Rs = 酶與底物結(jié)合達酶與底

23、物結(jié)合達90%90%飽和度時的底物濃度飽和度時的底物濃度 酶與底物結(jié)合達酶與底物結(jié)合達10%10%飽和度時的底物濃度飽和度時的底物濃度R Rs s= 81 = 81 是典型的米氏方程的酶是典型的米氏方程的酶R Rs s81 81 是具有正協(xié)同的別構(gòu)酶是具有正協(xié)同的別構(gòu)酶R Rs s81 81 是具有負(fù)協(xié)同的別構(gòu)酶是具有負(fù)協(xié)同的別構(gòu)酶RsRs判別法判別法HillHill系數(shù)判別法系數(shù)判別法nnPoKPoY22Hill Hill 通過對變構(gòu)血紅蛋白的研究得出了通過對變構(gòu)血紅蛋白的研究得出了HillHill方程：方程：HillHill方程也適用于別構(gòu)酶，對于別構(gòu)酶，方程也適用于別構(gòu)酶，對于別構(gòu)酶，H

24、illHill方方程可變?yōu)椋撼炭勺優(yōu)椋簄nmSKSVvn = 1 K= Kn = 1 K= Km m，還原為米氏方程。，還原為米氏方程。n n1 1 和和 n n1 1 為別構(gòu)酶為別構(gòu)酶將上述方程進行變換、方程兩邊取對數(shù)得到：將上述方程進行變換、方程兩邊取對數(shù)得到：vVvmlg以以對對lgS作圖，可得到一條直線，作圖，可得到一條直線，該直線的斜率稱為該直線的斜率稱為Hill系數(shù)。系數(shù)。KSnvVvmlglglgHill系數(shù)是判別別構(gòu)酶和非別構(gòu)酶的指標(biāo)系數(shù)是判別別構(gòu)酶和非別構(gòu)酶的指標(biāo)vVvmlgvVvmlgvVvmlglgSlgSlgSn = 1n1n1n =1 n =1 是典型的米氏方程的酶是

25、典型的米氏方程的酶n n1 1 是具有負(fù)協(xié)同的別構(gòu)酶是具有負(fù)協(xié)同的別構(gòu)酶n n1 1 是具有正協(xié)同的別構(gòu)酶是具有正協(xié)同的別構(gòu)酶 4. 4.實例：天冬氨酸轉(zhuǎn)甲酰酶實例：天冬氨酸轉(zhuǎn)甲酰酶 （anspartate transcarbamoylaseanspartate transcarbamoylase， ATCaseATCase）ATCaseATP+ATCase所催化的反應(yīng)所催化的反應(yīng)氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸天冬氨酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸E.coliE.coli的的ATCaseATCase的亞基排列的亞基排列催化催化(C)亞基（亞基（catalytic subunit

26、）調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)(R)亞基（亞基（ regulative subunit）ATCase的半分子結(jié)構(gòu)ATCase半分子半分子（C3R3)的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)CTP sitecatalytic siteATCase aloneATCase -ATP complex ATCase的的別構(gòu)過渡作用別構(gòu)過渡作用低催化活性構(gòu)象低催化活性構(gòu)象T(tense) - 態(tài)態(tài)CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性構(gòu)象高催化活性構(gòu)象R(relax) -態(tài)態(tài)R RR RR RATPATPATCase變構(gòu)效應(yīng)的動力學(xué)特征變構(gòu)效應(yīng)的動力學(xué)特征ATP（正效應(yīng)劑）（正效應(yīng)劑）CTP（負(fù)效應(yīng)劑）（負(fù)效應(yīng)劑）低催化活性構(gòu)象低

27、催化活性構(gòu)象T(tense) - 態(tài)態(tài)CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性構(gòu)象高催化活性構(gòu)象R(relax) -態(tài)態(tài)R RR RR RVmax1/2VmaxKm5. 5. 別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)機理：別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)機理：(1) (1) 別構(gòu)酶的齊變模型別構(gòu)酶的齊變模型S SSSS SSS SST狀態(tài)（對稱亞基）狀態(tài)（對稱亞基）R狀態(tài)（對稱亞基）狀態(tài)（對稱亞基）SSSS對稱亞基對稱亞基對稱亞基對稱亞基齊步變化齊步變化R R態(tài)有利于正的效應(yīng)物結(jié)合，態(tài)有利于正的效應(yīng)物結(jié)合，T T態(tài)有利于態(tài)有利于負(fù)的效應(yīng)物結(jié)合。負(fù)的效應(yīng)物結(jié)合。亞基全部亞基全部處于處于R型型亞基全部亞基全部處于處于T型型

28、依次序變化依次序變化正協(xié)同：正協(xié)同：K K1 1K K2 2K K3 3K K4 4 親和力遞增親和力遞增負(fù)協(xié)同：負(fù)協(xié)同：K K1 1K K2 2K K3 3 K K4 4 親和力遞減親和力遞減SS SS SSSSSSSSSSK K1 1K K2 2K K3 3K K4 4(2) (2) 別構(gòu)酶的序變模型別構(gòu)酶的序變模型第八節(jié)第八節(jié) 固定化酶固定化酶一一. . 概述概述 將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，固定將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，固定于高分子支持物于高分子支持物( (或載體或載體) )上而成為不溶于水上而成為不溶于水，但仍有酶活性的一種酶制劑形式，稱固定，但仍有酶活性的一種酶制劑形式，

29、稱固定化酶化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)。生生物物 動、植物組織動、植物組織器官、體液器官、體液微生物培養(yǎng)物微生物培養(yǎng)物微生物菌體微生物菌體動、植物細(xì)胞培養(yǎng)動、植物細(xì)胞培養(yǎng)粗酶制劑粗酶制劑水溶酶水溶酶固定化酶固定化酶生長細(xì)胞生長細(xì)胞靜息細(xì)胞靜息細(xì)胞孢子孢子固定化固定化細(xì)胞細(xì)胞靜息細(xì)胞靜息細(xì)胞處理細(xì)胞處理細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖細(xì)胞不同類型的酶不同類型的酶1. 1. 微生物酶的優(yōu)越性微生物酶的優(yōu)越性 微生物生長速度快，易于大量培養(yǎng)。微生物生長速度快，易于大量培養(yǎng)。 通過菌種選育改進培養(yǎng)條件，提高酶產(chǎn)量。通過菌種選育改進培養(yǎng)條件，提高酶產(chǎn)量。 菌種不同

30、，產(chǎn)生酶的種類有差異。菌種不同，產(chǎn)生酶的種類有差異。 利用微生物酶反應(yīng)，以活菌體進行催化，簡化利用微生物酶反應(yīng)，以活菌體進行催化，簡化 工藝，縮短反應(yīng)周期。工藝，縮短反應(yīng)周期。 產(chǎn)量高、成本低、不受季節(jié)限制，便于工業(yè)產(chǎn)量高、成本低、不受季節(jié)限制，便于工業(yè) 化生產(chǎn)?；a(chǎn)。2. 2. 微生物酶的使用微生物酶的使用 胞內(nèi)酶的使用：胞內(nèi)酶的使用： 把酶從菌體細(xì)胞內(nèi)抽提出來，繁雜、易失活。把酶從菌體細(xì)胞內(nèi)抽提出來，繁雜、易失活。 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 用一定的方法將微生物菌體固定用一定的方法將微生物菌體固定 在載體上制成固定化菌體。簡單、利用率高、在載體上制成固定化菌體。簡單、利用率高、 不易失活。不

31、易失活。 如：大腸桿菌生產(chǎn)青霉素酰胺酶如：大腸桿菌生產(chǎn)青霉素酰胺酶 胞外酶的使用：胞外酶的使用： 除去菌體，把含酶的培養(yǎng)濾液直接用于生物除去菌體，把含酶的培養(yǎng)濾液直接用于生物 催化反應(yīng)。催化反應(yīng)。 把酶抽提出來用一定的方法制成把酶抽提出來用一定的方法制成“固定化酶固定化酶”。如：葡萄糖淀粉酶與羧甲基纖維素（如：葡萄糖淀粉酶與羧甲基纖維素（CMCCMC）結(jié)合）結(jié)合制成的固定化酶制成的固定化酶（1 1）不穩(wěn)定）不穩(wěn)定 高溫、高壓、強酸、強堿影響穩(wěn)定性。高溫、高壓、強酸、強堿影響穩(wěn)定性。（2 2）易失活）易失活 即使在最適合的條件下反應(yīng)。即使在最適合的條件下反應(yīng)。（3 3）回收困難）回收困難 用適當(dāng)

32、方法提取目的產(chǎn)物后，殘存用適當(dāng)方法提取目的產(chǎn)物后，殘存 酶回收困難。酶回收困難。（4 4）反應(yīng)速度減慢）反應(yīng)速度減慢 隨著反應(yīng)時間的推移。隨著反應(yīng)時間的推移。（5 5）經(jīng)濟上不合算）經(jīng)濟上不合算 一次性反應(yīng)后不能再次使用。一次性反應(yīng)后不能再次使用。3. 直接利用微生物酶缺點直接利用微生物酶缺點 上述原因阻礙了微生物酶的應(yīng)用和發(fā)展，上述原因阻礙了微生物酶的應(yīng)用和發(fā)展，6060年代研年代研制固定化酶和固定化菌體。制固定化酶和固定化菌體。（1 1）增加穩(wěn)定性）增加穩(wěn)定性 對熱、對熱、pHpH值、有機溶劑、蛋白質(zhì)變值、有機溶劑、蛋白質(zhì)變 性劑、蛋白質(zhì)分解酶的穩(wěn)定性增加。性劑、蛋白質(zhì)分解酶的穩(wěn)定性增加。

33、（2 2）具有一定的機械強度）具有一定的機械強度 固定化酶裝入酶反應(yīng)器可固定化酶裝入酶反應(yīng)器可實現(xiàn)連續(xù)化、自動化生產(chǎn)。實現(xiàn)連續(xù)化、自動化生產(chǎn)。 （3 3）易回收）易回收 產(chǎn)品中不殘留酶產(chǎn)品中不殘留酶（4 4）提高酶的反應(yīng)速度）提高酶的反應(yīng)速度（5 5）降低生產(chǎn)成本）降低生產(chǎn)成本 能反復(fù)使用。能反復(fù)使用。4. 固定化酶優(yōu)點固定化酶優(yōu)點 二二. . 固定化酶和固定化細(xì)胞的制備固定化酶和固定化細(xì)胞的制備 固定化方法可分為三大類：固定化方法可分為三大類： a. a. 載體結(jié)合法；載體結(jié)合法；b.b.交聯(lián)法；交聯(lián)法；c.c.包埋法。包埋法。 固固定定化化方方法法 載體結(jié)合法載體結(jié)合法交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包

34、埋法吸附法吸附法共價偶聯(lián)法共價偶聯(lián)法格子型格子型雙能團試劑雙能團試劑微型膠囊型微型膠囊型離子鍵離子鍵重氮法重氮法物理吸附物理吸附酶布、酶膜、中空纖維酶布、酶膜、中空纖維肽鍵法肽鍵法烷化法烷化法包埋法包埋法 吸附法吸附法共價偶聯(lián)法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法交聯(lián)法溴溴化化氰氰亞亞氨氨碳碳酸酸基基偶偶聯(lián)聯(lián)法法OHOHBrCNH2OOOC=N-EO-CO-NH-EOHO-C-NH-E NHOHH2N-E（多羥基載體）（多羥基載體）O-CONH2OH（惰性）（惰性）OOC=NH（活潑）（活潑）OC NOH戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 OHC(CH2)3CHO戊二醛戊二醛H2N-EN -HC=N-E-N=CH（CH2）

35、3-CH=N- E-NCHCH包埋法包埋法 以以丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂等材料，與酶聚等材料，與酶聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細(xì)小多孔的網(wǎng)狀格合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細(xì)小多孔的網(wǎng)狀格子中。子中。酶液酶液丙烯酰丙烯酰胺胺N N，N N雙丙烯雙丙烯酰胺酰胺催化劑：四催化劑：四甲基乙二胺甲基乙二胺、明礬胺、明礬胺引聚劑：引聚劑：過硫酸鉀、核黃素過硫酸鉀、核黃素光照光照聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)固定化固定化酶酶切切割割凝膠酶塊凝膠酶塊丙烯酰胺包埋丙烯酰胺包埋三固定化酶的性質(zhì)三固定化酶的性質(zhì)1.1.對底物的特異性。尤其注意立體結(jié)構(gòu)對催化底物特對底物的特異性。尤其注意立體結(jié)構(gòu)對催化底物特異性的影響。異性的影響。2.2.酶反應(yīng)最適酶反應(yīng)最適pHpH值的改變。酶固定化后，酶蛋白質(zhì)的值的改變。酶固定化后，酶蛋白