阿魏酸酯酶酶化發(fā)酵飼料制備及其對肉雞養(yǎng)分利用率的影響

1、阿魏酸酯酶酶化發(fā)酵飼料制備及其對肉雞養(yǎng)分利用率的影響王林林，陳云華，陳培欽，李夏蘭收稿日期：2014- - ；通訊作者：李夏蘭(1965-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物化工研究，E-mail: xialan基金項目：福建省發(fā)改委投資項目（2013-886）；廈門市集美區(qū)科技計劃項目（2024C 01）。 (華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021)摘要：為了降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料轉(zhuǎn)化率，研究阿魏酸酯酶酶化發(fā)酵飼料的制備，并研究了該酶化發(fā)酵飼料對肉雞養(yǎng)分利用率的影響。通過正交實驗得到發(fā)酵飼料較優(yōu)配方：菌柄干物質(zhì)12%、玉米蛋白飼料26%、棕櫚仁粕11%、谷殼粉為16%、瓜

2、爾豆粕5%、玉米粉5%、糖蜜3、益生劑1，其發(fā)酵飼料中粗蛋白含量為22.48%；相對于基礎(chǔ)日糧，酶化發(fā)酵飼料對肉雞的干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維及酸性洗滌木質(zhì)素的利用率分別提高5.59 %、38.31%、10.36%、16.52 %、29.25%、18.99%，且肉雞對酶化發(fā)酵飼料養(yǎng)分利用率比普通發(fā)酵飼料高。關(guān)鍵詞： 阿魏酸酯酶；發(fā)酵飼料；抗?fàn)I養(yǎng)因子；養(yǎng)分利用率中圖分類號：Q 55 文獻標(biāo)志碼：APreparation of ferulic acid esterase enzymatic fermented feed and its impact on the nutri

3、ent utilization of broilers WANG Lin-lin, CHEN Yun-hua,CHEN Pei-qin, LI Xia-lan(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen, 361021, China)Abstract： In order to reduce the antinutritional factors existed in feed, promote feed conversion ratio, ferulic acid esterase enzymatic fermente

4、d feed was studied and the effect of this enzymic fermented feed on nutrient utilization of broilers was researched at the same time.The optimum feed formula obtained by orthogonal experiments:12% stipe dry matter,26% corn gluten feed,11% palm kernel meal,16% chaff powder,5% guar soybean meal,5% cor

5、n flour,3 molasses,1 prebiotic agent,the content of crude protein in this fermented feed was 22.48% under this condition.Compared with basal diet, enzymatic fermented feed increased feed nutrient utilization such as dry matter, crude ash,crude protein, neutral detergent fiber, acid detergent fiber,

6、acid detergent lignin utilization by 5.59%,38.31%,10.36%,16.52%,29.25%,18.99%,respectively.And the feed nutrient utilization of broilers raised by enzymatic fermented feed was higher than those raised by common fermented feed.Key Words： Feruloyl esterases; Fermented feed;antinutritional factors ;nut

7、rient utilization 在家禽飼養(yǎng)上，玉米是主要的能量飼料，隨著我國養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模迅速發(fā)展，對飼料原料的需求日益遞增，這就促使人們將工農(nóng)業(yè)的廢棄物，如麥糟，蘋果渣，菌糠做為玉米的替代品。但當(dāng)這類飼料原料在家禽日糧中含量過多時，往往會造成飼料利用率差、家禽生長不良以及環(huán)境污染等問題，從而限制了這類飼料原料在家禽日糧中的廣泛應(yīng)用1。這主要是與木質(zhì)纖維原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子非淀粉多糖（non-starch polysaccharides，簡稱NSP）有關(guān)2。NSP增加消化道食糜粘性，影響消化道生理及形態(tài)，影響腸道菌群，從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，降低飼料的轉(zhuǎn)化率3。降解飼料中NSP的方法很多，對木

8、質(zhì)纖維含量高的飼料原料進行酶化或發(fā)酵是常用的方法。發(fā)酵飼料可提高飼料的適口性，產(chǎn)生大量的活性益生菌，調(diào)節(jié)畜禽機體胃腸道益生菌平衡，并提高消化酶活性，促進飼料的消化、吸收和利用5。聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶等在飼料中的應(yīng)用報道較多6,7，但是關(guān)于阿魏酸酯酶（EC 3，feruloyl esterase，簡稱FAE）在飼料中的應(yīng)用報道較少。課題組研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AE與木聚糖酶存在協(xié)同作用，能提高麥糟中阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid，簡稱FA）及低聚木糖（xylooligosaccharides，簡稱XOS）的釋放量，有利于麥糟的降解。在優(yōu)化的工藝條件下，木聚

9、糖酶和FAE共同作用植物細(xì)胞壁，F(xiàn)A釋放量最高可達0.97mg/g （干麥糟），XOS的釋放量為161 mg/g （干麥糟）8。課題組將有關(guān)FAE的研究成果應(yīng)用于飼料中，提高國內(nèi)商品飼料酶降解抗?fàn)I養(yǎng)因子的效率，又產(chǎn)生兩種對動物具有生理活性且無毒安全的FA和XOS。本文報道了FAE酶化發(fā)酵飼料的制備，及肉雞飼喂FAE酶化發(fā)酵飼料時其養(yǎng)分利用率的研究結(jié)果。1材料與實驗方法1.1 實驗設(shè)計選用20日齡黃腳麻雞，實驗前稱重，將肉雞分為4組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)9只雞。實驗組1為對照組（基礎(chǔ)日糧中添加10%菌柄），實驗組2為基礎(chǔ)日糧中添加10%普通發(fā)酵飼料（僅添加益生菌劑發(fā)酵），實驗組3為基礎(chǔ)日糧中添

10、加10%FAE酶化飼料（僅添加FAE酶化） ，實驗組4為基礎(chǔ)日糧中添加10%酶化發(fā)酵飼料（添加益生菌劑發(fā)酵及FAE酶化）。采用地面平養(yǎng)方式飼養(yǎng)，全天光照，每天飼喂3次，自由采食、飲水，定時對雞舍進行消毒清掃（每周兩次），實驗時間為25 d，按正常肉雞免疫程序進行免疫。肉雞基礎(chǔ)日糧標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T33-2004 雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中肉雞營養(yǎng)需要配制9，見表1。表1 肉雞基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)原料Ingredients含量Content %營養(yǎng)水平 Nutrient le

11、vels含量Content%玉米corn 56.30代謝能ME（MJ/kg）2)12.34豆粕Bean pulp20.00粗蛋白CP19.00次粉Wheat middling5.00鈣Ca0.95麥麩Wheat bran7.00總磷TP0.63大豆油Soybean oil1.70有效磷AP0.44玉米蛋白粉Corn protein meal5.00賴氨酸Lys1.00預(yù)混料Premix1)5.00蛋氨酸+胱氨酸Met + Cys0.80合計Total100.00蘇氨酸Thr0.68色氨酸Try0.181）預(yù)混料為福建廈門百穗行科技有限公司提供。Premix was provided by Xi

12、amen Baisuihang Technology Co. Ltd 2）代謝能為計算值。ME was a calculated value。1.2實驗材料1.2.1主要器材：酵母粉，英國OXOID公司；麥糟，廈門青島啤酒廠；麥麩，廈門海嘉面粉有限公司；蛋白胨，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；葡萄糖，廣東汕頭西隴化工廠；硫酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，廣東汕頭市西隴化工廠；鹽酸，上海試劑二廠。超濾膜包Vivaflow 200（MWCO 30 KD），北京賽多利斯儀器有限公司；發(fā)酵袋，鄭州百益寶生物科技有限公司。1.2.2 發(fā)酵飼料原料及益生劑玉米蛋白飼料，山東濱州海星飼料廠；瓜爾豆粕，廣饒

13、六合化工有限公司；棕櫚仁粕，大連鎂達國際貿(mào)易有限公司；預(yù)混料，廈門百穗行科技有限公司；寶來利來發(fā)酵劑，山東寶來利來生物工程公司；杏鮑菇菌柄，福建嘉勝集團大建飼料有限公司提供。1.2.3 雞苗黃腳麻雞，廈門五顯鎮(zhèn)三秀種禽廠。1.2.4 肉雞喂養(yǎng)實驗地點和時間廈門集美區(qū)仙靈旗農(nóng)莊，實驗時間為2013年4月-5月。1.3實驗方法1.3.1 FAE粗酶液的制備 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件（1）菌種：黑曲霉，實驗室自行篩選并保藏。（2）培養(yǎng)基成分：種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，36，200 rpm/min培養(yǎng)2 d10。發(fā)酵培養(yǎng)基：麥糟曬干粉碎過100目篩，麥麩烘干粉碎過100目篩，麥糟、麥麩以1:

14、4比例加入白瓷盤中并按1:1.5比例添加營養(yǎng)鹽溶液，混勻，121滅菌30 min，接種1.5 mL菌液，36培養(yǎng)6 d。營養(yǎng)鹽溶液：蛋白胨2 g，酵母粉4 g，NaH2PO4·2H2O 1.52 g，KH2PO4 1 g，CaCl2 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Na2HPO4·12H2O 31.4 g，Na2HPO4·2H2O 15.6 g，用蒸餾水定容至1 L。 制備方法 發(fā)酵料中加入8倍體積的蒸餾水，33，180 r/min中抽提2.5 h，靜置，用八層紗布過濾，得濾液。濾液在進口壓力為0.1 MPa、流速為200 m

15、L/min及20下超濾濃縮，得粗酶液。1.3.2 粗蛋白含量測定按GBT 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法分析11。1.3.3 粗灰分含量測定 按GB/T 6438-2007 飼料中粗灰分的測定分析12。1.3.4發(fā)酵飼料感官鑒定發(fā)酵飼料感官品質(zhì)根據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧業(yè)研究所提出的飼料感觀品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)評定13。1.3.5中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，簡稱NDF）按GBT 20806-2006 飼料中中性洗滌纖維的測定分析14；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，簡稱ADF）按NY_T 14

16、59-2007飼料中酸性洗滌纖維的測定分析15；酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，簡稱ADL）按GBT 20805-2006飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的測定分析16。1.3.6發(fā)酵飼料制備 將發(fā)酵原料、益生劑、FAE粗酶液及糖蜜，攪拌均勻，裝入發(fā)酵袋中，每袋質(zhì)量為1000g，室溫自然發(fā)酵7 d，定時采樣檢測。1.3.7發(fā)酵飼料配方的優(yōu)化選用發(fā)酵飼料中的四因素（菌柄、玉米蛋白飼料、棕櫚仁粕、谷殼粉），各因素選擇三水平，根據(jù)正交實驗表設(shè)計實驗。以發(fā)酵7 d的總蛋白為目標(biāo)函數(shù)進行極差R分析，確定優(yōu)化配方。 1.3.8 養(yǎng)分利用率測定挑選生長狀況良好、重量相近的肉雞作為實驗對象，每

17、組5個平行，每個平行3只，定時喂養(yǎng)相應(yīng)飼料，自由飲水。采用四分法進行全糞收集，稱重后按每100 g鮮樣加10%硫酸10 mL和0.5 mL甲醛溶液，密封袋口，4冷存，收集41-45日齡肉雞的排泄物，挑出雜物后65烘干后，室溫回潮24 h，粉碎過65目。測定原料和排泄物中粗蛋白、粗灰分、干物質(zhì)、NDF、ADF、ADL含量，計算養(yǎng)分利用率。實驗結(jié)果采用SPSS 19.0軟件的ANOVA進行方差分析，Duncan法進行多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SE）表示。2.實驗結(jié)果與討論2.1發(fā)酵飼料配方優(yōu)化2.1.2發(fā)酵配方優(yōu)化實驗 正交實驗設(shè)計表及其實驗結(jié)果見表格1。表

18、2正交實驗設(shè)計及結(jié)果Tab2 The result of orthogonal experiment實驗號(Test number ）項目（Items）(%)A菌柄干物質(zhì)Dry matter of stipeB玉米蛋白飼料Corn gluten feedC棕櫚仁粕Palm kernel mealD谷殼粉Chaff powder四種物質(zhì)比例 Proportion of four substances粗蛋白含量 Content of crude protein110208165421.012102311186221.873102614207021.404112011206217.775112314

19、166421.95611268186321.797122014186422.17812238206321.679122611166522.4821.4320.4821.4921.8120.5021.8320.7122.1122.2721.8922.010.28R1.771.411.301.83經(jīng)極差R分析，發(fā)酵原料中菌柄干物質(zhì)、玉米蛋白飼料、棕櫚仁粕、谷殼粉四因素對發(fā)酵效果的影響大小為谷殼粉菌柄干物質(zhì)玉米蛋白飼料棕櫚仁粕，說明谷殼粉的添加量是影響飼料發(fā)酵的關(guān)鍵因素。在實驗結(jié)果測定中，粗蛋白量最高的組合為第9實驗組：12%菌腳干物質(zhì)，26%玉米蛋白飼料，11%棕櫚仁粕、16%谷殼粉，其發(fā)酵飼料粗

20、蛋白含量相對最高，為22.48%。2.1.3飼料感官評定對表2中的各實驗組的飼料進行感官評定，結(jié)果見表3。表3正交實驗中各組飼料感官評定Tab3 The sensory evaluation of feeds實驗組Experimental group發(fā)酵天數(shù)Fermentation time123456789第1d Day1氣味Odor酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡顏色Color淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色第2d Day2氣味Odor酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡顏色Color淡黃變暗淡黃變暗淡黃變暗淡

21、黃變暗淡黃變暗淡黃變暗淡黃變暗淡黃變暗淡黃變暗第3d Day3氣味Odor酒味重酒味重酒味重酒味重酒味重酒味重酒味重酒味重酒味重顏色Color淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色第4d Day4氣味Odor酒味濃重酒味濃重酒味濃重酒味濃重酒味濃重酒味濃重酒味濃重酒味淡酒味淡顏色Color淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色淡黃色褐色金黃色淡黃色第5d Day5氣味Odor酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡酸味較淡香味淡酸味香味淡香味淡顏色Color淡黃色淡黃色淡黃色褐色黃褐色淡黃色褐色金黃色金黃色第6d Day6氣味Odor酒味酒味淡酒味淡酒味淡酒味淡香味淡酸味香味淡酒味淡顏色Col

22、or淡黃色淡黃色淡黃色褐色淡黃色金黃色褐色金黃色金黃色第7d Day7氣味Odor酒味淡酒味淡酒味淡酸味較淡酒味淡酒味淡酸味較重香味淡香味淡顏色Color淡黃色淡黃色淡黃色褐色淡黃色亮黃色深褐色金黃色金黃色在發(fā)酵第7 d，第8組和第9組飼料顏色呈金黃色，且有淡香氣味，發(fā)酵飼料感觀較好。其中酸味可能是產(chǎn)生酸性物質(zhì)如乳酸等物質(zhì)，香味可能是產(chǎn)生了如酯類、酚類等物質(zhì)，酒味是由于發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。結(jié)合2.1.2實驗結(jié)果，選用第9組為發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化的結(jié)果。2.2發(fā)酵飼料對肉雞養(yǎng)分利用率的影響2.2.1發(fā)酵飼料對物質(zhì)利用率影響發(fā)酵飼料對NDF利用率的影響圖1發(fā)酵飼料對NDF利用率的影響Fig.1

23、 Effect of fermented feed on NDFs utilization 由圖1表明，四個實驗組中NDF利用率都呈上升趨勢，但酶化發(fā)酵飼料中NDF利用率最大，肉雞第45日齡達到37.41%，效果最明顯；其次為普通發(fā)酵飼料和FAE酶化飼料，分別為36.9%、34.79%，而基礎(chǔ)日糧利用率最小為31.3%。這是因為酶化發(fā)酵飼料中含有益生菌分泌的木聚糖酶和FAE，共同促進NDF的降解，而其他組飼料只有單獨添加的益生菌或者是FAE，導(dǎo)致木聚糖酶和FAE的協(xié)同作用弱，導(dǎo)致NDF利用率不如酶化發(fā)酵飼料。發(fā)酵飼料對ADF利用率的影響圖2發(fā)酵飼料對ADF利用率的影響Fig.2

24、Effect of fermented feed on ADFs utilization圖2表明，ADF利用率均有提升趨勢，酶化發(fā)酵飼料、普通發(fā)酵飼料、FAE酶化飼料及基礎(chǔ)日糧中ADF利用率在肉雞45日齡分別為52.85、50.12%、42.56%及42.3%?；A(chǔ)日糧中由于未有益生菌和FAE，導(dǎo)致測得ADF的利用率與其他三組相比最低。發(fā)酵飼料對ADL利用率的影響圖3發(fā)酵飼料對ADL利用率的影響Fig.3 Effect of fermented feed on ADLs utilization圖3表明，四個實驗組ADL利用率均有提升趨勢，肉雞第45日齡，酶化發(fā)酵飼料中ADL利用率

25、最高達63.87%，基礎(chǔ)日糧利用率最低為53.59%。FAE能夠協(xié)同益生菌產(chǎn)生的木質(zhì)纖維降解酶降解木質(zhì)纖維，降低ADL含量。發(fā)酵飼料對粗蛋白利用率的影響圖4發(fā)酵飼料對蛋白質(zhì)利用率的影響Fig.4 Effect of fermented feed on crude proteins utilization圖4表明，四個實驗組都提高粗蛋白利用率，在第45日齡肉雞中酶化發(fā)酵飼料中粗蛋白利用率最高為70.21%，表明該組肉雞對粗蛋白吸收較好，其次為普通發(fā)酵飼料和FAE酶化飼料，分別為66.07%、64.50%；而基礎(chǔ)日糧利用率最小為63.70%。由于酶化發(fā)酵飼料中含有的益生菌分泌的蛋白酶

26、，且發(fā)酵過程產(chǎn)生了低聚木糖，低聚木糖又有利于益生菌的增殖，使得粗蛋白更易被肉雞利用。2.2.2發(fā)酵飼料的養(yǎng)分利用率按四分法取若干飼料樣品和糞便樣品，經(jīng)處理后，測定各養(yǎng)分利用率，結(jié)果如表4。表4各飼料養(yǎng)分利用率的實驗結(jié)果Tab4 Fermented feed on the impact of nutrient utilization指標(biāo)Items組 別groups基礎(chǔ)日糧Basal dietFAE酶化飼料FAE enzymatic feed普通發(fā)酵飼料Common fermented feed酶化發(fā)酵飼料Enzymatic fermented feed干物質(zhì)（%）71.04b±2.02

27、73.61ab±0.672.31ab±1.875.01a±0.92粗蛋白（%）63.70c±0.9267.07b±3.4164.60c±0.8770.30a±1.22粗灰分（%）15.40c±0.8918.70b±1.3216.70c±0.4521.30a±1.3NDF（%）31.30b±2.4435.5ab±0.933.70ab±0.436.47a±2.7ADF（%）40.00b±1.849.00a±2.0041.40b&#

28、177;1.551.70a±0.3ADL（%）53.70d±1.1359.00b±0.8055.90c±0.8563.90a±1.42同一行所列數(shù)據(jù)，小寫字母完全不同者為差異顯著（P<0.05），大寫字母完全不同者為差異極顯著(P<0.01)。從表4可知，與基礎(chǔ)日糧相比，F(xiàn)AE酶化飼料、普通發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料均有提高干物質(zhì)利用率的趨勢，分別提高了3.62%、1.79%、5.59 %，效果較為明顯，差異顯著(P<0.05）；而對于粗灰分，F(xiàn)AE酶化飼料、普通發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料相對于基礎(chǔ)日糧提高21.43%，8.44%，3

29、8.31%，差異顯著（P<0.05）；粗蛋白利用率方面，F(xiàn)AE酶化飼料、普通發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料則分別提高了5.29 %、1.41 %、10.36%，差異顯著（P<0.05），本實驗結(jié)果與楊道秀等17將FAE及商品飼料酶“溢多酶”（主要含木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶等）添加入飼料中，試制酶化飼料飼喂肉雞的結(jié)果類似，但本實驗結(jié)果因發(fā)酵過程產(chǎn)生蛋白酶，其粗蛋白利用相對較高。由表4可知，F(xiàn)AE酶化飼料、普通發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料均能提高NDF的利用率，與基礎(chǔ)日糧相比分別提高了13.42%，7.67 %，16.52 %，差異顯著（P<0.05）；添加FAE酶化飼料，普通發(fā)酵飼料和酶化

30、發(fā)酵飼料均能提高ADF的利用率，與基礎(chǔ)日糧相比分別提高了22.5 %，3.50%，29.25%，差異顯著（P<0.05）。在利用ADL中，F(xiàn)AE酶化飼料、普通發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料與基礎(chǔ)日糧相比，分別提高了9.87%、4.09%、18.99%，差異顯著（P<0.05）。可見酶化發(fā)酵飼料中的FAE和益生菌分泌的NSP降解酶能較好的提高木質(zhì)纖維的利用率，提高飼料品質(zhì)，促進肉雞對養(yǎng)分的利用18, 19。與楊道秀等17的實驗結(jié)果相比較，NDF、ADF及ADL利用率更高，可能原因是楊道秀等添加的僅是木聚糖酶為主的酶制劑，其他的木質(zhì)纖維酶酶活較低，而本實驗中添加了益生菌劑，分泌的木質(zhì)纖維降解酶

31、酶系更為豐富所致。3 小結(jié)（1）發(fā)酵飼料的優(yōu)化發(fā)酵配方為：杏鮑菇菌柄的干物質(zhì)含量為12%、玉米蛋白飼料含量為26%，棕櫚仁粕含量為11%，谷殼粉含量為16%；玉米粉5%，糖蜜3、益生劑1，其發(fā)酵飼料中粗蛋白含量為22.48%。飼料為金黃色，有香味，評價良好。（2）相對基礎(chǔ)日糧，發(fā)酵飼料及酶化飼料均能提高干物質(zhì)，粗灰分，粗蛋白，NDF，ADF，ADL等利用率，而酶化發(fā)酵飼料提高得最為明顯，分別提升為5.59 %，38.31%，10.36%，16.52 %，29.25%，18.99%。酶化發(fā)酵飼料對肉雞的養(yǎng)分利用率促進效果最好。參考文獻 （Reference):1 陸文清, 胡起源. 微生物發(fā)酵飼

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