ELISA試劑及溶液配制及試驗步驟

1、ELISA 試劑及溶液配制 包被液： 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 (pH9.6)0.75g碳酸鈉,1.46g碳酸氫鈉，加去離子水定容至500ml。 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)0.2g磷酸二氫鉀，2.90g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml。 抗體稀釋液： 0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100g。 封閉液： 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 (pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100g。 洗滌液： 0.02mol

2、/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20將50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻。 顯色液：TMB過氧化氫尿素溶液A液(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺，TMB)稱取TMB20m溶于10ml無水乙 醇中，完全溶解后，加雙蒸水至 100ml。B液(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4):稱取 NaHPO 12H2O14.34g,檸檬酸1.87g溶于180ml雙蒸水，力卩0.75%過氧化氫尿素 1.28ml，定容至 200ml，調(diào) pH 至 5.0-5.4。將A液和B液按1: l混合后即

3、成TMB過氧化氫尿素應(yīng)用液。 終止液：2mol/L H 2SO溶液10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至100ml，室溫保存。 酶標(biāo)二抗：HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，應(yīng)用時用抗體稀釋液稀釋 3000倍。2.2.6 抗血清的分離采集血液后， 去掉針頭， 緩慢注入已經(jīng)滅菌的三角燒瓶中， 待凝固后用滅菌 滴管將血液沿邊緣剝離，室溫放置 1小時，再放入4°C冰箱過夜(不能冰凍，否 則產(chǎn)生溶血)，使血清充分析出。第二天取出后以 4C 3000r/min離心30min,取 上清，分裝后-20 C保存?zhèn)溆谩?.2.7 間接 ELISA 法檢測家兔抗血清效價(1) 抗原包被用包被液(0.05

4、mol/L的碳酸鹽緩沖液，pH9.6)把抗原稀釋為0.01mg/ml，將 稀釋好的抗原液于每個酶標(biāo)板孔中加入 100卩l(xiāng)。把酶標(biāo)板置入濕盒內(nèi)，于4C包 被過夜。(2) 洗板棄去包被液，用洗滌液加滿所有酶標(biāo)孔，用紗布和衛(wèi)生紙包住扣干。 1 次， 末次將水扣干。(3) 封閉在酶聯(lián)板上每孔加入250卩l(xiāng)封閉液(pH9.6 , 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液含 2.0%BSA,將酶聯(lián)板置于濕盒內(nèi)，4C孵育過夜。也可37C孵育2h。(4) 棄去封閉液，洗滌 1 次同上。(5) 加一抗 ( 家兔抗血清 )將免疫小鼠抗血清10卩l(xiāng)加到990卩l(xiāng)的抗體稀釋液中制成1:100的抗血 清。(于1.5ml的EP管中

5、操作)。給酶標(biāo)板上A行的1號孔加100卩l(xiāng)的1:100 的血清。給酶標(biāo)板上A行的2到12孔各加入抗體稀釋液100卩l(xiāng)，然后給A組 的第二孔加入100卩l(xiāng) 1:100的抗血清，吹吸十次后吸取100卩l(xiāng)的血清加到第三 孔，再吹吸十次取100卩l(xiāng)加到第四孔，依次加到第12孔，最后從第十二孔中吸 出100卩l(xiāng)舍棄。這樣每孔均為100卩l(xiāng)，經(jīng)過11次二倍稀釋，血清稀釋度為 1:204800。B、C行同上操作。給D行的前兩個孔只加入100卩l(xiāng)的抗體稀釋液做為空白對照，3-4孔加入 100卩l(xiāng)稀釋100倍的陰性血，5-6孔不加抗原，只用封閉液封閉，每孔加入100卩l(xiāng)稀釋100倍的抗血清作對照。加完后將酶連板放在濕盒內(nèi)37E孵育1h。(6) 洗滌同上。(7) 加酶標(biāo)二抗各孔加入稀釋倍數(shù)為1:3000的酶標(biāo)二抗(羊抗兔)100卩l(xiāng)，37E濕盒內(nèi)孵 育 1h。(8) 洗滌同上(9) 顯色每孔各加A, B液50 fl l后將酶連板放入濕盒內(nèi)避光