第八章 親和純化技術(shù)

1、親和純化親和純化技術(shù)親和純化技術(shù) 利用生物分子間的利用生物分子間的特特異性結(jié)合作用異性結(jié)合作用的原理的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)稱為化的技術(shù)稱為親和純親和純化技術(shù)化技術(shù)（Affinity Affinity purificationpurification）23技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) （1）找與底物）找與底物專一專一可逆結(jié)合可逆結(jié)合的配基；的配基； （2）將配基通過(guò)）將配基通過(guò)共共價(jià)鍵價(jià)鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；偶聯(lián)到基質(zhì)； （3）配基）配基與與底物底物吸吸附附； （4）洗脫目標(biāo)物。）洗脫目標(biāo)物。 4親和純化技術(shù)親和純化技術(shù) 親和層析親和層析(Affinity chromatography)

2、 (Affinity chromatography) 親和過(guò)濾（膜分離）親和過(guò)濾（膜分離） 親和分配（雙水相萃取）親和分配（雙水相萃?。?親和反膠團(tuán)萃取（反膠團(tuán)萃?。┯H和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃?。?親和沉淀（沉淀）親和沉淀（沉淀） 親和電泳（電泳）親和電泳（電泳）5第一節(jié)第一節(jié) 親和層析親和層析(affinity Chromatography) 利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子的分子專一性可逆結(jié)合專一性可逆結(jié)合的特性而建立的特性而建立的層析技術(shù)。的層析技術(shù)。 適用于從成份復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于適用于從成份復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物。目標(biāo)物的

3、混合物中提純目標(biāo)物。6特點(diǎn)特點(diǎn) 經(jīng)過(guò)一次處理可得到經(jīng)過(guò)一次處理可得到高純度活性高純度活性物質(zhì)物質(zhì) ； 設(shè)備要求不高、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求不高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)、分離速度、分離速度快、分離效果好、分離條件溫和快、分離效果好、分離條件溫和； 親和吸附劑通用性較差，親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑專用的吸附劑。7親和吸附劑：載體親和吸附劑：載體配基配基 在親和層析中起在親和層析中起可逆結(jié)合的特異可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為性物質(zhì)稱為配基配基（Ligand）。）。 與配基結(jié)合的層與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為析介質(zhì)稱為載體載體（Matrix）。）。8一、親和層析的原理一、親和層析的原理 （1）配基固定

4、化配基固定化：配基：配基與與載體載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。特異親和性的分離介質(zhì)。 （2）吸附樣品吸附樣品：親和層：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì)性物質(zhì).（3）樣品解吸樣品解吸：選擇適宜：選擇適宜的條件使被吸附物活性物的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。質(zhì)解吸。9二、親和層析載體二、親和層析載體（一）、親和層析對(duì)載體的要求：（一）、親和層析對(duì)載體的要求： （1）充分）充分功能化功能化，與配基進(jìn)行共價(jià)連接，與配基進(jìn)行共價(jià)連接。 （2）有較好的）有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性理化穩(wěn)定性和生物惰性。 （3）具有高度的）具有高度的水不溶性和親水性水不溶性

5、和親水性。 （4）具有）具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 （5）應(yīng)為）應(yīng)為大小均勻大小均勻的剛性小球。的剛性小球。10（二）、常用載體（二）、常用載體 纖維素纖維素 (cellulose) 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它載體其它載體殼聚糖殼聚糖 (Chitosan)111 1、纖維素、纖維素 纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大、均一性差，不利于大分子的滲入。分子的滲入。 非特異性吸附力較強(qiáng)，非特異性吸附力較強(qiáng)，空間位阻空間位阻。 主要用于主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)分離與核酸有

6、關(guān)的物質(zhì)。 122 2、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 瓊脂糖濃度有瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為，商品為Sepharose 2B、4B和和6B（Pharmacia）。）。 保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快孔徑大，流速快。 Sepharose CL, ,穩(wěn)定性明顯增加，能在穩(wěn)定性明顯增加，能在pH314中應(yīng)用。中應(yīng)用。 13 3 3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠： 葡聚糖凝膠孔徑太小葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應(yīng)用受到限制。應(yīng)用受到限制。 4 4、聚丙烯酰胺凝膠：聚丙烯酰胺凝

7、膠： Bio-gel P 有供化學(xué)反應(yīng)的有供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基酰胺基，能制得配基含量較能制得配基含量較高的親和柱高的親和柱，適用于親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)。，適用于親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)。 pH過(guò)高或過(guò)低的溶液中酰胺基易水解。過(guò)高或過(guò)低的溶液中酰胺基易水解。14 5 5、多孔玻璃珠：多孔玻璃珠： 化學(xué)與物理穩(wěn)定性化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高。較好，機(jī)械強(qiáng)度高。 缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有有非特異性吸附非特異性吸附，化學(xué)活性基團(tuán)少。，化學(xué)活性基團(tuán)少。 6 6、其它載體、其它載體殼聚糖殼聚糖15殼聚糖殼聚糖(甲殼素和殼聚糖甲殼素和殼聚糖)16三三

8、 、 親和配基親和配基 配基的選擇配基的選擇 配基的配基的濃度濃度 配基偶聯(lián)的配基偶聯(lián)的位置位置 配基分子的配基分子的大小大小 配基的配基的類型類型17（一）、配基的選擇（一）、配基的選擇 親和層析配基的選用主要取決于分離對(duì)象。親和層析配基的選用主要取決于分離對(duì)象。 1 1、配基與配體有足夠大的親和力、配基與配體有足夠大的親和力 （親和勢(shì)（親和勢(shì)），），K KL L 在在10-410-8之間之間。 2 2、配基與配體的結(jié)合應(yīng)是專一的、配基與配體的結(jié)合應(yīng)是專一的 。 3 3、配基應(yīng)具有化學(xué)活性、配基應(yīng)具有化學(xué)活性 。18親和勢(shì)親和勢(shì)KL（EL復(fù)合物的解離常數(shù)復(fù)合物的解離常數(shù) ） 19（二）、配基

9、的濃度（二）、配基的濃度 對(duì)親和勢(shì)比較低的時(shí)候（對(duì)親和勢(shì)比較低的時(shí)候（KL10-4mol/L），增加，增加配基濃度配基濃度有利于吸附。有利于吸附。 增加增加親和柱的長(zhǎng)度親和柱的長(zhǎng)度來(lái)提高吸附率。來(lái)提高吸附率。 配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難。 理想的配基濃度為理想的配基濃度為1-10mol/L。20（三）、配基偶聯(lián)的位置（三）、配基偶聯(lián)的位置 配基固定化時(shí)，其配基固定化時(shí)，其不參與親和結(jié)合的不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。 AMP-Sepharose親和柱親和柱 腺嘌呤腺嘌呤N6-氨基氨基接到載體上，對(duì)脫氫接到載體上，對(duì)脫氫酶和甘油激

10、酶有吸附力。酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基磷酸基接到載體上，對(duì)甘油醛接到載體上，對(duì)甘油醛-3-磷磷酸脫氫酶有吸附力。酸脫氫酶有吸附力。21（四）、配基分子的大?。ㄋ模?、配基分子的大小 選用選用大分子配基大分子配基。 甘氨酸甘氨酸 小分子物質(zhì)作為配基小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入，載體和配基間插入一個(gè)一個(gè)“手臂手臂”以消除以消除空間障礙?？臻g障礙。22（五）、配基的類型（五）、配基的類型 較小的有機(jī)分子或天然生物活性物質(zhì)較小的有機(jī)分子或天然生物活性物質(zhì)。 根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì)根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì):特殊配基和通用配基特殊配基和通用配基。 特殊配基特殊配基（special ligandspecia

11、l ligand） 23通用配基（通用配基（general ligand） 用于一類物質(zhì)的分離提純。用于一類物質(zhì)的分離提純。 用用NADH作作脫氫酶脫氫酶類親和層析的通用配基類親和層析的通用配基； 用用ATP作激酶類親和層析的通用配基；作激酶類親和層析的通用配基； 用用外源性凝集素外源性凝集素作作糖蛋白類糖蛋白類親和層析時(shí)的親和層析時(shí)的通用配基等。通用配基等。 24四、四、 載體的活化與偶聯(lián)載體的活化與偶聯(lián) 糖類載體的活化與偶聯(lián)糖類載體的活化與偶聯(lián) 聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)活化與偶聯(lián) 用于固定化配基的凝膠衍生物用于固定化配基的凝膠衍生物 25（一）

12、、糖類載體活化與偶聯(lián)（一）、糖類載體活化與偶聯(lián) 溴化氰溴化氰活化法活化法 高碘酸氧化法高碘酸氧化法 環(huán)氧化法環(huán)氧化法 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 雙功能試劑法雙功能試劑法26（二）、（二）、聚丙烯酰胺凝膠及聚丙烯酰胺凝膠及 其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián) 疊氮化法疊氮化法 重氮化法重氮化法 ( (含氨基載體含氨基載體) ) 碳二亞胺縮合法（含羧基載體）碳二亞胺縮合法（含羧基載體）27五、五、 影響吸附親和力的幾個(gè)因素影響吸附親和力的幾個(gè)因素 K KL L 配基濃度配基濃度對(duì)親和力的影響對(duì)親和力的影響 空間障礙空間障礙的影響的影響 配基與載體的配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)的影響的

13、影響 載體孔徑載體孔徑的影響的影響 微環(huán)境微環(huán)境的影響的影響28（一）、配基濃度對(duì)親和力的影響（一）、配基濃度對(duì)親和力的影響 為將親和配體與其它物質(zhì)分開，需要為將親和配體與其它物質(zhì)分開，需要阻留值阻留值10。 配基濃度配基濃度與與親和對(duì)解離常數(shù)親和對(duì)解離常數(shù)相關(guān)。相關(guān)。 對(duì)于低親和力系統(tǒng)，對(duì)于低親和力系統(tǒng)，配基濃度配基濃度。 29（二）、空間障礙的影響（二）、空間障礙的影響 空間位阻?？臻g位阻。 對(duì)于對(duì)于分子大的配體分子大的配體以及以及小小分子配基分子配基更明顯。更明顯。 “手臂手臂”，增加與載體相，增加與載體相連配基的活動(dòng)度，減輕載連配基的活動(dòng)度，減輕載體的立體障礙。體的立體障礙。 常用的常

14、用的“手臂手臂”多為烴鏈多為烴鏈。 30（三）、配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響（三）、配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響 多肽或蛋白質(zhì)等大分子配基多肽或蛋白質(zhì)等大分子配基 須須控制偶聯(lián)控制偶聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)條件條件，使它以，使它以最少的功能基最少的功能基團(tuán)與載體連接團(tuán)與載體連接。 保持蛋白質(zhì)原有的保持蛋白質(zhì)原有的高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)，使親和吸附劑，使親和吸附劑具有較大的親和力。具有較大的親和力。 31（四）、載體孔徑的影響（四）、載體孔徑的影響 載體孔隙是配體向配基接近的通道。載體孔隙是配體向配基接近的通道。 孔徑大小孔徑大小對(duì)吸附劑親和能力有影響。對(duì)吸附劑親和能力有影響。（五）、微環(huán)境的影響（五）、微環(huán)境的影響

15、載體及載體及“手臂手臂”的的電性、極性電性、極性對(duì)親和力的影響。對(duì)親和力的影響。 避免引入離子鍵的基團(tuán)避免引入離子鍵的基團(tuán)。 疏水作用疏水作用的存在，會(huì)引起的存在，會(huì)引起非特異性吸附非特異性吸附作用。作用。32六、六、 配基與間隔臂的連接配基與間隔臂的連接 （一）、含氮配基的連接（一）、含氮配基的連接 （二）、含羧基配基的連接（二）、含羧基配基的連接 （三）、含巰基配基的連接（三）、含巰基配基的連接 （四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接33七、七、 親和層析的吸附和洗脫親和層析的吸附和洗脫 影響影響吸附吸附的條件的條件 親和層析的親和層析的洗脫洗脫 親和吸附

16、劑的再生親和吸附劑的再生34（一）、影響吸附的條件（一）、影響吸附的條件 親和吸附劑及配體的性質(zhì)親和吸附劑及配體的性質(zhì) 緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH、溫度和層析流速有、溫度和層析流速有關(guān)。關(guān)。 溫度溫度升高會(huì)使吸附作用減弱。升高會(huì)使吸附作用減弱。 流速流速每小時(shí)低于每小時(shí)低于10 ml/cm2。 層析柱用前必須充分平衡。層析柱用前必須充分平衡。 上樣體積上樣體積為柱床體積的為柱床體積的5%。35非專一性吸附非專一性吸附 親和層析中的非專一性吸附。親和層析中的非專一性吸附。 離子效應(yīng)離子效應(yīng) 疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 復(fù)合親和力復(fù)合親和力36離子效應(yīng)離子效應(yīng) 配基與配基與載體載體

17、-間隔臂間隔臂的不完全結(jié)合，將無(wú)的不完全結(jié)合，將無(wú)關(guān)關(guān)離子基團(tuán)引入離子基團(tuán)引入吸附劑。吸附劑。 具有具有離子基團(tuán)離子基團(tuán)的親和吸附劑會(huì)影響蛋白的親和吸附劑會(huì)影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。質(zhì)的洗脫行為。37疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互吸引，形成疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性非專一性吸附吸附。 疏水基團(tuán)：疏水基團(tuán)： （1）長(zhǎng)的烴鏈結(jié)構(gòu)的）長(zhǎng)的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂手臂”： （2）疏水性配基：）疏水性配基：38復(fù)合親和力復(fù)合親和力 離子效應(yīng)離子效應(yīng)作用，又有作用，又有疏水作用疏水作用。 配體與配基有較強(qiáng)生物特異性。配體與配基有較強(qiáng)生物特異性。 用用高濃

18、度的鹽高濃度的鹽和和有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑，以提高選以提高選擇性。擇性。39（二）、親和層析的洗脫（二）、親和層析的洗脫 洗脫：洗脫： 洗脫方法主要有三種：洗脫方法主要有三種： 非專一性洗脫非專一性洗脫 特殊洗脫特殊洗脫 專一性洗脫專一性洗脫40非專一性洗脫非專一性洗脫 改變改變洗脫劑的洗脫劑的pH。 離子強(qiáng)度的離子強(qiáng)度的分步和梯度變化分步和梯度變化. 親和勢(shì)很高，親和勢(shì)很高，促溶離子促溶離子，其洗脫能力的強(qiáng)弱順序，其洗脫能力的強(qiáng)弱順序ClICF3COOSCN CCl3COO。 用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或鹽酸胍鹽酸胍）。）。41特殊洗脫特殊洗脫 裂解配基與載體的連接鍵裂解配基與載

19、體的連接鍵。 斷裂方法有：斷裂方法有： 硫酯鍵硫酯鍵用羥胺處理用羥胺處理30分鐘；分鐘； 偶氮鍵偶氮鍵用用連二亞硫酸鈉連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理硼酸緩沖液處理； 二硫鍵二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇糖醇等處理。等處理。42專一性洗脫專一性洗脫 S（固定化配基），（固定化配基），E（酶），（酶），I（游離配基）（游離配基） （1）競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)）競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即，即ESI不如不如EI穩(wěn)定，穩(wěn)定，增加增加洗脫劑中洗脫劑中I，會(huì)使，會(huì)使E洗脫下來(lái)洗脫下來(lái)（正洗脫）。（正洗脫）。 （2）當(dāng)）當(dāng)ESI穩(wěn)定性與穩(wěn)定性與EI相同時(shí)，相同時(shí)，I的存在并不的存在并不影響影響E對(duì)對(duì)S

20、的結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)。的結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)。 （3 3）反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)）反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即，即ESI比比EI穩(wěn)定，穩(wěn)定，I使使E與與S結(jié)合更緊密結(jié)合更緊密（負(fù)洗脫）（負(fù)洗脫） 。43反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)44親和層析中配基的選擇和洗脫條件親和層析中配基的選擇和洗脫條件 45（三）、親和吸附劑的再生（三）、親和吸附劑的再生 用緩沖液充分用緩沖液充分平衡平衡后即可重復(fù)使用。后即可重復(fù)使用。 親和力下降，非特異吸附增加，大多由親和力下降，非特異吸附增加，大多由變性蛋白變性蛋白沉積造成，用沉積造成，用6mol/L脲脲洗柱。洗柱。46八、其他親和層析八、其他親和層析 金屬金屬離子離子親和層析親和層析 有機(jī)

21、染料親和層析有機(jī)染料親和層析 擬生物親和層析擬生物親和層析（Biomimetic AFCBiomimetic AFC） 47第二節(jié)第二節(jié) 其他親和純化技術(shù)其他親和純化技術(shù) 一、親和過(guò)濾（膜分離）一、親和過(guò)濾（膜分離） 二、親和分配（雙水相萃取）二、親和分配（雙水相萃取） 三、親和反膠團(tuán)萃取（反膠團(tuán)萃?。┤⒂H和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃取） 四、親和沉淀（沉淀分級(jí)）四、親和沉淀（沉淀分級(jí)） 五、親和電泳（電泳）五、親和電泳（電泳）48一、一、 親和過(guò)濾親和過(guò)濾（Affinity FiltrationAffinity Filtration） 將親和層析和膜過(guò)濾技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，包括將親和層析和膜過(guò)濾技術(shù)結(jié)

22、合運(yùn)用，包括親和錯(cuò)流過(guò)濾親和錯(cuò)流過(guò)濾和和親和膜分離親和膜分離。 親和錯(cuò)流過(guò)濾親和錯(cuò)流過(guò)濾（affinity Cross Flow affinity Cross Flow Filtration,ACFFFiltration,ACFF）: : 是將是將親和層析與超親和層析與超濾技術(shù)濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾，兼有親和和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾，兼有親和層析與膜過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)。層析與膜過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)。49親和錯(cuò)流過(guò)濾親和錯(cuò)流過(guò)濾 （affinity Cross Flow Filtrationaffinity Cross Flow Filtra

23、tion） 基質(zhì)基質(zhì)及及大分子親和配基大分子親和配基 基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配基連接在內(nèi)核基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配基連接在內(nèi)核表面。配基對(duì)提取的目標(biāo)物進(jìn)行表面。配基對(duì)提取的目標(biāo)物進(jìn)行專一可逆專一可逆的吸附的吸附，形成，形成復(fù)合體復(fù)合體； 用膜對(duì)混合液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾，用膜對(duì)混合液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾，復(fù)合體因分子巨大復(fù)合體因分子巨大可被保留可被保留，雜質(zhì)隨液體透過(guò)膜，目標(biāo)物與其它成，雜質(zhì)隨液體透過(guò)膜，目標(biāo)物與其它成分分離。分分離。 50基質(zhì)基質(zhì) 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 菌類的完整細(xì)胞菌類的完整細(xì)胞 （酵母酵母、芽胞桿菌、芽胞桿菌、鏈球菌等細(xì)胞）鏈球菌等細(xì)胞） 瓊脂糖、脂質(zhì)體等瓊脂糖、脂質(zhì)體等 酵

24、母細(xì)胞純化伴刀豆球蛋白酵母細(xì)胞純化伴刀豆球蛋白A51親和膜親和膜 （affinity membrane） 親和膜利用親和膜利用親和配基親和配基修飾的修飾的微濾膜微濾膜為親和吸附介質(zhì)為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是固定床親和層析固定床親和層析的變型。的變型。 將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，膜厚為床層高度將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，膜厚為床層高度。 52親和膜優(yōu)點(diǎn)親和膜優(yōu)點(diǎn) 傳質(zhì)阻力小傳質(zhì)阻力小，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短；，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短； 配基利用率高，配基利用率高，配基用量低配基用量低； 壓降小，流速快；壓降小，流速快； 設(shè)備體積小。設(shè)備體積小。53二、親和萃取二

25、、親和萃取 （Affinity extraction） 定義：利用定義：利用偶聯(lián)親和配基的偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚為成相聚合物進(jìn)行的合物進(jìn)行的雙水相萃取雙水相萃取，在親和配基的親，在親和配基的親和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在PEG相（上相（上相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和分配系數(shù)和選擇性選擇性。 PEG/Dextran, PEG/無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽54 mA目標(biāo)分子的親和分配系數(shù)目標(biāo)分子的親和分配系數(shù) T和和B分別表示上相和下相；分別表示上相和下相； mA和和m O為有、無(wú)配基時(shí)目標(biāo)分子的分配系數(shù)；為有、無(wú)配基時(shí)目標(biāo)分子的分配系數(shù)； m L為

26、配基的分配系數(shù)；為配基的分配系數(shù)； CL為配基濃度；為配基濃度； Kd為配基與目標(biāo)分子反應(yīng)的解離常數(shù)。為配基與目標(biāo)分子反應(yīng)的解離常數(shù)。 上相配基濃度上相配基濃度CLT越高，越高，m A越大越大 55親和萃取純化過(guò)程親和萃取純化過(guò)程 親和分配（進(jìn)料），親和分配（進(jìn)料）， 雜蛋白反萃?。ㄇ逑矗╇s蛋白反萃?。ㄇ逑矗?目標(biāo)產(chǎn)物反萃?。ㄏ疵撃繕?biāo)產(chǎn)物反萃取（洗脫）。 56三、親和反膠團(tuán)萃取三、親和反膠團(tuán)萃?。ˋffinity-based reversed micellar extraction） 定義：指在定義：指在反膠團(tuán)反膠團(tuán)相中除通相中除通常的表面活性劑以外，添加常的表面活性劑以外，添加另一種親水另一

27、種親水頭部為親和配基頭部為親和配基的的 助 表 面 活 性 劑助 表 面 活 性 劑 （cosurfactant）；）； 通過(guò)通過(guò)親和配基親和配基與與目標(biāo)分子目標(biāo)分子的的親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在反膠團(tuán)相的分配。物在反膠團(tuán)相的分配。57四、親和沉淀四、親和沉淀 （Affinity precipitation） 親和沉淀親和沉淀: :是是生物親和相互作用生物親和相互作用與與沉淀分離沉淀分離相結(jié)合的生物大分子的分離純化技術(shù)。相結(jié)合的生物大分子的分離純化技術(shù)。 一次作用親和沉淀一次作用親和沉淀 二次作用親和沉淀二次作用親和沉淀58一次作用親和沉淀一次作用親和沉淀 水溶性化合

28、物分子水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的上偶聯(lián)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的親親和配基和配基 雙配基（雙配基（bis-ligand）；多配基（）；多配基（polyligand）。）。 雙配基或多配基雙配基或多配基與含有兩個(gè)以上與含有兩個(gè)以上親和結(jié)合部位親和結(jié)合部位的的多價(jià)蛋白質(zhì)多價(jià)蛋白質(zhì)產(chǎn)生親和交聯(lián)，增大為較大的交聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)生親和交聯(lián)，增大為較大的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)而沉淀。絡(luò)而沉淀。59二次作用親和沉淀二次作用親和沉淀 制備親和沉淀介質(zhì)制備親和沉淀介質(zhì): :利用在利用在物理場(chǎng)物理場(chǎng)改變時(shí)溶解度下改變時(shí)溶解度下降、發(fā)生可逆性沉淀的降、發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物水溶性聚合物為載體為載體固定親固定親和配基。和配基。 親和介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)分子后，通過(guò)親和介