水稻TWH基因RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

1、水稻twh基因rnai載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化摘要：根據(jù)r n a i表達(dá)載體的設(shè)計原則，以t wh基因 為靶基因，將長度2 5 3 b p目的片段通過正反兩個方向 插入表達(dá)載體p r 1 3 0 1中，構(gòu)建rna i表達(dá)載體p r 13 0 1-twho通過根癌農(nóng)桿菌e ha 1 0 5介導(dǎo)法將 其導(dǎo)入水稻品種武育粳3號，獲得3 4株陽性轉(zhuǎn)基因植株， 為進(jìn)一步深入研究twh基因功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：水稻(oryza sativa l. )； twh基因；r n a i ( r n a interference)；載體構(gòu)建; 遺傳轉(zhuǎn)化中圖分類號：s 5 1 1 ； q 7 8 1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：a文

2、章編號：0439- 8 114 ( 2 0 12) 24 5791-03r n a 干涉(r n a interference, r na i )是指內(nèi)源性或外源性雙鏈rna ( d o u b 1 e- stranded r n a, d s r n a)介導(dǎo)的同源mr na發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默從而產(chǎn)生相應(yīng) 的功能表型的缺失現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。rn a i是在研究秀麗新小桿線蟲中被首次發(fā)現(xiàn)1 ,利用這 一技術(shù)可以有效、特異性降解靶標(biāo)基因mrna,阻止靶標(biāo) 基因的表達(dá)，從而研究目標(biāo)基因的功能。目前，水稻中已有許多利用rna i技術(shù)進(jìn)行基因功能 分析或驗證的報道2 4

3、。從水稻育種后代材料中發(fā)現(xiàn) 一個水稻穎殼扭曲突變體，該突變體主要表現(xiàn)為穎殼扭曲變 形，子粒充實(shí)不飽滿5。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，該突 變體穎殼扭曲性狀受一對隱性基因控制，其對應(yīng)的twh基 因被精細(xì)定位在第二染色體的s s r標(biāo)記rm l 2 5和r m l 3 5之間，兩個ss r標(biāo)記間的物理距離為11.9 k b,并確定了其候選基因。該研究通過構(gòu)建水稻twh基 因的rna i表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌e ha 1 0 5介導(dǎo) 法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳3號中，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植 株，為t wh基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1 . 1試劑1 . 2載體及菌株1 . 3植物材料和遺傳轉(zhuǎn)化方法供

4、試水稻材料為武育粳3號成熟種子誘導(dǎo)初生愈傷組 織，作為與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受體材料。水稻的組織培養(yǎng)、 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻以及抗性愈傷組織的篩選與植株再生 等參照劉巧泉等6建立的高效轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。1 . 4 pcr引物設(shè)計及目的片段擴(kuò)增1 . 5目的片段的克隆將目的片段切下，通過膠回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物并 純化后連接到p md 1 8-t載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh 5 a感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含10 0 mg/ l氨節(jié)青霉素的x -g a 1 / i p t g的le固體培養(yǎng)基上，3 7 °c培養(yǎng)過 夜，挑取白色單菌落于含100 mg/l氨節(jié)青霉素的l b液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，通過菌落p

5、c r篩選陽性克隆， 獲得重組載體pmd 1 8-t-twh，將陽性克隆送南京 金斯瑞生物科技有限公司測序。16 rna i表達(dá)載體的構(gòu)建7轉(zhuǎn)基因植株的p c r檢測2結(jié)果與分析 21 rna i表達(dá)載體構(gòu)建 2. 2水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得以武育粳3號成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌e ha 1 0 5介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體 p r 1 3 0 1 -t wh導(dǎo)入水稻中。經(jīng)潮霉素抗性篩選，選 擇生長旺盛的抗性愈傷組織進(jìn)行分化再生培養(yǎng)，最終獲得40株to代轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)基因植株葉片總dn a為模板,用潮霉素基因特異引物p 7與p 8進(jìn)行p c r檢測（圖5）,共有3

6、 4株檢測到5 1 7 bp左右的目標(biāo)片段，p c r陽 性率為8 5 %。3小結(jié)與討論1）雖然rna干涉在作用機(jī)制等方面還不十分清楚，但作為一種新的技術(shù)方法，已經(jīng)在各個不同的生物研究中被廣泛應(yīng)用。應(yīng)用rna干涉技術(shù)迅速地抑制目的基因的表 達(dá)，能盡快了解到目的基因的功能。該研究將構(gòu)建的表達(dá)載 體p r 1 3 0 1 -twh導(dǎo)入水稻愈傷組織中，獲得了陽性 轉(zhuǎn)基因植株，下一步計劃將轉(zhuǎn)基因苗移栽到海南試驗基地， 抽穗后進(jìn)行表型鑒定和表達(dá)分析，研究twh基因的功能。2）載體設(shè)計是載體構(gòu)建的關(guān)鍵。由于rna i機(jī)制只對成熟的mrna產(chǎn)生作用，因此用于設(shè)計rna干涉載體 的靶序列應(yīng)處于基因的一個外顯子

7、內(nèi)。wesley等7 的研究表明rna i片段的長度在988 5 3 nt之 間都是可行的，不會對沉默效率產(chǎn)生明顯影響；同時將間隔 區(qū)內(nèi)含子插入反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。因此，在 本研究中我們選擇t wh基因一個外顯子部分的2 5 3 bp為靶序列構(gòu)建rna i載體，并在兩個反向重復(fù)序列間 加入一個waxy基因的內(nèi)含子作為間隔區(qū)，目的是為了提 高轉(zhuǎn)基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表達(dá)。參考文獻(xiàn)：1firea, xuq, montgomerynetnature,2：chenj ,tangw h,h ongmm,e ta 1o s b p 73,ari cegene,encodesa

8、n ov e 16 9)： 8 0 6 - 8 1 1.dna binding1htp r o t e i n wo m a i n andgenrferencee d r n a igrowth j .antr biology,(3 )：3prasadk,jayraghavan u doub 1 e s t randed r n ainterference o f a rice p i / g l 0 p a r a 1 o g ,0 s m a d s 2 , u n covers i t s s econdwho r 1 s p e c i f i c function i n flor

9、al organ patterning j genet i c s , 2 0 0 3, 1 6 5 ( 4 )： 2301-2305 4 xiao h, wang y, l i u d, e t al. functional analysis o f the rice a p 3 homo 1 ogueosmads16 b y r n a interfere nee j plant molecular b i ology, 2 0 0 3, 5 2 ( 5 )： 9 5 7 9 6 6 5 l i j b, xia my, wanb l, e t al. gene tic a n a 1 y s1san dm appi ng0ft wh genei nr ic etw istedhull m utantjl.r1cesc1e nc e , 2 0 0 9,1 6 ( 1 )： 7 9 - 8 2 6 劉巧泉，張景六.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立j .植物生理學(xué)報，1 9 9 8,2 4 ( 3 )： 259-2717 wesley s v, hell i we l l c a, smith n a, e t al c o n s tru