CTAB法提取植物基因組DNA

1、CTAB 法提取植物基因組DNACTAB 法原理CTAB （Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化銨 ，是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，能與核酸形成復合物，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸的特性。當降低溶 液鹽濃度到一定程度 （0.3 mol/L NaCl ）時，CTAB- 核酸的復合物從溶液中沉淀 ，通過離心就可將其與蛋白，多糖類物質(zhì)分開，在經(jīng)過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)。最后通過乙醇或異丙醇沉淀 DNA ，而 CTAB 溶于乙醇或異丙醇而除去在高離子強度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl) ， CTAB 與蛋白質(zhì)和多

2、聚糖形成復合物， 不能沉淀核酸。 CTAB 溶液在低于 15時會形成沉淀析出 ，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于 15。另外，它還能保護 DNA 不受內(nèi)源核酸酶的降解。主要試劑與溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巰基乙醇氯仿異戊醇（ 241）異丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA無水乙醇CTAB 溶液： CTAB 20g/LNaCl（ 58.44） 1.4 mol/L （81.816g）EDTA （292.25） 10 mmol/L （2.9225g）Tris （121.14） 100 mmol/L （12.114g）pH 8.01× TE

3、 緩沖液： EDTA （292.25） 1 mmol/L （0.29225g）Tris （121.14） 10 mmol/L （ 1.2114g）pH 8.0NaAC 溶液： NaAC （82.03） 3mol/L （246.09g）pH 4.0植物總 DNA 的提取1、取適量甘薯新鮮葉片，用液氮迅速研磨，中間加 PVP（聚乙烯吡咯烷酮 K30）少許，成粉末后轉(zhuǎn)入 10mL 的離心管中，放入液氮或 -80冰箱儲存（在研磨樣品時，研的細和研的粗，提出的 DNA 量可以相差幾倍，所以，在液氮保護的很好的情況下盡量多研磨幾次）。2、將（ 200ml） CTAB 溶液放于 65水浴鍋中預熱。3、加 4

4、ml 巰基乙醇到預熱的 200mlCTAB 中。4、速加 3ml 預熱的 CTAB 到裝有粉末的 10mL 離心管中，之后放入 65水浴鍋中，保溫3060min，期間輕搖數(shù)次 （一般 20min左右一次，剛投入水浴時可以稍快速的晃動， 之后的晃供參考動一定要輕柔）。5、加入 34ml氯仿異戊醇 （24 1）（在通風櫥中操作） ，輕搖混勻至乳白色 （ 100200 次，劇烈晃動會使 DNA 機械切割）。6、1520， 11000 rpm離心 15min（CTAB 配平，相對應的離心管，質(zhì)量相差<0.03g）。7、取上清（ 用剪過的槍頭進行操作，過尖的槍頭會把DNA 鏈弄斷。 ），加 0.6

5、倍體積的異丙醇，搖均（有絮狀物析出，可放入4冰箱過夜）。8、用毛細玻璃管將 DNA 絮狀物挑出（ DNA 絮狀物盡量要挑出，不要離心，因為離心后雖然產(chǎn)量會增大，但是不完整的 DNA 也增多）（或 4， 10000 rpm離心 5min，棄上清），放入新的離心管中，用 70%乙醇漂洗 2次，放置超凈臺中吹干。9、加入 2ml 1×TE緩沖液溶解，可放入 4冰箱保存（酶活性在 4或 65水浴中最低，防止酶降解 DNA ）。10、未溶解的，可放入 65水浴中促其溶解， 10min后拿出冷卻至室溫，可重復，直至溶解。11、加入 2.5ul RNaseA（ RNaseA提前拿出融化），10離心

6、，升至 4000 rpm即停，使 RNaseA 和溶液充分混合。12、37水浴，保溫 1h。13、加入 1ml Tris- 苯酚、 1ml氯仿異戊醇（ 241），搖均配平， 4， 11000 rpm離心10min。14、取上清，加1×TE補至 2ml，加 2ml氯仿異戊醇（ 241）搖均配平， 4，11000 rpm 離心 10min 。15、如仍有白色蛋白質(zhì)沉淀，則重復步驟14。16、取上清，加 0.1倍上清液體積的 NaAC，2.5倍上清液體積的無水乙醇（提前放入 -20 冰箱），搖均，放入 -20冰箱沉淀 30min。17、用毛細玻璃管將 DNA 挑出（或用無水乙醇配平， 4，

7、10000 rpm離心 4min，棄上清），放入新的離心管中，用 70%乙醇漂洗 2次，轉(zhuǎn)入 1.5ml離心管，放置超凈臺中吹干。18、將 DNA溶于適量的 1×TE緩沖液中，短期 4保存，長期 -80冰箱中儲存。19、取少量 DNA 溶液進行瓊脂糖電泳，膠濃度為 0.8%，檢測其完整性。并用紫外分光光度計測其濃度。注解：1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )：是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質(zhì)，有效去除多酚，減少 DNA 中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。2、CTAB ：溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；3、NaCl：提供一個高鹽環(huán)境，使DNA 充分溶解，在于

8、液相中；4、EDTA ：螯合 Mg2+ 或 Mn2+離子，抑制 DNase 活性；5、Tris (pH8.0) ：提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；6、-巰基乙醇：是抗氧化劑 ，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變， 使酚容易去除。7、苯酚： 使蛋白質(zhì)變性， 同時抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與 DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷 ,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。使用酚的優(yōu)點： （1）有效變性蛋白質(zhì)；（2）抑制了 DNase 的降解供參考作用。缺點：（1）能溶解 10-15%的水，從而溶解一部分 poly(A)RNA 。（2）不能

9、完全抑制 RNase 的活性。8、氯仿：克服酚的缺點，加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中） 。9、異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA 的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定?；蚪M DNA 提取常見問題：1、DNA 中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)：重新純化 DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)，重新沉淀 DNA 。2、DNA 在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應：讓酒精充分揮發(fā)，增加 70% 乙醇洗滌的次數(shù) (2-3 次 )3、DNA 中有

10、RNA 的存留：加入RNase降解 RNA 。4、材料不新鮮或反復凍融：盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融，液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液。5、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性：在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA 時，可增加裂解液中螯合劑的含量。6、提取過程操作過于劇烈，DNA 被機械打斷：細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔。7、外源核酸酶污染：所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。8、反復凍融。將DNA 分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融。冰凍材料提出高質(zhì)量的基因組DNA ，應確保以下幾點：1、確保采樣后立即投入液氮中保存。2、在磨樣時一定要一直使材料處于低溫狀態(tài)。研磨前先將液氮倒入研缽，研缽徹底冷卻后，再放入材料，研磨過程中，一定不要讓液氮揮發(fā)凈使材料回溫，否則會 DNA 降解得很厲害。裝管的時