蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)實驗講義

1、 實驗一 蛋白質(zhì)含量分析（Bradford檢測法）一、 實驗?zāi)康?、 制作蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；2、 測定未知蛋白質(zhì)濃度樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白質(zhì)的濃度。二、 實驗原理Bradford法（考馬斯亮藍法）測定蛋白質(zhì)濃度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白質(zhì)快速定量方法。該方法根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計，考馬斯亮藍G-250（CBB G-250）在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-染料結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收，且光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)含量的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍結(jié)合在2m

2、in左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。Bradford法的突出優(yōu)點是：靈敏度高；測定快速、簡便，只需加一種試劑；干擾物質(zhì)少。此法的缺點是：仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物有去污劑、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。三、 試劑與器材1、試劑：1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考馬斯亮藍G-250；無水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。2、器材： 濾紙；燒杯；漏斗；可見分光光度計；試管。四、 實驗方法1、 考馬斯亮藍G-250染料的配置稱100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于47.5 ml 無水乙醇后，再加入100 ml 85%

3、的磷酸，加MiliQ水定容至1 L，過濾備用。2、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的稀釋取10支試管，按表中順序排列，分別加入考馬斯亮藍溶液、水和樣品。每加完一管，立即振蕩混勻（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的編號為8、9、10號管。3、 加完試劑2-5min后，即可用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的吸光值OD595。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇沖洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。4、 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光值OD595為縱坐標(biāo)作圖，即得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得趨勢

4、線以及公式（y=ax+b，其中y為吸光度值OD595，x為蛋白質(zhì)的量，a和b為常量）并給出R2值，R2值越接近1證明曲線越接近實際結(jié)果，根據(jù)此公式及未知樣品的吸光度值，計算每管中加入的未知蛋白的量，進而推算其濃度。5、 本實驗采用的未知樣品為麥曲中糖化酶分離純化實驗所得的粗酶液樣品。五、 實驗結(jié)果記錄 OD595記錄表管號12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（ml）00.010.020.040.060.080.10MiliQ（ml）0.10.090.080.060.040.020考馬斯亮藍G-250溶液（ml）5555555555每管中蛋白質(zhì)的量（mg）00.010.020.040.060.080

5、.10光吸收值（OD595）未知蛋白濃度（mg/ml） 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線： R2值： 實驗二、糖化酶酶活測定一、實驗?zāi)康?、了解糖化酶酶活力單位的定義、測定原理；2、掌握糖化酶酶活測定的方法。二、實驗原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計算出酶活力。1 g固體酶粉（或1 ml液體酶），于40，pH=4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖，即為一個酶活力單位，以U/g或U/ml表示。三、試劑與器材1、試劑乙酸-乙酸鈉緩沖液(

6、0.05 M，pH=4.6); 0.05 M硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液；0.1M碘溶液；200 g/L NaOH溶液；0.1M NaOH溶液；2 M 硫酸溶液；20 g/L可溶性淀粉溶液（現(xiàn)配）。2、器材恒溫水浴鍋；秒表；比色管；碘量瓶，滴定管。四、實驗方法1、糖化酶反應(yīng)階段：于甲、乙兩支50 ml比色管中，分別加入25 ml可溶性淀粉溶液（20 g/L）及5 ml乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.05 M，pH=4.6)，搖勻后于40 水浴鍋中預(yù)熱5 min。在甲管中加入待測酶液2 ml，立刻搖勻，在此溫度下反應(yīng)30 min，兩管中立即加入200 g/L 氫氧化鈉溶液0.2 ml，搖勻，終止反應(yīng)，迅速取出冷卻

7、，并于乙管（空白）中補加待測酶液2 ml。2、碘量法測定葡萄糖含量階段：吸取上述反應(yīng)液與空白液各5 ml，分別置于碘量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1M碘溶液10 ml，再加入0.1M氫氧化鈉溶液15 ml，邊加邊搖勻，密塞，于暗處靜置反應(yīng)15 min，取出，加2 M硫酸溶液2 ml。3、 滴定階段：上述反應(yīng)液立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至藍色剛好消失呈無色，即為其終點。注：不同稀釋倍數(shù)，應(yīng)做相應(yīng)的空白試驗。4、 酶活力計算40、pH4.6下，1小時水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為1個酶活單位。X=（A-B）×c×90.05×32.2/5×1/2

8、15;n×2 =579.9×（A-B）×c×n （A-B）在3-6 ml為宜式中：X-樣品的酶活力， u/ml； A-空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml； B-樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml； c-硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度； 90.05-與1 ml硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)钠咸烟堑馁|(zhì)量（以克表示）; 32.2-反應(yīng)液的總體積，ml； 5-吸取反應(yīng)液的體積，ml； 1/2-吸取酶液2 ml，以1ml計； n-酶稀釋倍數(shù)； 2-反應(yīng)30min，換算成1h的酶活力系數(shù)。 所得的結(jié)果表示至整數(shù)；平行試驗相對誤差不得超過2%。五、實驗結(jié)果記錄待測酶液的糖

9、化酶酶活分析稀釋倍數(shù) n滴定所用的硫代硫酸鈉溶液的體積（ml）A（乙管）B1（甲管）B2（甲管）（AB平均值）樣品的酶活力（U/ml） 實驗三、紹興黃酒麥曲中糖化酶的分離純化一、實驗?zāi)康?、熟悉蛋白質(zhì)的分離純化基本步驟，加深對相關(guān)知識的理解；2、增強綜合實驗的設(shè)計、協(xié)調(diào)能力；3、掌握蛋白質(zhì)純化各基本實驗操作技能。二、實驗原理離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團，這些基團在水溶液中能與溶液中的其他陽離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，但在層析柱上進行時，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進行，直至完全。因此可以

10、把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來。同理，當(dāng)一定量的溶液通過交換柱時，由于溶液中的離子不斷被交換而波度逐漸減少，因此可以全部被交換 并吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，被洗脫的能力則取決于各自洗反應(yīng)的平衡常數(shù)。蛋白質(zhì)的離子交換過程有兩個階段-吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可以通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而達到解離而更多的是通過增加離子強度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質(zhì)與離子交換劑解開。不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間的形成電鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個洗

11、脫下來，達到分離純化的目的。凝膠層析又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析等。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，其內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小組分的樣品進入凝膠層析住后，各組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能夠擴散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出；而分子大小介于兩者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們的分子大小，所以它們流出的時間介于兩者之

12、間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。三、試劑和器材1、試劑麥曲，0.5%NaCl，硫酸銨，DEAE-纖維素，Sephadex G-75，40 mM磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0）。2、器材燒杯，磁力攪拌器，轉(zhuǎn)子，水浴鍋，層析柱，橡皮管，夾子。四、實驗方法1、粗酶液的制備將麥曲樣本以1:3加入0.5%NaCl溶液中，于30 浸提4h，濾紙過濾，濾液即為粗酶液G1，并量取初始粗酶液體積V1。2、硫酸銨沉淀粗酶液G1上清液中緩慢加入硫酸銨至10%飽和度，4 靜置1 h，1,0000×

13、g 離心15 min以除去部分雜質(zhì)蛋白，收集上清。上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨至70%飽和度，4 靜置1 h，1,0000×g 離心15 min，棄上清，收集沉淀。向離心管中加入少量（約3 ml）40 mM 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中，輕輕搖晃，使沉淀復(fù)溶，裝入透析袋中，置于40 mM 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中，4 透析攪拌過夜，以脫去酶液中的大量硫酸銨，期間更換兩次透析液。最終獲得粗酶液G2，并量取體積V2。附透析袋處理方法：將透析袋于沸水中煮5 min后用清水洗凈，扎緊下口，檢查不漏水后，將硫酸銨沉淀復(fù)溶后的粗分離酶液全部裝入透析袋中，排除空氣，扎

14、緊上口。注意：透析袋要預(yù)留空間，因透析時酶液體積會變大。3、 DEAE-纖維素離子交換柱層析純化糖化酶DEAE-纖維素的工作pH范圍為pH2-9，采取增加離子強度的方式進行洗脫，由于無梯度混合器，因此采取直接更換洗脫液，氯化鈉濃度從0 M增加到1 M，洗脫液體積為200 ml。（1）DEAE-纖維素的預(yù)處理DEAE-纖維素以干態(tài)形式出售，使用前用蒸餾水充分溶脹，加熱能加快其溶脹。DEAE-纖維素在使用前的清洗：先用0.5 M NaOH浸泡半小時，除去堿液，用蒸餾水將交換劑洗至中性，再用0.5 M HCl浸泡半小時，然后洗至中性，再用用0.5 M NaOH浸泡半小時，最后洗至中性即可。（2）裝柱

15、用緩沖液將層析柱底部死空間內(nèi)的空氣排空。預(yù)處理的離子交換劑放置在燒杯中，使得交換劑：上清液（V/V）=2:2，輕微攪拌混勻，利用玻璃棒引流，盡可能一次性將交換級傾入層析柱，注意液體應(yīng)沿著柱內(nèi)壁流下。當(dāng)需要往柱內(nèi)補加交換劑時，應(yīng)將沉降表面輕輕攪起，然后再次傾入，防止再次傾注時產(chǎn)生界面，再對裝柱情況進行檢查，利用透過光檢查柱床是否規(guī)整，是否有氣泡或界面存在。（3）柱子的平衡調(diào)整恒流泵速度為1.0 ml/min （20.0 rpm）,用 40 mM 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0）平衡1.5-2個床體積 （約120 min），至基線平穩(wěn)。（4）加樣：目標(biāo)蛋白的吸附量不應(yīng)超過柱子有效交換容量的

16、10-20%。加樣方法：進樣器或注射器。加樣量為3 ml，手動加樣。具體操作方法如下：旋開層析柱上口，用膠頭滴管吸去床上層洗脫液至距床面0cm（液面相切），關(guān)閉柱出口，用膠頭滴管吸取一定體積樣品溶液貼內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)緩緩加入，加樣完畢后，打開柱出口，讓樣品緩緩滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時，按同樣方法小心加入幾ml洗脫液沖洗內(nèi)壁，并使緩沖液高出凝膠床3-5cm，旋緊層析柱上口，開啟恒流泵進行洗脫。（5）目標(biāo)蛋白的吸附和雜蛋白的去除：用1.5-2倍床體積的起始緩沖液洗去未吸附物質(zhì)（約120min），直至紫外記錄曲線回到基線。吸附時調(diào)整檢測器的靈敏度為0.2A，電腦記錄的滿屏?xí)r間為120mi

17、n，滿屏量程為20mV。注意：長時間將蛋白質(zhì)吸附在離子交換柱上再洗脫會造成洗脫困難，這是由于長時間的吸附引發(fā)蛋白質(zhì)的構(gòu)象緩慢改變，與交換劑結(jié)合更為牢固，并且這種構(gòu)象變化一般都會造成蛋白質(zhì)活性下降。（6）目標(biāo)蛋白的洗脫：采用改變離子強度的方法，保持洗脫液pH不變，將氯化鈉濃度從0 mol/l直接增至0.5 mol/l進行類似的梯度洗脫，洗脫液體積為200ml，做好出峰組分的收集（每3min收集一管），并根據(jù)酶活測定來判斷目的組分。洗脫時調(diào)整檢測器的靈敏度為0.2A，電腦記錄的滿屏?xí)r間為120min，滿屏量程為80-100mV。酶活最高的收集管為G3，體積為V3。（7）離子交換劑的清洗、再生和貯存

18、：繼續(xù)洗脫至基線平穩(wěn)后，換用起始緩沖液平衡3-4個床體積。（實驗結(jié)束后DEAE-纖維素的清洗/再生：先用0.5mol/l的NaOH浸泡半小時，除去堿液，用蒸餾水將纖維素洗至中性，再用0.5mol/l的HCl浸泡半小時，然后洗至中性，再用0.5mol/l的NaOH浸泡半小時，最后洗至中性即可。）（8）酶活和蛋白質(zhì)含量的測定：測定幾個出峰處所對應(yīng)收集管的酶活和蛋白質(zhì)含量，將酶活最高且出峰最高的收集管留樣為，量取體積為V3。4、 Sephadex G-75柱層析進一步純化糖化酶（1）凝膠的制備稱取Sephadex G-75粉末適量，加2倍體積的雙蒸水浸泡，置于水浴鍋中加熱至100 ，保持溫度1h，將

19、溶膠懸浮，冷卻至室溫抽真空以排除氣泡，待其沉降后以傾瀉法除去上層懸浮顆粒，如有則反復(fù)傾倒去除，直至上清液不再混濁為止。（2）裝柱取洗凈的內(nèi)徑18 mm，長為490 mm的層析柱，管底內(nèi)部放置一層絲網(wǎng)，將層析柱垂直，關(guān)閉出水口，加入少量40 mM磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0），然后將已溶脹好的凝膠連續(xù)緩慢地從上口加入層析柱中，待凝膠沉積1-2 cm后，打開出水口，使凝膠自然沉降。用肉眼觀察凝膠柱應(yīng)沒有紋路、均勻、無氣泡。如達不到要求，需重新裝柱。（3）平衡調(diào)整恒流泵的流速為1.0 ml/min，凝膠床用洗脫液（40 mM磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，pH6.0）平衡，約2個柱體積，需時約80

20、 min。（4）加樣先吸去床面上層多余的平衡液，留約2-3mm，關(guān)閉柱出口，將樣品粗酶液G3貼著柱的內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)緩慢加入，打開柱出口，流速為1.0 ml/min，讓樣品滲入凝膠床內(nèi)。（5）洗脫用平衡緩沖液進行層析，流速為1.0 ml/min，并收集洗脫液，每3 min收集一管。洗脫時應(yīng)調(diào)整檢測器的靈敏度為0.2 A，電腦記錄的滿屏?xí)r間為60 min，滿屏量程為20 mV。酶活最高的收集管即為純酶液G4，量取其體積V4。（6）柱的再生和保存柱的清晰和再生采用洗脫液平衡即可。保存：凝膠洗脫后，脫水干燥，將干膠浸泡在50%乙醇脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度，至以95%脫水抽干，再經(jīng)乙醚脫水，60 烘干瓶

21、裝保存。五、實驗結(jié)果記錄1、純化過程中各步的酶活分析記錄純化步驟各步體積（mL）稀釋倍數(shù)nNa2S2O3溶液AB（mL）酶活力（/mL）總酶活（）初始粗酶液G1V1透析酶液G2V2離子交換純化G3V3凝膠過濾純化G4V42、純化過程中各步的蛋白質(zhì)含量分析記錄純化步驟稀釋倍數(shù)nOD595蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）蛋白質(zhì)含量（mg）初始粗酶液G1透析酶液G2離子交換純化G3凝膠過濾純化G43、純化過程中各步的蛋白質(zhì)電泳圖譜4、根據(jù)所得結(jié)果計算填寫下表（第二組）： 含量 步 驟蛋白質(zhì)含量（mg）總酶活（U）比酶活（U/mg）回收率（%）總純化倍數(shù)初始粗酶液G1透析酶液G2離子交換純化G3凝膠過濾純化G

22、4 實驗四、SDS-PAGE電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量一、 實驗?zāi)康?、 學(xué)習(xí)SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理；2、 掌握垂直板電泳的操作方法。二、 實驗原理SDS-PAGE電泳是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引入SDS（十二烷基磺酸鈉）。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負點的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然電荷差異。由于SD

23、S與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按照重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15kD-200kD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式： logMW=k-bX ；式中MW為蛋白質(zhì)分子量，X為相對遷移率，k與b為常數(shù)。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。三、 試劑和器材1、試劑低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker （97.4, 66.2, 43, 31, 20.1, 14.4 kD）; 30% 丙烯酰胺； 10% SDS; 1.5 M Tris-HC

24、l （pH 8.8）；1 M Tris-HCl （pH 6.8）；10% 過硫酸銨（AP）（現(xiàn)用現(xiàn)配）；TEMED（四甲基乙二胺）；上樣緩沖液（SDS 100 mg，巰基乙醇 0.1 ml，甘油 2g， 1.5 M Tris-HCl （pH 8.8）600 ul；定容至10ml）；染色液（考馬斯亮藍R-250 0.25g，冰醋酸50 ml；乙醇200ml，定容至500ml，過濾后備用）；脫色液（乙醇300 ml，冰醋酸 100 ml，定容至1L）；電泳緩沖液（Tris 6 g，甘氨酸 28.8 g，SDS 1 g, 加水定容至1 L）。2、器材垂直板電泳裝置；直流穩(wěn)壓電源；10 ul移液器。四、 實驗方法1、 將玻璃板在灌膠支架上固定好。2、 配置分離膠（12 %）水1.8 ml30% 丙烯酰胺2.4 ml1.5 M Tris-HCl （pH8.8）1.5 ml10% SDS